几种拟南芥突变体鉴定方法
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料-2022年学习资料
3.用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体-农杆菌T质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，-有TNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型-在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从-分离群体中 纯合突变体鉴定出来。-PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三-个引物LP、RP和BP,其中LP RP是植物基因组上T--DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物-经过PCR,在野生型植株， P和RP这对引物扩增出分子-量较大的产物（野生型基因，大带；在杂合突变体，-LP和RP能扩增出分子量较大的 物（野生型基因，大-带，另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小-带；在纯合突变体，只有BP和RP能扩 出分子量较小-的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR,根-据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突 体。
三、实验步骤-实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分-离群体30个株号的植株。-实验方法：（每人做1个株号 检测
一拟南芥基因组DNA提取
1.原理-分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操-作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基-因克隆、基 定位的第一个步骤。不同的研-究目的对D度要求高；-用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的-污染物；-用于遗传标记分析的DN ,纯度要求低但产量-阔-则要高
3.DNA提取步聚-1.用液氮将100mg幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5ml离心管中，加入预热至65℃的6 0川-的2×CTAB提取液，轻摇混匀。-2.65℃水浴1h,其间轻摇混匀。-12000rpm离心15min 弃沉淀，取上清转移至另一1.5ml离心管中。-4.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇24：1，轻轻混匀10m n,然后12000rpm离心15-min,再转移上清入新管。-5.向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。 20℃放置30min,12000rpm离心10min,-弃上清。-6.1用70%乙醇洗涤沉淀一次，1200 rpm稍离心，弃上清。-7.将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50μlTEpH8.0放4℃缓慢溶解 -8.电泳检测DNA的浓度和质量。
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法
拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法随着生物技术的快速发展，从分子到基因组层面的遗传研究已经成为许多生物学实验室的重要研究方向。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)则是其中一种最常用的模式植物，它拥有许多基因遗传和发育过程的相似性，因此被广泛用于生物学研究。
本文将着重介绍拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法。
1. DNA转化和质粒构建在拟南芥基因研究中，DNA转化和质粒构建是十分重要的实验方法。
DNA转化即将外源DNA导入拟南芥细胞内，常使用的方法有冷冻处理法、电穿孔法等。
而质粒通常可以用于转化拟南芥细胞，以研究基因结构、调节元件、绿色荧光蛋白构建等。
2. 基因敲除基因敲除是在已知某个基因的功能和表达模式，并通过基因突变得以验证。
敲除分为生理性敲除和人工性敲除两种，其中后者可以通过质粒导入方法实现。
基因敲除在拟南芥遗传学研究中被广泛应用，可以探究基因对于生长发育过程的途径以及在各种逆境下的适应能力等。
3. 基因表达基因表达研究是在基因的各种调节元件上构建不同启动子，将被测量的基因与这些元件进行组合，从而研究基因表达的条件和模式。
例如通过全基因组转录组分析方法，可以了解到各种条件对基因表达的影响。
基因表达研究在植物逆境抗性和发育过程等方面都有广泛的应用。
4. 突变体筛选突变体是指基因序列中发生变异引起的表型重要变化，通常是由于自然或人为诱变引起。
突变体的筛选在拟南芥属植物分子遗传学中有着重要的地位。
目前已开发出几十种突变体筛选方法，包括靶向突变、随机诱变、胚乳培养及基因组分析等。
通过筛选突变体，我们可以了解到基因在植物生长发育中的重要性和相互间的关系。
5. 遗传交叉和构建突变遗传交叉是通过交叉杂交的方式寻找某一特定基因或显性性状的控制，以了解基因型和表型特征之间的关系。
而构建突变则是利用特定的载体将人工合成的单个核苷酸序列插入到目的基因中，从而创造特定的基因突变。
这些方法在研究基因调控途径、寻找新型基因等方面都有着重要的应用。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
几种拟南芥突变体鉴定方法
HY5‐215The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995.In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processingIn hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an aHY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。
引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。
Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0(/dcaps/dcaps.html)HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8PsiI:但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。
在设计的引物有2个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。
HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8AluI:MYCTThe Arabidopsis bHLH Transcription Factors MYC3 and MYC4 Are Targets of JAZ Repressors and Act Additively with MYC2 in the Activation of Jasmonate Responses, Plant Cell. 2011 Feb; 23(2): 701–715.MYC2Mutagen : T‐DNA insertionInsertion FlankingSequence:TAAAACCGCCGGAGAATCAGATCACTCCGATCTAGAAGCT(Length:40)根据T‐DNA PrimerDesign（/tdnaprimers.2.html）设计引物PRODUCT_SIZE 1186Myc2LP TGGTTTTTCTTGGTTTCGATG Len 21 TM 59.96Myc2RP CTCTAATCATTGCGTCCCAAC Len 21 TM 59.58LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC BP+RP_PRODUCT_SIZE 558‐858MYC3Mutagen : T‐DNA insertionmyc3 F AAGGTGGGTTGTTGAAATCTAATG Len 24 TM 58.3myc3 R GTTTTCTCCGACTTTCGTCATCA Len 23 TM 61T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2MYC4Mutagen : T‐DNA insertionmyc4 F TCTCTCACAACTTGATCCAGCTAA Len 24 TM 60.0myc4 R TAACCGATTACCATCTCAACCAA Len 23 TM 59.2T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2Phyb‐9Mutations in the gene for the red/far‐red light receptor phytochrome B alter cell elongation and physiological responses throughout Arabidopsis development. Plant Cell v.5(2); 1993 Febhy3-EMS742 is a G-toA mutationphyb9 F CTGTTCAATCGCAGAAACTCGCGGT Len25phyb9 R CCGTCACATTTCACTAAGTCCAT Len 23 TM58.6MnlI:但是，实验室并没有MnlI，所以只能再去寻找新的内切酶。
拟南芥突变体的筛选与鉴定综述
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。
在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。
在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。
概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。
总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。
关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究Screening Summary of Arabidopsis MutantsTang Hui Instructor:Wang YanlingAbstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screeningproposed resilience of Arabidopsis mutants.Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。
