荧光分析法实验(有思考题答案)
分子荧光法测定水杨酸乙酰水杨酸1
分子荧光法测定水杨酸和乙酰水杨酸一、实验目的1、学习荧光分析法的基本原理。
2、掌握应用分子荧光法测定乙酰水杨酸、水杨酸的分析方法。
3、了解F-3501型荧光分光光度计的主要结构及工作原理，掌握其正确的使用方法。
二、实验原理某些物质经紫外光或波长较短的可见光照射后，会发射出较入射波长更长的荧光。
荧光光谱反映了物质的特性，建立在测量荧光光谱基础上的分析方法称为荧光分析法。
当进行荧光测定时，总要选择不同波长的光波进行测定，即一个为激发光——物质所吸收的光；另一个为物质吸收后发出的光称为发射光或荧光。
对同一物质而言，在稀溶液（即A = abc < 0.05）中，荧光的强度F与该物质的浓度C 有以下关系：F = 2.3φabcI0式中φ为荧光过程的量子效率，a为荧光分子的吸光系数，b为试样的吸收光程，I0为入射光的强度。
当I0及b 不变时，上式变为：F= KC其中，K为常数。
荧光分析法具有灵敏度高（一般超过分光光度法2~3个数量级）、取样少、方法快速等特点，现已成为食品、生物医药、天然产品、农业、环境保护、化工等领域中的重要分析方法之一。
但由于许多物质本身不会发生荧光，故在使用范围上受到一定的限制。
乙酰水杨酸（ASA，即阿司匹林）水解能生成水杨酸（SA），而在乙酰水杨酸中，或多或少都存在着水杨酸。
由于两者都有苯环，也有一定的荧光效率，因而在以三氯甲烷为溶剂的条件下，可用荧光法进行测定。
从乙酰水杨酸和水杨酸的激发光谱和荧光光谱中可以发现：乙酰水杨酸和水杨酸的激发波长和发射波长均不同，利用此性质，可在各自的激发波长和发射波长下分别测定。
三、仪器与试剂1、仪器F-3501型荧光分光光度计、电子天平、离心机、真空泵、石英比色皿、移液管、棕色容量瓶、比色管、烧杯、砂芯抽滤装置、量筒、洗耳球、洗瓶等。
荧光分析法实验报告
荧光分析法实验报告实验目的本实验旨在学习和掌握荧光分析法的原理和操作方法，以及了解荧光分析法在实际应用中的意义和限制。
实验器材和试剂•器材：荧光分析仪、量筒、移液管、烧杯等。
•试剂：待测样品溶液、荧光分析标准品溶液、荧光分析试剂盒等。
实验步骤1. 样品制备1.将待测样品溶解于适宜的溶剂中，以得到一定浓度的待测样品溶液。
2.将荧光分析标准品溶解于相同的溶剂中，以得到一系列浓度的标准品溶液。
2. 仪器准备1.打开荧光分析仪电源，等待其预热。
2.检查仪器是否正常工作，如灯泡是否亮起等。
3. 实验操作1.使用移液管分别取一定体积的标准品溶液和待测样品溶液，分别转移到烧杯中。
2.使用量筒等器材，加入适量的荧光分析试剂盒中的试剂。
3.摇匀烧杯中的混合液，并将其转移到荧光分析仪的样品槽中。
4.设置荧光分析仪的参数，如激发光源波长、检测光源波长等。
5.启动荧光分析仪，记录仪器给出的荧光强度值。
4. 数据分析1.对于标准品溶液，绘制荧光强度与浓度的标准曲线图。
2.使用标准曲线，根据待测样品的荧光强度值，计算其对应的浓度。
3.根据计算结果，分析待测样品中目标物质的含量或其他相关信息。
结果与讨论根据实验操作步骤，我们成功制备了待测样品溶液和一系列不同浓度的荧光分析标准品溶液。
在荧光分析仪的帮助下，我们获得了待测样品和标准品的荧光强度值。
通过绘制标准曲线和计算待测样品的浓度，我们可以得出目标物质在样品中的含量。
荧光分析法由于其高灵敏度和选择性，被广泛应用于环境监测、生物医学研究等领域。
然而，荧光分析法也存在一些限制，例如对样品的预处理要求较高，以及某些干扰物质可能影响荧光信号的准确性。
实验总结通过本次实验，我们深入了解了荧光分析法的原理和操作方法。
我们学会了如何制备样品溶液、使用荧光分析仪进行测量，并通过数据分析得出目标物质的含量。
荧光分析法作为一种重要的分析方法，具有广泛的应用前景。
在实际应用中，我们需要根据具体情况选择合适的荧光试剂和仪器参数，以确保结果的准确性和可靠性。
荧光分光光度法测维生素B2的含量
荧光分光光度法测维生素B2的含量一、实验目的1.了解荧光分析法的原理2.学习荧光公光光度计的使用方法二、实验原理维生素B2在230—490nm范围波长的照射下，激发出峰值在526nm左右的绿色荧光，在pH=6-7的溶液里荧光最强，在pH=11时荧光消失。
三、仪器与试剂荧光分光光度计、容量瓶、玻璃棒10.0ug/ml维生素B2标准液：称取10.0mg维生素B2，先溶解于少量的1%乙酸中，然后用1%乙酸定容至1000ml。
溶液应该保存在棕色瓶中，置于阴凉处。
四、实验步骤1. 标准系列溶液的配制取6个25ml比色管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml及2.5ml维生素B2标准溶液，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
2．测定荧光激发光谱和发射光谱取上述第3号标准系列溶液，测定激发光谱和发射光谱。
先固定发射波长为525nm，在400—500nm区间进行激发波长扫描，获得溶液的激发光谱和荧光最大激发波长λex再固定激发波长为λex，在480—600nm区间进行发射波长扫描，获得溶液的发射光谱和荧光最大发射波长λem。
3.标准曲线的绘制（1）波长的设定：将激发波长和发射波长分别设定为上述得到的λex T和λem 值。
（2）绘制标准曲线：用1号标准系列溶液将荧光强度“调零”，然后分别测定2—6号标准系列溶液的荧光强度。
4.未知试样测定取未知试样溶液2ml置于25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，测定此溶液的荧光强度。
