拟南芥突变体购买流程-完全图解
拟南芥 MeIAA 抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
南芥幼苗下胚轴长约为 MS 培养基上的 10% 。在大于
2.5 µmol.L－1 的浓度下, MeIA A 对下胚轴的抑制程度随
浓度变化很小(图 1A )。综合上述两种现象, 我们选取
2 结果与分析
2.1 Me IAA抗性突变体筛选条件的确定
在进行大规模突变体筛选之前, 我们首先比较了 IA A 和
MeIA A 对黑暗下生长的拟南芥幼苗的下胚轴抑制程度。
在 0. 1－25 µmol.L－1 浓度范围内, 随着激素浓度的升高,
IA A 和MeIA A 对下胚轴的抑制程度都增强, 但是MeIAA
quljpkueducn拟南芥meiaa抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析北京大学生命科学学院北京大学耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验北京100101摘要生长素是最重要的植物激素之一参与了植物生长发育的各个方面
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (1): 52−58, w w w
1.4 突变体温度转移实验 将种子表面消毒后, 铺在 MS 培养基上, 4°C 春化 2 天, 然后转到 22°C, 水平萌发 3 天。转移大约 20 棵小苗到 新的 MS 平板上, 共转移 2 块。将其中一块仍然放在 22°C 条件下, 另一块转至 29°C, 垂直培养 3 天。比较 2 个生长条件下的植株下胚轴长度, 并统计。
室温保存。
1.3 M eIAA抗性突变体的筛选
将表面消毒后的种子点播在含有 2.5 µmol.L－1 MeIA A
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。
T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。
野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。
所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。
因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。
在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。
T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。
在本实验中使用三引物法。
三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。
图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。
能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。
本实验使用CATB抽提DNA。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。
它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。
拟南芥基因克隆及原核表达
拟南芥基因克隆及原核表达
要进行拟南芥 AtTCP4 基因的克隆和原核表达，可以按照以下步骤进行：
1. 获得目标基因序列：首先，需要获取拟南芥AtTCP4 基因的序列。
可以通过NCBI数据库或其他相关数据库搜索到目标基因的序列信息。
2. 购买引物：根据目标基因的序列设计引物，包括扩增该基因的起始引物和终止引物。
引物的设计应考虑适当的启动子和终止子，以便后续进行克隆和表达。
3. PCR扩增：使用目标基因的cDNA作为模板，使用合适的引物进行PCR扩增。
根据PCR反应条件，设置适当的温度和时间来实现特异性扩增。
扩增产物可以经过琼脂糖凝胶电泳检测，确认特定大小的DNA片段。
4. 克隆：将PCR扩增产物纯化，并将其连接到适当的质粒载体中。
质粒载体应包含合适的启动子、标签和抗生素抗性基因等元素。
使用大肠杆菌等宿主细胞进行转化，并培养在含有适当抗生素的培养基上，筛选出含有目标基因的克隆。
5. DNA测序：对选定的克隆进行DNA测序确认，以确保插入的基因片段没有错义突变或其他错误。
6. 准备原核表达系统：准备用于原核表达的适当宿主细胞（如大肠杆菌）并转化克隆。
选择合适的表达载体，并确保其包含适当的诱导子和选择标记。
7. 表达与纯化：培养转化后含有重组质粒的菌落，并在适当的条件下诱导表达目标基因。
收集细菌并通过细菌破碎、离心和层析等技术进行纯化。
以上步骤提供了一般的克隆和原核表达流程。
具体操作可能会因实验室和应用的不同而有所差异。
在进行实验之前，建议查阅相关的研究论文和方法手册，以获取更详细和具体的操作步骤和技术指导。
实验五 拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定
一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L]
三0ml反应体系二：
三0ml反应体系四：
二ml 植物基因组DNA样品[WT]
二ml 植物基因组DNA样品[一一一]
三ml 一0×扩增缓冲液
三ml 一0×扩增缓冲液
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五 三’引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
电泳检测
• 每个大组选两个人点样,电泳结果扫描保存, 下次课看结果,