拟南芥插入突变体鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定【摘要】拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。
实验将获得T-DNA插入某基因造成的突变种，插入基因功能进行判断。
筛选出纯种突变型，同时进行PCR法序列鉴定纯种突变型、杂种突变型与野生型。
1.引言：反向遗传学：经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
实验材料拟南芥：拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。
这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。
突变体获得：插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中，获得突变体。
当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。
常用的插入诱变方法为农杆菌转化法。
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
拟南芥突变体的功能鉴定及应用
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
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HY5‐215The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995.In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processingIn hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an aHY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。
引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。
Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0(/dcaps/dcaps.html)HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8PsiI:但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。
在设计的引物有2个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。
HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8AluI:MYCTThe Arabidopsis bHLH Transcription Factors MYC3 and MYC4 Are Targets of JAZ Repressors and Act Additively with MYC2 in the Activation of Jasmonate Responses, Plant Cell. 2011 Feb; 23(2): 701–715.MYC2Mutagen : T‐DNA insertionInsertion FlankingSequence:TAAAACCGCCGGAGAATCAGATCACTCCGATCTAGAAGCT(Length:40)根据T‐DNA PrimerDesign（/tdnaprimers.2.html）设计引物PRODUCT_SIZE 1186Myc2LP TGGTTTTTCTTGGTTTCGATG Len 21 TM 59.96Myc2RP CTCTAATCATTGCGTCCCAAC Len 21 TM 59.58LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC BP+RP_PRODUCT_SIZE 558‐858MYC3Mutagen : T‐DNA insertionmyc3 F AAGGTGGGTTGTTGAAATCTAATG Len 24 TM 58.3myc3 R GTTTTCTCCGACTTTCGTCATCA Len 23 TM 61T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2MYC4Mutagen : T‐DNA insertionmyc4 F TCTCTCACAACTTGATCCAGCTAA Len 24 TM 60.0myc4 R TAACCGATTACCATCTCAACCAA Len 23 TM 59.2T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2Phyb‐9Mutations in the gene for the red/far‐red light receptor phytochrome B alter cell elongation and physiological responses throughout Arabidopsis development. Plant Cell v.5(2); 1993 Febhy3-EMS742 is a G-toA mutationphyb9 F CTGTTCAATCGCAGAAACTCGCGGT Len25phyb9 R CCGTCACATTTCACTAAGTCCAT Len 23 TM58.6MnlI:但是，实验室并没有MnlI，所以只能再去寻找新的内切酶。
在设计的引物有1个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI将突变型切断。
phyb-9 F TCCAGCGAGGTGGTTACATTCAG Len 23 TM 63.9phyb-9 R AAGTGTGATGGCAAACAACCAAAGC Len 25 TM 64AluI:COP1‐4The weak copl-4 allele represents a C-to T mutation that changes theGln-283 CAA codon to a UAA stop codon.cop1‐4的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。
引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点MaeIII，可以将突变体的切断，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。
cop1--4 F GGAAGCACTACAAAGGGTCGGTT TM 63.7cop1--4 R TGAGACAGTTGACTGATTCAAACGTT TM 61.9MaeIII:但是，实验室并没有MaeIII，所以只能再去寻找新的内切酶。
在设计的引物有2个错配位点时，可以产生新的酶切位点，MluI将突变型切断。
cop1‐4 F GGATGCGCTGAGTGGGTCAGACGCG Len 25 TM 72.0cop1‐4 R TCACCTTGATACAATGTTGGCTG Len 23 TM 60.3MluI:pifqMultiple phytochrome‐interacting bHLH transcription factors repress premature seedling photomorphogenesis in darkness. Curr. Biol. 2008a;18:1815–1823.pif1Phytochrome‐interacting factor 1 is a critical bHLH regulator of chlorophyll biosynthesis, Science 305, 1937‐1941Mutagen T-DNA insertionpif1‐1 F ACTTCTTGGCTTCATTATCCTCT Len 23 TM 56.5pif1‐1 R CTCAATAGCTTCATCTAGCATCG Len 23 TM 56.9LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC Len 19 TM 55.2pif3The phytochrome‐interacting transcription factor, PIF3, acts early, selectively, and positively in light‐induced chloroplast development. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 16091‐16098.pif3‐3 wt‐F AGAAGCAATTTGGTCACCATGCTCpif3‐3 wt‐R TGCATACAAATAGTCGATCGTATGpif3‐3 del‐F GGTGTGTATGTGAGAAGGTACATCCATCGpif3‐3 del‐R AAGCTTAGCTTTGGTGAGCCTGAAAAGCTCpif4The Arabidopsis phytochrome‐interacting factor PIF7, together with PIF3 and PIF4, regulates responses to prolonged red light by modulating phyB levels. Plant Cell 20, 337‐352.Mutagen T-DNA insertionpif4‐2 WT F TTCATTCATTGGTGTGTTTTTGCpif4‐2 WT R TCCAAACGAGAACCGTCGGTpif4‐2 T‐DNA TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACACpif5The basic helix‐loop‐helix transcription factor PIF5 acts on ethylene biosynthesis and phytochrome signaling by distinct mechanisms. Plant Cell 19, 3915‐3929.根据T‐DNA PrimerDesign（/tdnaprimers.2.html）设计引物pif5-3 F CCTTGCTCGATTTTTGTTACG Len 21 TM 59.77pif5-3 R CGATTTGTTACCCATGGTTTG Len 21 TM 60.10LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC。