拟南芥突变体购买流程-完全图解
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
三个拟南芥NAC同源基因突变体的ABA响应及下游基因表达分析
三个拟南芥NAC同源基因突变体的ABA响应及下游基因表达分析摘要：在获得拟南芥NAC同源基因（NAC019、NAC055和/V AC072）双突变体和三突变体纯系的基础上，进一步分析它们对ABA响应的生理差异及其ABA诱导相关下游基因的表达变化，深入探讨它们与ABA响应的关系。
结果表明，在种子绿胚建成的过程中，NAC055和NAC072基因与ABA响应相关；在根生长方面，三者在ABA响应中作用不明显。
经ABA处理后，突变体nac072和nac055n，cac072与野生型比较，RAB18、RD29A和RD29B基因表达上调显著，推测在ABA响应的基因表达调控过程中，MC072和NAC055起负调控协同作用，而NAC019则发挥拮抗作用。
关键词：NAC；拟南芥；突变体；ABA响应文献标识码：ANAC（NAM，ATAF，CUC）转录因子是特异存在于植物中，具有多种生物功能的一类新型转录因子。
NAC转录因子的N端含有高度保守的NAC结构域，用于结合DNA，调节转录活性，C端是高度变异转录激活区[1]。
NAC转录因子具有诸多方面的功能，如参与植物次生生长、激素信号转导，以及在与生物胁迫和非生物逆境中发挥作用[2，3]。
从拟南芥中分离到3个不同的NAC基因NAC019、NAC055和NAC072，干旱诱导其表达，能与NACRE（NAC response elements）的核心元件CACC和MYC-Like元件CATCT的DNA体外结合[4]。
NAC072被报道参与ABA介导的逆境信号传导途径，超量表达显著增强转基因植株ABA敏感性，瞬时表达激活多CACC元件启动子活性[5]。
NAC019在ABA 信号传导中也起正向的调节作用[6]；NAC019和NAC055在JA和ABA的信号转导途径之间存在交叉对话[7]。
拟南芥NAC072（RD26），NAC019和NAC055编码蛋白氨基酸序列同源性高，且其表达模式和遗传功能类似。
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定余振洋（高山山、潘红芳）、09级生技1班、200900140156、2011/12/14摘要本实验通过CTAB法提取目的拟南芥的DNA，再用三引物法PCR扩增所需的目的基因后，用电泳检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
关键词拟南芥;T-DNA；突变纯和体1．引言T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T—DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
T—DNA插入突变在反向遗传学和功能基因组学研究中发挥着重要作用。
，T—DNA插入突变能方便地进行正向和反向遗传学研究，因而受到重视。
同时，基因组测序工作的完成使得从位点到表型的反向遗传学研究成为可能，从而使通过T—DNA插入技术构建突变体来研究功能的反向遗传学技术逐渐取代了传统的化学诱变、图位克隆等技术。
借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T—DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。
以T—DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。
由于插入的T—DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T—DNA 插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
CTAB法提取植物叶片中的DNA是我们常用的方法。
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
几种拟南芥突变体鉴定方法
HY5‐215The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995.In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processingIn hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an aHY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。
引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。
Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0(/dcaps/dcaps.html)HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8PsiI:但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。
在设计的引物有2个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。
HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8AluI:MYCTThe Arabidopsis bHLH Transcription Factors MYC3 and MYC4 Are Targets of JAZ Repressors and Act Additively with MYC2 in the Activation of Jasmonate Responses, Plant Cell. 2011 Feb; 23(2): 701–715.MYC2Mutagen : T‐DNA insertionInsertion FlankingSequence:TAAAACCGCCGGAGAATCAGATCACTCCGATCTAGAAGCT(Length:40)根据T‐DNA PrimerDesign（/tdnaprimers.2.html）设计引物PRODUCT_SIZE 1186Myc2LP TGGTTTTTCTTGGTTTCGATG Len 21 TM 59.96Myc2RP CTCTAATCATTGCGTCCCAAC Len 21 TM 59.58LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC BP+RP_PRODUCT_SIZE 558‐858MYC3Mutagen : T‐DNA insertionmyc3 F AAGGTGGGTTGTTGAAATCTAATG Len 24 TM 58.3myc3 R GTTTTCTCCGACTTTCGTCATCA Len 23 TM 61T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2MYC4Mutagen : T‐DNA insertionmyc4 F TCTCTCACAACTTGATCCAGCTAA Len 24 TM 60.0myc4 R TAACCGATTACCATCTCAACCAA Len 23 TM 59.2T-DNA ATATTGACCATCATACTCATTGC Len 23 TM 55.2Phyb‐9Mutations in the gene for the red/far‐red light receptor phytochrome B alter cell elongation and physiological responses throughout Arabidopsis development. Plant Cell v.5(2); 1993 Febhy3-EMS742 is a G-toA mutationphyb9 F CTGTTCAATCGCAGAAACTCGCGGT Len25phyb9 R CCGTCACATTTCACTAAGTCCAT Len 23 TM58.6MnlI:但是，实验室并没有MnlI，所以只能再去寻找新的内切酶。
拟南芥突变体的筛选与鉴定综述
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述系别林学与园艺学院班级园艺102班姓名唐辉学号103231228答辩时间年月新疆农业大学林园学院拟南芥突变体的筛选综述唐辉指导老师：王燕凌摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。
在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。
在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。
概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。
总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。
关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究Screening Summary of Arabidopsis MutantsTang Hui Instructor:Wang YanlingAbstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screeningproposed resilience of Arabidopsis mutants.Key words: Arabidopsis；Mutant；Filter；Research拟南芥（Arabidopsis）为十字花科(Cruciferous)、拟南芥属（Brassicaceae、Arabidopsis）一年生或二年生的细弱草本植物。
拟南芥突变体的功能鉴定及应用
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
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最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！
Step 1. 打开NCBI主页：/
打开的页面如下：
如下
得到如下页面：
进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：
记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因
接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。
但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法
它的搜索界面一目了然,使用也很方便。
下面介绍SALK突变体库的使用方法：
Step 2：打开SALK主页：/
点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中
从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向)
点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
我们主要是从ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。
祝实验顺利！
T-DNA Primer Design
( Powered by GEBD )
Please use the backup page served by AtTA, if the tdnaexpress server is down.
The new T-DNA Primer Design Tool is now powered by Genome Express Browser Server (GEBD). The new tool can return the primers faster, and also give the insertion location information, the estimated T-DNA confirmation product size, as well as primer3-like format output. (July 28, 2005)
Important Change: Now the RP is always on the side of the flanking sequence, that is, RP is always on the 3' end of the insertion. Therefore, the PCR reaction should always be set up as LB+RP for HM and LP+RP for WT. (Feb. 04, 2005)
1. Protocol for SALK T-DNA primer design
Note:
N - Difference of the actual insertion site and the flanking sequence position, usually 0 - 300 bases
MaxN - Maximum difference of the actual insertion site and the sequence, default 300 bps
pZone - Regions used to pick up primers, default 100 bps
Ext5, Ext3 - Regions between the MaxN to pZone, reserved not for picking up primers
LP, RP - Left, Right genomic primer
BP - T-DNA border primer LB - the left T-DNA border primer
BPos - The distance from BP to the insertion site
LB - Left border primer of the T-DNA insertion:
>LBb1 of pBIN-pROK2 for SALK lines
GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
>LBb1.3(Newly used by Salk Genotyping Project and with better results)
ATTTTGCCGATTTCGGAAC
>LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines
TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
>LB_6313R for SALK lines
TCAAACAGGATTTTCGCCTGCT
>LB1 for SAIL lines C/418-451 of pCSA110-pDAP101_T-DNAs
GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC
> >LB2 for SAIL lines C/390-423 of pCSA110-pDAP101_T-DNAs
GCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACA
>LB3 for SAIL lines C/350-383 of pCSA110-pDAP101_T-DNAs
TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC
To download SAIL pCSA110 & pDAP101 T-DNAs.
By using the three primers (LBb1.3+LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion) should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from LBb1.3 to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of LBb1.3. However, the protocol requires the same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.
You can set up two paired reactions, LP+RP and LB+RP. You should get a product in the LP+RP reaction for WT or HZ lines or get blank for HM lines, while get a band in the LB+RP for HM or HZ lines.。