五、实验数据及结果（1）从绘制的维生素B2的激发光谱和发射光谱曲线上，确定其最大激发波长和最大发射波长；（2）从绘制维生素B2的标准曲线，并从标准曲线上确定未知试样溶液中维生素B2的浓度；（3）计算出原始未知试样中维生素B2的浓度。
六、注意事项测定的顺序要从稀到浓，以减小测量误差。
七、思考题（1）什么是荧光激发光谱？如何绘制荧光激发光谱？（2）什么是荧光发射光谱？如何绘制荧光发射光谱？。
荧光光谱法
荧光分析法测定维生素B2一、实验目的1.学习与掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理与方法;2.熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法;3、学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。
二、实验原理当用一种波长的光照射某种物质时,这种物质会在极短的时间内,发射出一种比照射光波长较长的光,这种发射出来的光就叫做荧光。
当照射光停止照射时,荧光也随之很快地消失。
利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光,以进行该物质的定性分析与定量分析,称为荧光分析。
实验证明,荧光通常发生于具有刚性平面的л-电子共轭体系分子中。
随着л-电子共轭度与分子平面度的增大,荧光也就越容易产生。
因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团,芳环数越多,荧光愈强。
能发荧光的纯无机物很少,通常就是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。
图1.荧光分光光度计的结构原理图荧光分光光度计工作原理(图1)可简述为:光源发出的光束经激发单色器色散,提取所需波长单色光照射于样品上,由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上,检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后,由信号显示系统显示或者记录。
荧光光谱包括激发光谱与发射光谱两种。
激发光谱就是就是指发射单色器波长固定,而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。
荧光发射光谱就是指激发单色器波长固定,发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。
一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。
这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。
荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。
定性时,就是将实验测得样品的荧光激发光谱与荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分,一般荧光定性的依据就是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。
定量分析时,一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长,以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长,测量样品的荧光强度。
实验四 荧光分光光度法测定维生素 B2
实验四荧光分光光度法测定维生素B2一、实验目的1．了解F 96 荧光分光光度计的性能及操作。
2．掌握荧光分析法的基本原理。
3．学习荧光分析法测定维生素B2 的含量。
二、实验原理维生素B2 是一种具有强烈荧光特性的化合物。
其水溶液在pH = 6～7 时荧光最强，其最大激发波长为λex= 465 nm ，最大发射波长为λem = 520 nm。
在低浓度时，λex = 465 nm 时在520 nm 处测得的荧光强度与维生素B2 成正比。
即：I F＝Kc采用校正曲线法可测定复合维生素片剂中维生素B2 含量。
当pH 在11以上时，荧光猝灭。
图 4 维生素B2 的激发光谱（a）和荧光光谱（b）三、仪器与试剂1．仪器：F96 型荧光分光光度计；容量瓶；移液管。
2．试剂：1％HAc 溶液；维生素B2；复合维生素片剂。
四、实验步骤1．维生素B2 标准溶液的配制称取10.0 mg 维生素B2，先溶解于少量1％HAc中，然后转移至 1 000 mL容量瓶中，用1％HAc稀释至刻度，摇匀，即配制成10.0 μg/mL的维生素B2 标准溶液。
溶液保存在棕色容量瓶中，置阴凉暗处。
2．标准系列溶液的配制取5个50 mL的容量瓶，分别加入1.00、2.00、3.00、4.00 及 5.00 mL 维生素B2 标准溶液，用水稀释至刻度，摇匀，待测。
3．未知样品溶液的配制取复合维生素片剂适量，于100 mL小烧杯中，以1％HAc溶解，转移至50 mL容量瓶中，以水稀释至刻度，待测。
4．将标准系列溶液及未知样品溶液，分别置于F96 荧光分光光度计上，选择合适的激发波长和测定波长，测定其荧光强度，绘制工作曲线，查出未知样品中维生素B2 的含量。
五、数据处理1．由记录仪记录所得荧光光谱图上查出标准系列不同浓度维生素B2 相应的荧光强度，作工作曲线。
2．在荧光光谱图上查出未知样品的荧光强度，在工作曲线上查出对应浓度，进行换算后求出片剂中维生素B2 的含量。
(完整版)荧光分析法习题参考答案
荧光分析法思考题和习题1．如何区别荧光、磷光、瑞利光和拉曼光？如何减少散射光对荧光测定的干扰？荧光：是某些物质吸收一定的紫外光或可见光后，基态分子跃迁到激发单线态的各个不同能级，然后经过振动弛豫回到第一激发态的最低振动能级，在发射光子后，分子跃迁回基态的各个不同振动能级。
这时分子发射的光称为荧光。
荧光的波长比原来照射的紫外光的波长更长。
磷光：是有些物质的激发分子通过振动弛豫下降到第一激发态的最低振动能层后，经过体系间跨越至激发三重态的高振动能层上，再通过振动弛豫降至三重态的最低振动能层，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能层．这种光辐射称为磷光。
磷光的波长比荧光更长。
瑞利光：光子和物质分子发生弹性碰撞时．不发生能量的交换，仅是光子运动的方向发生改变，这种散射光叫做瑞利光，其波长和入射光相同。
拉曼光：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换，使光于能量发生改变。
当光子将部分能量转给物质分子时，光子能量减少，波长比入射光更长；当光子从物质分子得到能量时，光子能量增加，波氏比入射光为短。
这两种光均称为拉曼光。
为了消除瑞利光散射的影响，荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上进行，并通过调节荧光计的狭缝宽度来消除为消除拉曼光的影响可选择适当的溶剂和选用合适的激发光波长2．何谓荧光效率？具有哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？荧光效率又称荧光量子效率，是物质发射荧光的量子数和所吸收的激发光量子数的比值称，用Ψf表示。
以下分子结构的物质有较高的荧光效率：(1)长共轭结构：如含有芳香环或杂环的物质。
(2)分子的刚性和共平面性：分子的刚性和共平面性越大，荧光效率就越大，并且荧光波长产生长移。
(3)取代基：能增加分子的π电子共轭程度的取代基，常使荧光效率提高，荧光长移，如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等。
3．哪些因素会影响荧光波长和强度？(1)温度：物质的荧光随温度降低而增强。
实验4-氨基酸类物质的荧光光谱分析
氨基酸类物质的荧光光谱分析【摘要】荧光物质吸收特定频率辐射能量后会产生荧光,不同荧光物质的最大吸收波长、最大激发波长以及荧光谱图不同,以此可以鉴定未知物质。
荧光还与物质浓度在一定范围内有线性关系,可以通过测定未知浓度的已知物荧光吸收强度来测定浓度。
【实验目的】１、熟悉荧光分析法的基本原理;2、了解RＦ–53０1 型荧光分光光度计的构造、原理,掌握荧光分析法的基本操作;３、掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。
【基本原理】原理概述:利用荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后,由基态跃迁至激发态的任一振动能级,在溶液中以热的形式损失部分能量后回到第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
荧光的产生:荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后,由基态跃迁至第一电子激发态(或更高激发态）的任一振动能级,在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞,以热的形式损失部分能量后,而回到第一电子激发态的最低振动能级(无辐射跃迁)。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级,便产生荧光。
能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π 键结构或具有刚性平面结构等特征。
发射光谱与吸收光谱:荧光分析法的特点：优点:灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽,能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量 子产率、荧光偏振等诸多信息；缺点:由于能够产生强荧光的物质相对较少，荧光分析法的应用不太广泛;改进：对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。
氨基酸：含有氨基和羧基的一类有机化合物,是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。
色氨酸（Tｒy)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分,可以用荧光法测定。
【仪器与试剂】1、仪器：F－4600 型荧光分光光度计，10 ｍL 带玻璃塞的比色管1０只，移液管图1荧光光谱仪结构示意图2、试剂：标准溶液a:４×10-4ｍｇ/mＬ的酪氨酸溶液;标准溶液b:1×１0－3mg/mＬ的苯丙氨酸溶液；标准溶液c：１×１０-3mg/mＬ的色氨酸溶液;色氨酸待测样;去离子水。
荧光光度法测定维生素B2的含量-实验五、荧光分析法测定维生素B2
实验八、荧光光度法测定维生素B2的含量内容：P94-97和P208-210一、实验目的1、学习荧光分光光度计的工作原理2、熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法3、掌握荧光光度分析法测定维生素B2的方法二、实验原理在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的荧光。
以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。
对同一物质，若alc << 0.05，即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系：F = 2.3 Φf I0alc，I0和l不变时，F = K⋅c (K为常数)。
因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。
维生素B2在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为535 nm。
维生素B2的荧光在pH值为6～7时最强，在pH值为11时消失。
荧光分析实验首先选择滤光片，使测量获得最强荧光，且受背景影响最小。
激发光谱受选择激发滤光片的依据，该滤光片的最大透射比与待测物质激发光谱的最大峰值波长相近。
荧光光谱是选择荧光滤光片的主要依据。
本实验使用的Cary Eclipse荧光分光光度计，其预扫描功能可自动识别出该容积的拉曼、瑞利及二级散射峰，并在扫描结束后自动给出最佳的激发/发射波长。
本实验采用标准曲线法来测定维生素B2的含量。
三、实验仪器与试剂（略）四、实验内容1、扫描测定取待测液2.50 mL置于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用Cary Eclipse 荧光分光光度计进行扫描测定，选择最佳的激发/发射波长。
2、浓度测定在5个50 mL容量瓶中，分别加入1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL 维生素B2的标准溶液，稀释，定容。
选定扫描测定确定的最佳激发/发射波长，用Cary Eclipse荧光分光光度计依次从稀到浓测量系列标准溶液和待测液稀释液的荧光强度。
五、结果与分析1、标准系列溶液的荧光强度绘制标准曲线。
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实验二.氨基酸的荧光激发、发射及同步荧光光谱的测量五．数据处理
1．用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图（如图3、4）。
2．从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。
在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。
苯丙氨酸的荧光光谱图
苯丙氨酸扫描激发波长在214nm和285m两处出现最高峰，本实验选择214nm为最大激发波长。
此外，激发波长曲线在280－300nm处出现了一个十分完美的峰，此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证，如图，我们通过同步扫描荧光光谱技术获得的激发波长也在215nm，与之前基本吻合。
色氨酸的荧光光谱图
色氨酸扫描激发波长在217nm处有一个最大峰，所以激发波长为217，发射波长为361。
发射波长曲线在450－460nm处出现了一个十分完美的峰（在这张图上没显示出来），此峰为倍频峰，非激发波长峰,我们通过同步扫描荧光光谱技术可以验证。
六．讨论与思考
1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？
从预扫描得到激发和发射波长的初步结果，根据我们得到的初步结果对仪器进行设置，然后对两种氨基酸溶液测量它们的荧光激发、发射和同步荧光光谱。
2．观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？
激发波长的整数倍处荧光发射光谱会出现以很强的峰，是倍频峰。
不适合定量分析。
3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。
同步荧光法能简化光谱，减少光谱重叠和散射的影响，提高对荧光性质相近化合物同时测定的选择性和灵敏度。
同步荧光法相对于激发光谱和发射光谱，
得到的峰比较窄，更明显。
同步荧光光谱不是荧光物质的激发光谱和发射光谱
的简单叠加。
在选合适的扫描波长差值的情况下，同时扫描激发光谱和发射光谱重叠波长处，才同时产生信号，
4．通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序。
CH2CH
COOH
2
C
NH
CH2
CH
CHCOOH
NH2
苯丙氨酸色氨酸
从共轭角度看，体系的共轭度增强，荧光效率一般也将增大，并使荧光波长向长波方向移动。
共轭效应使荧光增强的原因，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，π电子更容易被激发，产生更多的激发态分子，使荧光增强。
苯丙氨酸有4个共轭双键，而色氨酸有5个共轭双键，所以色氨酸荧光强度要高一些。
5．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。
紫外分光光度法是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。
反映的是分子结构中发色基团和助色基团的特征，但是紫外分光光度法提供的信息量比较少，所以虽然可以提供化合物的骨架结构和验证某些发色基团和助色基团，但很难确定其基团位置。
利用某些物质被紫外光照射后由激发单重态（S
1）最低振动能级至基态（S
）
各振动能级的跃迁产生的荧光可以进行定性或定量分析的方法。