荧光定量实验报告(作业)
荧光定量pcr实习报告
荧光定量pcr实习报告英文回答：Fluorescent quantitative PCR, also known as real-time PCR, is a powerful technique used to measure the amount of DNA or RNA in a sample. It is widely used in various fields such as molecular biology, genetics, and medical diagnostics. The key advantage of fluorescent quantitative PCR is its ability to provide real-time monitoring of the amplification process, allowing for accurate quantification of the target nucleic acid.The principle of fluorescent quantitative PCR involves the use of fluorescent probes or dyes that emit fluorescence when bound to the amplified DNA or RNA. There are several types of fluorescent probes commonly used in real-time PCR, including TaqMan probes, SYBR Green, and molecular beacons. These probes or dyes are designed to specifically bind to the target sequence, and their fluorescence intensity is directly proportional to theamount of target nucleic acid present in the sample.To perform a fluorescent quantitative PCR, a thermal cycler machine is used, which can rapidly change the temperature of the reaction mixture. The PCR reaction mixture contains the target DNA or RNA, primers that specifically bind to the target sequence, fluorescent probes or dyes, and the enzyme Taq DNA polymerase. The reaction mixture is subjected to a series of temperature cycles, including denaturation, annealing, and extension. The denaturation step separates the DNA strands, while the annealing step allows the primers to bind to the target sequence. The extension step involves the synthesis of new DNA strands by the Taq DNA polymerase enzyme.During the amplification process, the fluorescence emitted by the probes or dyes is detected by a fluorescence detector in the thermal cycler machine. The fluorescence intensity is recorded at each temperature cycle, allowing for the real-time monitoring of the amplification process. The amount of target nucleic acid in the sample can be determined by comparing the fluorescence intensity with astandard curve generated using known concentrations of the target nucleic acid.Fluorescent quantitative PCR has numerous applicationsin research and diagnostics. It can be used to quantifygene expression levels, detect genetic mutations, identify pathogens, and measure viral load in clinical samples. The technique is highly sensitive, specific, and reproducible, making it a valuable tool in molecular biology.中文回答：荧光定量PCR，也称为实时PCR，是一种用于测量样品中DNA或RNA数量的强大技术。
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告摘要：荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种通过扩增和定量DNA的方法。
本实验的目的是利用荧光定量PCR技术，对给定的DNA样品进行定量检测，并比较不同浓度的模板DNA的扩增情况。
实验结果表明，荧光定量PCR是一种快速、准确、高灵敏度的定量PCR方法。
引言：荧光定量PCR技术是PCR技术的一种发展，并且在分子生物学中得到广泛应用。
它可以实时监测PCR扩增反应中DNA的扩增情况，因此被广泛用于基因表达检测、基因拷贝数检测、病原体检测等领域。
在这个实验中，我们将利用荧光定量PCR技术检测给定DNA样品的浓度并比较不同浓度的模板DNA的扩增情况。
材料与方法：1.实验材料：（1）实验电脑：配备实时荧光定量PCR软件的计算机。
（2）实验试剂：-PCR反应混合液：包含DNA模板、引物、荧光染料、酶等。
- 模板DNA：浓度为10 ng/μL的DNA样品。
-引物：用于扩增目标DNA的引物。
-荧光染料：用于实时检测PCR扩增过程中的DNA量。
（3）实验仪器：实时荧光定量PCR仪。
2.实验步骤：（1）制备PCR反应混合液，包括DNA模板、引物、荧光染料和酶。
（2）将PCR反应混合液分装到PCR试管中。
（3）将不同浓度的模板DNA分别加入PCR试管中。
（4）使用实时荧光定量PCR仪将PCR试管放入仪器中，进行PCR扩增反应。
（5）实时监测PCR扩增过程中的荧光信号，并记录荧光信号的变化。
结果与讨论：本实验中，我们选取了不同浓度的模板DNA样品并进行PCR扩增反应。
实时荧光定量PCR仪可以实时监测PCR反应中的荧光信号，并根据荧光信号的强度来定量PCR扩增产物的量。
实验结果显示，荧光信号随着PCR反应的进行逐渐增强，并且荧光信号的强度与模板DNA的浓度呈正相关关系。
通过测量荧光信号的强度，我们可以计算出不同浓度的模板DNA的扩增产物的量，进一步定量DNA样本的浓度。
实时荧光定量pcr实验报告
由于Ct值是反映实际PCR反映进程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的阻碍，因此利用Ct值判定的起始模板拷贝数加倍精准，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判定扩增产物的多少，从而间接的判定起始拷贝量，这种方式的精准度不高、重复性也不行。 以下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反映体系、相同的反映protocol、相同的样品起始浓度），能够看到Ct值具有专门好的重复性，而终点的荧光信号强度不同达到300个单位。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下1XXrpm 离心10分钟。现在离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
为了使实验最终取得的Ct值之间具有可比性，必需进行归一化的处置：1，对各样品进行
细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后取得的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。 相对定量
实验报告荧光分析实验
实验报告荧光分析实验实验报告：荧光分析实验一、实验目的本次荧光分析实验的主要目的是通过对样品的荧光特性进行研究，掌握荧光分析的基本原理和实验方法，学会使用荧光分光光度计测量物质的荧光强度，并利用所得数据进行定性和定量分析。
二、实验原理荧光是一种光致发光现象，当物质分子吸收了一定波长的光能后，其电子从基态跃迁到激发态，然后通过无辐射跃迁或辐射跃迁回到基态，在这个过程中，如果以光的形式释放出能量，就产生了荧光。
荧光强度与物质的浓度、荧光量子产率、激发光强度以及仪器的检测效率等因素有关。
在一定条件下，荧光强度与物质的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
三、实验仪器与试剂1、仪器荧光分光光度计比色皿移液枪容量瓶2、试剂标准荧光物质（如硫酸奎宁）待测样品去离子水四、实验步骤1、仪器准备打开荧光分光光度计，预热 30 分钟。
设定仪器参数，如激发波长、发射波长、狭缝宽度等。
2、标准溶液的配制准确称取一定量的标准荧光物质，用去离子水溶解并定容，配制成一系列不同浓度的标准溶液。
3、绘制标准曲线分别将不同浓度的标准溶液放入比色皿中，在设定的条件下测量其荧光强度。
以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4、待测样品的处理与测量对待测样品进行适当的预处理（如稀释、过滤等）。
将处理后的待测样品放入比色皿中，测量其荧光强度。
5、数据处理与结果分析根据标准曲线和待测样品的荧光强度，计算待测样品中荧光物质的浓度。
五、实验数据与处理1、标准溶液浓度与荧光强度数据｜标准溶液浓度（μg/mL）｜荧光强度|｜｜｜｜10|＿____|｜20|＿____|｜30|＿____|｜40|＿____|｜50|＿____|2、以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
3、待测样品的荧光强度为_____，根据标准曲线计算出待测样品中荧光物质的浓度为_____。
六、实验误差分析1、仪器误差荧光分光光度计的精度和稳定性可能会对实验结果产生影响。
荧光检测实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光检测的基本原理和实验方法。
2. 熟悉荧光光度计的操作步骤和注意事项。
3. 学习如何通过荧光光谱分析物质的性质和浓度。
4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理荧光检测是利用物质在特定波长光照射下，吸收光能后发射出特定波长光的现象。
当分子吸收光子后，外层电子从基态跃迁到激发态，激发态的分子不稳定，会通过辐射跃迁的方式返回基态，同时发射出与激发光波长不同的光辐射，即荧光。
本实验采用荧光光度计对样品进行检测，通过测量激发光谱和发射光谱，可以确定样品的荧光特性，进而对样品进行定性和定量分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光度计、紫外-可见分光光度计、比色皿、移液器、烧杯、蒸馏水等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、罗丹明B样品溶液、无水乙醇、氢氧化钠溶液等。
四、实验步骤1. 样品制备：将罗丹明B标准溶液和罗丹明B样品溶液分别用无水乙醇稀释至一定浓度，制备成待测溶液。
2. 激发光谱测定：a. 将待测溶液置于比色皿中，放入荧光光度计样品室。
b. 设置激发光谱扫描范围和步长，进行激发光谱扫描。
c. 记录激发光谱曲线。
3. 发射光谱测定：a. 将待测溶液置于比色皿中，放入荧光光度计样品室。
b. 设置发射光谱扫描范围和步长，进行发射光谱扫描。
c. 记录发射光谱曲线。
4. 数据分析：a. 利用Origin软件对激发光谱和发射光谱进行拟合处理，得到最佳激发波长和发射波长。
b. 根据罗丹明B标准溶液的浓度和荧光强度，绘制标准曲线。
c. 利用标准曲线对罗丹明B样品溶液进行定量分析。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱和发射光谱：通过实验得到罗丹明B标准溶液和样品溶液的激发光谱和发射光谱。
激发光谱表明，罗丹明B在530 nm左右有较强的激发峰；发射光谱表明，罗丹明B在590 nm左右有较强的发射峰。
2. 标准曲线：根据罗丹明B标准溶液的浓度和荧光强度，绘制标准曲线。
线性回归分析结果显示，罗丹明B的浓度与荧光强度呈线性关系，相关系数R²为0.998。
荧光定量pcr实习报告
荧光定量pcr实习报告英文回答：Fluorescent quantitative PCR (qPCR) is a powerful technique used to amplify and quantify specific DNA sequences. It is widely used in various fields including molecular biology, genetics, and medical diagnostics. In this internship report, I will discuss the principles, procedures, and applications of qPCR.The principle of qPCR is based on the polymerase chain reaction (PCR) technique, which amplifies DNA sequences. However, unlike conventional PCR, qPCR allows for the real-time monitoring of DNA amplification using fluorescent dyes or probes. The fluorescence intensity is directly proportional to the amount of DNA present in the reaction.The procedure of qPCR involves several steps. Firstly, DNA is extracted from the sample of interest. Then,specific primers and fluorescent probes are designed totarget the DNA sequence of interest. These primers and probes are added to the qPCR reaction mixture, along with the extracted DNA, DNA polymerase, and other necessary components.The qPCR reaction mixture is then subjected to a series of temperature cycles. These cycles include denaturation, annealing, and extension steps. During the denaturation step, the DNA strands are separated into single strands. In the annealing step, the primers and probes bind to their complementary DNA sequences. Finally, in the extension step, the DNA polymerase synthesizes new DNA strands using the primers as templates.As the qPCR reaction progresses, the fluorescence intensity increases proportionally to the amount of DNA being amplified. The real-time monitoring of fluorescence allows for the quantification of the initial amount of DNA present in the sample. This information can be used to determine gene expression levels, detect pathogens, or identify genetic mutations.In conclusion, qPCR is a valuable technique for amplifying and quantifying DNA sequences. It offers real-time monitoring of DNA amplification and provides accurate and sensitive results. Its applications are diverse and include gene expression analysis, pathogen detection, and genetic mutation identification.中文回答：荧光定量PCR（qPCR）是一种用于扩增和定量特定DNA序列的强大技术。
荧光定量pcr实验小结
荧光定量pcr实验小结荧光定量 PCR 实验小结荧光定量 PCR（Quantitative Realtime PCR，qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，用于定量检测特定核酸序列的含量。
在经历了多次荧光定量 PCR 实验后，我积累了不少经验，也遇到了一些问题，在此进行一个小结。
一、实验原理荧光定量 PCR 的基本原理是在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
在 PCR 反应过程中，随着产物的增加，荧光信号也会相应增强。
通过检测荧光信号的变化，可以确定 PCR 反应的起始拷贝数。
二、实验准备1、试剂和耗材选择高质量的 PCR 引物和探针，确保其特异性和有效性。
准备合适的 PCR 反应缓冲液、dNTPs、Taq 酶等试剂。
使用无菌、无核酸酶污染的离心管、移液器吸头和 PCR 板。
2、样本制备提取高质量的核酸样本，如 DNA 或 RNA，并确保其纯度和完整性。
对 RNA 样本进行反转录，得到 cDNA 用于后续的 PCR 反应。
3、仪器设备荧光定量 PCR 仪，需要提前进行校准和维护，确保其性能稳定。
三、实验步骤1、反应体系配制根据实验要求，计算并配制合适体积的 PCR 反应体系。
将各组分依次加入离心管中，充分混匀，避免产生气泡。
2、加样使用移液器将反应体系准确地加入到 PCR 板的各个孔中。
加入待测样本和标准品，注意更换移液器吸头，防止交叉污染。
3、上机运行将 PCR 板放入荧光定量 PCR 仪中，设置好反应程序和参数。
启动仪器，开始进行 PCR 反应，并实时监测荧光信号。
四、实验中的关键环节1、引物和探针设计引物和探针的设计直接影响实验的特异性和灵敏度。
要选择合适的序列，避免引物二聚体和非特异性扩增。
可以使用在线设计工具，并结合相关文献进行优化。
2、反应条件优化退火温度是影响 PCR 反应特异性的重要因素，需要通过梯度 PCR进行优化。
荧光定量PCR实验报告
荧光定量PCR实验报告目前需要检测抗癌药 A在不用时间点对某抑癌基因B表达的影响，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA，请设计相关实验来检测药物A对基因B转录水平影响。
一、实验原理所谓实时荧光定量 PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
本实验主要采用SYBR荧光染料。
在PCR 反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
二、实验试剂和器材因RNA已提取，即应准备反转录和做PCR的试剂：逆转录酶（M-MLV ），核糖核酸酶抑制剂（RNasin），dNTP，Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）,随机弓丨物（Random primers），琼脂糖（agarose）均为美国Promega 公司产品；荧光定量试剂盒：Hot Start Fluoresce nt PCR Core Reage nt Kits（SYBR Green I） , BBI 公司，合适的抑癌基因A的引物、3-actin引物。
器材：ABI 7300 Real-Time PCR SystemRS-28高速低温离心机超低温冰箱微量移液器三、实验步骤<1>，根据该药物在文献记录中发挥作用的时间点，用抗癌药A在0小时，6小时，24小时给予药物，并已提取各时间点细胞的总RNA<2>反转录（RT ）:反转录反应液组成如下表：RNasi n 2 2011/ 1RNA 5.3 gRan dom Primer 1 0J u 冒1M-MLV 6 5U/ 1 Nucleasr-Free Water 3.2Total 2542C反转录50min , 95C 5min灭活反转录酶。
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RT-qPCR比较不同样本中miR-21的相对表达差异
一、实验目的
1、掌握实时荧光定量PCR的实验原理。
2、掌握实时荧光定量PCR相对定量的分析方法。
二、实验原理
实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
荧光定量PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR Green Ⅰ的非特异性方法和 Taqman 水解探针的特异性方法。
本实验中采用非特异性 SYBR Green I 染料法，SYBR Green I 是一种结合于所有ds DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下会发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA 结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
三、实验仪器、材料和试剂
实验仪器：PCR仪、荧光定量PCR仪
实验材料：MCF7细胞
实验试剂：逆转录试剂盒、SYBR GREEN试剂盒
四、实验步骤
4.1 MCF7细胞RNA提取（RNAiso Plus）
1)将生长至80%的MCF细胞消化为单细胞悬液，准备提取RNA；
2)9000g,2min离心，弃掉培养基，加1 ml RNAiso Plus用移液枪反复吹吸直至
裂解液中无明显沉淀，室温（15-30℃）静置5分钟；
3)加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈
乳白色，室温静置5min；
4)12,000 g 4℃离心15分钟。
从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三
层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相。
5)吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。
6)向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀
后，室温下静置10分钟。
7)12,000g 4℃离心10分钟。
一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。
8)弃上清，加入1ml DEPC水配制的75%乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹
管底，让沉淀浮起来，并静置3-5 min；
9)打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。
沉淀干燥后，加入适量(可以根据沉淀
的多少确定）的RNase-free 水溶解沉淀。
测浓度，记录A260/280。
4.2 1%琼脂糖凝胶电泳（取少部分进行跑电泳，留足够的量做反转录）
4.3 反转录
试剂体积（10μl）
RNA500 ng
1μl
Gene specific primers(2μM）RT
primer
2μl
5×ReverseTranscriptase M-MLV
Buffer
dNTP (10mM)0.5μl
Reverse Transcriptase M-MLV0.5μl
Inhi bitor (40 U/μl)0.5μl
RNase-Free Water Up to10μl
反应条件：
温度：42℃，45min;70℃，15min.
4.4 qPCR
试剂体积（20μl）
2×SYBR Green 10μl
FP (10μl)0.5μl
RP(10μl)0.5μl
cDNA Template 1μl
RNase-free Water 8μl
反应程序：
1）stage 1：预变性，95℃，3min;
2）Stage 2:循环反应：40个循环
95℃，10s;
60℃，30s
3）溶解曲线：95 ℃，15 s；60℃，1 min；95 ℃，15 s.
五．实验结果及分析
5.1 RNA的质量检测结果
ng/ul 260/280 260/230
497.3 1.85 2.05
5.2 扩增曲线：
5.3 溶解曲线：
如图，为单一的峰，说明无非特异性产物，定量准确。
5.4 实验结果及数据处理
PCR 反应结束后，得到如下数据：
Sample Name Target Name Reporter Cт Cт Mean MCF7 miR21 SYBR 16.97953606
MCF7 miR21 SYBR 16.97027779
16.97576142 MCF7 miR21 SYBR 16.9774704
MCF7 miR-130b SYBR 22.80200005
22.75579071 MCF7 miR-130b SYBR 22.7244873
MCF7 miR-130b SYBR 22.74088478
MCF7 GAPDH SYBR 13.8417778
MCF7 GAPDH SYBR 13.54553699
13.65600618 MCF7 GAPDH SYBR 13.58070374
注：平行样的 Ct 值之间的差<0.5 时表示重复性较好
计算如下：
ΔCT(miR21)= 3.319755236
ΔCT(miR130b)= 9.099784533
ΔΔCT= ΔCT(miR21)- ΔCT(miR130b)
=-3.319755236-9.099784533
=-5.780029297
2–ΔΔCT=2-(-5.780029297)= 0.0181985927
miR21的表达量是miR130b的0.0181985927倍
六．问题与思考
1.设计本次实验miR-21和miR-130b的RT-qPCR引物？
miR21: TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA F Primer: AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTG
R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）
引物Blast 结果：
miR130b：CAGTGCAATGATGAAAGGGCAT
茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGCCC F Primer: CAGTGCAATGATGAAAGGGCA
R Primer: CGCAGGGTCCGAGGTATTC（通用引物）
引物Blast 结果：
2.荧光定量PCR与普通PCR有什么异同点？
原理不同：荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光；普通PCR 通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量，一般是紫外光。
反应要求不同：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长点的片段。
如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通PCR必须电泳。
结果不同：荧光定量可以实现精确定量，普通PCR则不行。
荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通PCR无法实现的。