产淀粉酶芽孢杆菌分离与酶活力测定
浙江师范大学微生物实验报告 产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定吴月婷摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。
关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。
其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。
α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。
芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。
芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。
例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。
此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。
笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料业和食品生产中的发开应用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。
1.2 培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。
土壤中产淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶活力测定
土壤中产淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶活力测定（3,5-二硝酸水杨酸显色法）实验目的：测定土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的淀粉酶活性实验原理：酶活性的测定是通过测定一定量的酶在一定时间内催化得到的麦芽糖的量来实现的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原生成硝基氨基水杨酸的显色基团，将其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。
常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。
然后利用同样的原理测得两种淀粉酶的总活性。
实验器材及试剂：高速离心机、分光光度计实验步骤：(1) 粗酶液制备：以一环菌种接种于发酵培养基中，摇床培养，160rpm/min，37℃，48h。
4000rpm/min 李鑫20min，收集上清液即为待测粗酶液；(2) 1mg/ml标准麦芽糖的制备：准确称量100mg麦芽糖，用蒸馏水准确定容到100ml；(3) 3,5-二硝基水杨酸试剂的制备：准确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水定容到100mL，盖紧瓶塞，备用；(4）0.1mlo/L pH5.6的柠檬酸缓冲液的制备准确称取4.62g柠檬酸和17.05g柠檬酸钠，用蒸馏水定容到800mL；（5）1%淀粉溶液的制备准确称取1g淀粉于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸盐缓冲液中；（6）标准曲线的绘制表3 标准曲线制作表1 2 3 4 5 6 70 0.2 0.6 1 1.4 1.8 2麦芽糖标准液（mL）蒸馏水（mL） 2 1.8 1.4 1 0.6 0.2 0麦芽糖含量/mg 0 0.2 0.6 1 1.4 1.8 21.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.53,5-二硝基水杨酸（ml）标准样液配置按上表配制完成，摇匀，置沸水浴中煮沸10min。
取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离和鉴定王磊;陈宇飞;杨柳【摘要】从土壤中分离筛选出产淀粉酶的菌株,经淀粉培养基初筛后,采用DNS法对发酵提取的粗酶液进行总酶活和α-淀粉酶活力的测定,通过形态观察和生理生化反应对筛出的菌株进行鉴定.结果表明:分离到4株产淀粉酶芽孢杆菌,测得其透明圈直径与菌落直径比值在1.7~3.5之间,其中有2株菌株产淀粉酶能力较高,总酶活达到19.760 U/mL和15.432 U/mL;4株芽孢杆菌所产α-淀粉酶酶活在6.4U/mL~10.4 U/mL之间.经鉴定,1株为枯草芽孢杆菌,3株为蜡样芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能力优于蜡样芽孢杆菌.%The amylase-producing strains were isolated from soil. After initially screening by starch culture medium, the DNS method was used to determine the total enzyme activity andα-amylase activity of the crude enzyme solution by fermentation extraction. The screened strains were identified through morphological observa-tion and physiological and biochemical reactions. Results showed that:four strains of amylase-producing Bacil-lus were isolated. The ratio of hydrolysis zone diameter to colony diameter was 1.7-3.5. Two strains of them had high amylase-producing activity, which the total enzyme activity reached 19.760 U/mL and 15.432 U/mL. Theα-amylase activity of four strains of Bacillus was 6.4 U/mL~10.4 U/mL. The four strains of Bacillus were authen-ticated that one was Bacillus subtilis, the other three were Bacillus cereus. The ability to produce amylase of Bacillus subtilis was superior to Bacillus cereus.【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】4页(P175-178)【关键词】芽孢杆菌;淀粉酶;分离;鉴定【作者】王磊;陈宇飞;杨柳【作者单位】吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507;吉林工商学院食品工程学院,吉林长春130507【正文语种】中文淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，是最早实现工业化生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。
实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。
2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。
3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。
4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。
适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。
一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。
5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。
可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。
6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。
7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。
一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。
根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。
8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。
可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。
9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。
实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。
2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。
3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。
4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。
5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。
总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定.
自然界中产淀粉酶菌株分离纯化及酶活测定淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和葡萄糖的酶的总称。
淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1, 4-葡聚糖，水解α-1, 4-糖苷键的酶。
根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与β-淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2. ）。
α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1, 4-葡聚糖链。
主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。
淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。
如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。
随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。
生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。
70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。
研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1, 2]。
除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。
Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp．，Strepiococcus boris，Bacillus circulans，Chalara paradoxa等菌种均有产淀粉酶能力。
产淀粉酶芽孢杆菌的筛选和分离
碘 原 液 ： １ ｇ 碘 化 钾 ２ ｇ 加 水 定 容 至 碘 ｌ， ２，
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（ ａｉｕ） Ｂ ｃｌｓ 中能 产 生淀粉 酶 的菌 种较 多 ； 次 ， 孢 ｌ 其 芽
杆菌 属产 的 淀 粉 酶 有 较 好 的应 用 价 值 ， 凝 结 芽 如
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作 者简 介 ： 琛 （ ９４ ） 男 ， 苏 启 东 人 ， 教 徐 １８一 ， 江 助
总第 １７ ４ 期
释 至 １ ～。 ０
齐鲁师范学 院学报
终点 ， 录时 间 即为液 化 时间 。 记
取 ２０． １ 菌 悬 液 涂 布 于 筛 选 培 养 基 上 ， ０１ ０ ￣ Ｌ ３ ℃培 养 ２ ｈ ７ ４ 。在 菌落 周 围滴加 卢 戈 氏 碘液 ， 察 观 菌 落 周 围是 否 出现 透 明水 解 圈 ， 测 定 菌 落 及 水 并
第２ ６卷
第 ５期
齐 鲁 师 范 学 院 学 报
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２１ ０ １年 １ ０月
产 淀 粉 酶 芽 孢 杆 菌 的筛 选 和分 离
徐 琛
关键词 ： 芽孢 杆 菌 ； 粉 酶 ； 选 淀 筛
落 形 态观 察 、 兰 氏染 色和 芽孢 染 色初 步 鉴 定 这 ２株 菌株 为 芽孢 杆 菌属 。 革
中图分 类号 ：９ ９ ９ Ｑ ３ ．
土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定教案
土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定13级生技426摘要本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌学手册鉴定其种属。
实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。
最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。
关键词：淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定一、引言芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧，产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。
多为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。
由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体。
因此，在工、农业生产上有较高的应用价值。
菌体杆状，直或接近直，0.3 – 2.2X1.2 – 7.0微米。
多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子。
在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。
暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。
革兰氏反应为阳性，仅在生长早期为阳性、阴性。
有机体化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。
在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种中可以用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶，严格好养或兼性厌氧。
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制造业淀、粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。
淀粉酶家族包括α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
二、实验目的1．了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3．掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；4．培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；5．对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；6．从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定生物11.1魏凡棣 37实验目的：对可产生淀粉酶的芽孢杆菌进行分离的测定实验原理：1.传代培养：从土壤中提取微生物，经过一段时间的培养就会大量滋生形成菌落，不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态构造上也有许多明显的反应，而为了保存某种已经获得的菌株，一般采用低温（4摄氏度）抑制微生物的生长，使其保留活性。
2.细胞染色：微生物细胞在碱性，中性及弱酸性溶液中通常带负电，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
而革兰氏染色则首先用草酸铵结晶紫进行初染，使所有细菌都着结晶紫的蓝紫色；后用卢戈氏碘液媒染增强染料在菌体中滞留能力；后用95%乙醇脱色，由于细胞构造不同革兰氏阴性细菌中碘—结晶紫易洗脱，而经过复染后又被番红染成红色。
3.在显微镜下测定芽孢杆菌的大小：目镜测微尺是一块可放入接目镜内圆形小玻片。
有精准刻度，使用时放入接目镜中隔板上，用以测量经放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，其代表实际长度也不同。
因此，使用前必须校正，以求出在该倍数下每小格所代表的相对长度，后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞实际大小4.芽孢杆菌对淀粉的水解：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质水解才能被吸收利用。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精双糖和单糖。
5.温度对芽孢杆菌生长影响的测定：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。
而不同类型的微生物对温度的适应能力也有所差别。
实验器材：高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨 NaCl 蒸馏水土样试管培养皿移液管涂布器酒精灯显微镜革兰氏染液载玻片显微镜测微尺二甲苯擦镜纸淀粉‘实验步骤：一、芽孢杆菌的分离纯化：1.取合适量的牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水按一定比例配成牛肉膏蛋白胨培养基。
调整PH至7.4到7.6。
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产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法
注明：蓝色字体是已修改的
一、实验目的
1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；
2、掌握测定酶活力的方法；
3、培养自行设计、实施实验的能力。
二、实验原理
1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。
待实验前取样即可。
2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。
在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。
3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。
4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
三、实验材料
1、土壤样品
湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。
2、培养基
淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml
种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml
发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸
氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养
条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml
3、试剂
草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液
4、玻璃器皿
锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）
10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：
天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培
养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种
环等
四、实验步骤
1、样本采集
①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。
②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。
在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。
在37℃摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。
在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。
3、初筛
将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到10-6，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。
取出培养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。
4、划线分离
从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。
将于种子培养基上划线后，再将培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。
5、镜检
挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌
落是否为芽孢杆菌。
6、纯培养
镜检确认为芽孢杆菌后，挑菌置斜面培养基（种子培养基）上进行培养。
将斜面培养基放入37℃培养箱中培养24小时。
7、发酵培养
从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株在无菌操作下转移到发酵培养基上进行发酵。
发酵的条件为37摄氏度，200r/min摇床培养过夜,24h.。
7、酶活测定
将发酵液8000r/min离心10min，取上清液测酶活，每个样品重复3次，最后结果取平均值。
取5mL0.5%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10分钟，然后加适当稀释的酶液0.5mL，反应5分钟后，用5mL0.1mol/L三氯乙酸终止反应。
取0.5mL反应液与5mL碘液显色，在620nm处测光吸收值。
以0.5mL 水代替0.5mL反应液为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照。
五、酶活力计算
酶活力根据下式计算：
酶活力（u/mL）=（R-r）*50*D
R
式中R、r分别表示对照和反应液的光吸收值，D为酶的稀释倍数。
调整D使（R-r）/R在0.2—0.7之间。
确定在40℃5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。