拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
t-DNA插入突变体检测
2.2.3.7.取出凝胶，放入EB（溴乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；
2.2.3.8.之后放入凝胶成像仪中，观察DNA跑胶的情况。
3.结果
3.1.第一次
TPS法提取44号样品DNA，以DL2000为Marker。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）
4.2.实验分析
4.2.1.加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。
4.2.2.DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。
T-DNA插入鉴定实验报告
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA 插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase ChainReaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定
拟南芥核苷磷酸化酶基因的组织表达及其T-DNA 插入突变体鉴定徐文晶;程玉祥【摘要】To explore information and physiological function of nucleoside phosphorylase genes,by using PCR method,the authors examined gene expression of nucleoside phosphorylase in different tissues of model plant arabidopsis, and further screened T-DNA-inserted mutants of these genes. Results:Transcriptional expression of At4g28940 and At4g28940 is high in root tissues ,and slight transcript levels are detected in other tissues ,while At4g24350 gene expression is low in various tissues .After the identification of T-DNA insertion and transcriptional levels of thegenes ,the knockout mutants of At4 g28940 and At4 g24350 have been attained in this study .%为探明植物核苷磷酸化酶家族基因信息及生理功能，采用 PCR 扩增的方法，研究了模式植物拟南芥核苷磷酸化酶家族基因在不同组织中的表达，并对其核苷磷酸化酶基因 T-DNA 插入突变体进行鉴定。
结果表明：At4g24340和 At4g28940基因在根组织中大量转录表达，其他组织均微量检测到转录表达；At4g24350在各个组织中均有少量转录表达；经 T-DNA 插入结合转录表达鉴定，At4g28940和 At 4g24350基因为敲除突变体。
T-DNA插入鉴定实验报告
T-DNA插入突变体的鉴定时明辉同组者：薛敏学号：201000220069摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。
通过本实验，我们将学习如何用PCR的方法检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
1.引言T-DNA作为一种实验常用的遗传转化方法，在插入突变过程中，插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确定样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。
（PCR基本原理如右图）3-基团，在pH8.0 BufferDNA含有PO4（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察
河南农业科学,2011,40(5):62 66Jour nal of H enan Ag ricultural Sciences拟南芥atcwinv1基因T DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔*,张 莹,王 波(沈阳农业大学生物科学技术学院,辽宁沈阳110866)摘要:以拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异。
结果表明:拟南芥atcw inv1基因T DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5 88个百分点;突变体在44d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20 84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62 27个,较野生型降低11 00%;单株果荚种粒数平均45 87粒,较野生型降低21 46%;突变体的单果荚长度平均14 52cm,较野生型降低10 24%;单株果质量平均50 83mg,较野生型降低23 70%。
拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10 44cm,较野生型下降21 03%;主根长平均7 62cm,较野生型下降14 96%;单株莲座叶面积平均3 16cm2,较野生型下降13 90%;单株地上部分鲜质量平均81 81m g,较野生型下降11 11%;单株根鲜质量平均6 21m g,较野生型下降17 64%;单株地上部分干质量平均6 17m g,较野生型下降15 60%;单株根干质量平均0 55mg,较野生型下降6 78%。
拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18 78cm,较野生型增加4 22%;主根长平均16 48cm,较野生型下降5 88%;单株莲座叶面积平均6 80cm2,较野生型下降6 21%;单株地上部分鲜质量平均129 85mg,较野生型下降9 69%;单株根鲜质量平均9 97mg,较野生型下降13 23%;单株地上部分干质量平均9 22mg,较野生型下降4 16%;单株根干质量平均0 70mg,较野生型下降6 67%。
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拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察阮燕晔;张莹;王波【摘要】以拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异.结果表明:拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5.88个百分点;突变体在44 d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20.84%;果荚开裂时间6d左右,较野生型延长2d;单株果荚数平均62.27个,较野生型降低11.00%;单株果荚种粒数平均45.87粒,较野生型降低21.46%;突变体的单果荚长度平均14.52 cm,较野生型降低10.24%;单株果质量平均50.83mg,较野生型降低23.70%.拟南芥突变体在营养生长时期的株高平均10.44 cm,较野生型下降21.03%;主根长平均7.62 cm,较野生型下降14.96%;单株莲座叶面积平均3.16 cm2,较野生型下降13.90%;单株地上部分鲜质量平均81.81mg,较野生型下降11.11%;单株根鲜质量平均6.21mg,较野生型下降17.64%;单株地上部分干质量平均6.17 mg,较野生型下降15.60%;单株根干质量平均0.55mg,较野生型下降6.78%.拟南芥突变体在生殖生长时期的株高平均18.78 cm,较野生型增加4.22%;主根长平均16.48 cm,较野生型下降5.88%;单株莲座叶面积平均6.80 cm2,较野生型下降6.21%;单株地上部分鲜质量平均129.85 mg,较野生型下降9.69%;单株根鲜质量平均9.97 mg,较野生型下降13.23%;单株地上部分干质量平均9.22 mg,较野生型下降4.16%;单株根干质量平均0.70mg,较野生型下降6.67%.以上研究结果表明,atcwinvl 基因T-DNA插入突变影响了拟南芥植株正常的生长发育.%In the research, homozygous mutant (atcwinvl) and wild type of Arabidopsis were used to compare plant morphological differences in the period ofvegetative growth and reproductive growth. The results showed that compared to the wild type the germination rate of atcwinvl averagely decreased by 5.88 percentage points; compared to the wild type, bolting time of atcwinvl was 44 d, delayed 4 days;branch number of atcwinvl was 4, decreased by 20. 84 ％ ;cracking time of the pod of atcwinvl was 6,delayed 2 days;fruit pod number per plant of atcwinvl was 62.27,decreased by11.00％ ,fruit number of a pod of atcwinvl was 45.87,decreased by21.46％;length of a fruit pod of atcwinvl was 14.52cm,decreased by 10. 24％fruit weight of a plant of atcwinvl was 50. 83mg,decreased by 23.70％. In the period of vegetative growth,compared to the wild type, plant height of atcwinvl was 10.44cm, decreased by 21. 03％; root length of atcwinvl was 7.62cm, average decreased by 14. 96％; area of rosette leaf of atcwinvl was 3. 16 cm2 ,decreased by 13.90％ ;aboveground fresh weight of per plant was 81.81 mg, decreased by 11.11％ ;fresh weight of root per plant was6.21mg, decreased by 17.64％ ;aboveground dry weight of per plant was 6.17 mg, decreased by 15.60 ％ ;dry weight of root per plant was 0. 55mg,decreased by 6. 78 ％ ;In the period of reproductive growth, compared to the wild type, plant height of atcwinvl was 18. 78cm,increased by4.22％ ;root length of atcwinvl was 16.48cm,averagely decreased by5.88％; area of rosette leaf of atcwinvl was6.80 cm2, decreased by 6.21％; fresh weight of a plant of atcwinvl was 129.85 mg,decreased by 9.69％ ;fresh weight of root per plant was 9. 97 mg,decreased by 13.23％ ;aboveground dry weight of per plant was 9.22 mg, decreased by 4. 16％ ;dry weight of root per plant was 0. 70mg,decreased by 6.67％. The results obtainedshowed that growth of Arabidopsis was influenced by T-DNA insertional mutagenesis of atcwinvl gene.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2011(040)005【总页数】5页(P62-66)【关键词】拟南芥;atcwinvl基因;T-DNA插入突变;基因功能【作者】阮燕晔;张莹;王波【作者单位】沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866;沈阳农业大学,生物科学技术学院,辽宁沈阳110866【正文语种】中文【中图分类】Q789蔗糖是高等植物体内光合产物运输与分配的主要形式,其在植株中定向运输和分配的方式不仅调控植株的整个生长和发育进程,也决定作物的产量和品质。
而在蔗糖的库器官卸载过程中,细胞壁转化酶发挥着重要的作用[1-2]。
目前,对细胞壁转化酶的研究主要集中在其基因克隆和表达方面。
细胞壁转化酶基因最先从胡萝卜中分离得到[3],随后在马铃薯、拟南芥、烟草、番茄和葡萄等植物中也分离到编码该酶的全长或部分的核苷酸序列。
细胞壁转化酶基因在质外体中表达最活跃,并通过增加蔗糖的浓度梯度加快蔗糖卸载[4]。
此外,细胞壁转化酶还在蔗糖水解[4]、渗透调节[5]和伤害胁迫[3,6]中起作用。
目前,在模式植物拟南芥中分离出了4个编码细胞壁转化酶的相关基因,分别是atcwinv1,atcwinv2,atcwinv4,atcwinv5,其中 atcwinv1基因的表达水平最高,被普遍认为是蔗糖在韧皮部卸载的一个主效基因[7],但其确切的生理生化功能和作用机制还不十分清楚。
目前,拟南芥基因组测序已经完成,而且有大量的T -DNA 插入突变体,从中可以获得细胞壁转化酶基因敲出的突变体[8],因而是用反向遗传学方法研究植物细胞壁转化酶基因的最理想的材料。
通过比较拟南芥细胞壁转化酶基因纯合突变体与野生型拟南芥生长发育以及生理特征,可以获得拟南芥细胞壁转化酶基因的生理功能的相关信息。
鉴此,对拟南芥atcwinv1基因 TDNA插入纯合突变体进行表型观察,揭示该基因缺失对拟南芥植株生长发育的影响,为进一步研究该基因生理功能奠定理论基础。
1 材料和方法1.1 材料atcwinv1基因T -DNA 插入拟南芥种子（编号为salk_091455,原种为Columbia-0型）由拟南芥生物资源中心提供,拟南芥野生型（Col-0）种子由英国伯明翰大学提供。
1.2 方法1.2.1 拟南芥培养拟南芥atcwinv1型和野生型种子经4℃下春化3d后播种于盆土（泥炭土∶蛭石=3∶1）。
2种基因型种子分3批培养,每批分别播种100盆,每盆栽种1株拟南芥。
将种好的拟南芥置于长日照周期为10h光照/14h黑暗、光照强度为150μ mol/（m2◦s）、相对湿度为 70%白天/80%夜间和温度为（22±1）℃的培养室内生长[9]。
每批植株生长到35d时（营养期）收获1次,每次收获50株;55d时（生殖期）收获1次,每次收获50株,收获植株全部用于表型性状观测。
1.2.2 atcwinv1纯合突变体PCR鉴定采用三引物PCR法,以所提取的拟南芥植株总 DNA为模板,进行 PCR扩增[10-11]。
atcwinv1基因引物由宝生物工程有限公司合成,3条引物分别为LP:5′-TCT TCCCTATATT TGCAAGCG-3′;RP:5′-TGGT TTCAAGATGGACGGTAC-3′;LBa1:5′-ATT TTGCCGAT TTCGGAAC-3′。
反应体系共20μ L:1μ L 模板、1μ L（20μ mol/L）引物、0.4μ L（10mmol/L）dNTPs、2μ L（10 ×PCR）缓冲液、3.6μ L（25mmol/L）MgCl2、Taq DNA 聚合酶 1U （BBI）、双蒸水1μ L,甘油10μ L。
循环参数（30次循环）:94℃,1min;58℃,1min;72℃,2min。
选用1.7%的琼脂糖凝胶（内含0.5mg/L Goldveiw）电泳检测后,用凝胶成像系统在300nm波长的透射光下照相并记录扩增结果。