• LBa一 of pBIN-pROK二 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
[一]取植物叶片[拟南芥一片叶子],置于一.五ml离心管中,加入四00 ml提取缓冲液;
[二]用研磨棒研磨植物材料,直至缓冲液变为绿色; [三]在台式离心机上一三000 rpm离心五分钟; [四]离心后将上清三00 ml转移至一个新的一.五 ml离心管中; [五]在上清中加入三00 ml异丙醇,混匀后于室温下一三000 rpm条
用无菌水补足体积,
PCR反应条件
八四℃ 三min 三0循环 [八四℃/一min,五五℃/一min,七二℃/一min]; 七二℃ 延伸一0min,
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和 引物的性质进行合适的调整,
PCR安排
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
姓名系年级学号日期科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥Ｔ-ＤNA插入突变体的鉴定摘要：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中,有T-DＮＡ插入的纯合突变体,杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。
本次实验意在对模式植物拟南芥Ｔ－DNA插入突变体进行鉴定。
实验中用到的主要实验方法有:CTAB法提取拟南芥基因组DＮＡ、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。
ＰCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。
每完成一个循环需２~4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
ＤＮA经EB染色,ＥＢ可与核酸结合,在紫外光激发下产生荧光。
现广泛应用于核酸的研究中。
引言Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的ＤNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA 中。
所以Ｔｉ质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将Tｉ质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-ＤNＡ区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。
T－DＮA插入基因内部导致基因突变:T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNＡ插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
这使农杆菌Ｔi 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。
反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DＮA插入突变体的鉴定方法。
拟南芥ems诱变与突变体筛选
• 植物叶片经过充分暗适应后,PSI和PSll均处于
还原状态，在650nm,光强为0.05o.1μmol/m2s的测量红光下，由于Psl主要吸收 远红光，Psll主要吸收红光，此时叶片电子传 递过程主要停留在PSll中，得到稳定的初始荧 光值FO。施加单饱和脉冲(3000μmol/m2 s for 0.8s)后，Psll暂时达到饱和，Psll的电子受体 QA被完全还原，叶绿素荧光产量由基态F(o) 上升到最大值F(m)。这可以决定PSll最大光化 学量子产量,Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Maximum quantum yield of PSll)，表明最大PSll光能转 化效率。在拟南芥野生型叶片中,常在0.8-0.84 之间。
选择压的确定
• 适当的选择压力应当是既能使突变体的优 势得到发挥,又能使野生型受到足够的压力 而不能表现。在筛选突变体之前,首先要设 计一系列的筛选浓度,以野生型完全不能生 长的浓度确定为筛选浓度。
根据高叶绿素荧光表型筛选突变体
• 其中高叶绿素荧光表型,作为光合电子传递链受损的标 志,广泛地应用于筛选光合组分功能缺失的突变体。在 正常的条件下,光化学反应与非光化学途径活性很高,荧 光的释放很低(约3一5%);相反,如果由于类囊体膜蛋白 复合体结构的改变等原因而造成的光合电子传递的受 阻,则所吸收的光能不能有效传递转变成化学能,便会以 热或高荧光的形式释放出来,使光受体从激发态回到它 的稳定态(基态),导致吸收的能量以红色荧光进行释放 的比例增加,这样我们便能在暗室中观察到与正常植株 所发出的暗红色荧光相比是亮红色的荧光,即产生高荧 光(hcf)的表型从而将突变体筛选出来。
以稳定，得到Ft，在激活光存在下打开单饱和光(a saturating flash of light,持续800ms,光强为 6000μmol/m2 s)脉冲一次，与此同时，测量光脉冲频 率变为20KHz，得最大荧光值Fm。 • 6、等曲线回落下来并达到稳定，关闭激活光，再关闭 测量光。记录Fo,比率(Fm一Fo）/Fm=Fv/Fm,光饱和曲 线等。
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥啊，这可是个挺有意思的事儿呢！咱就一步步来瞧瞧。
首先呢，你得有拟南芥，这就好比做饭得有食材呀。
得挑那些长得
健康、精神的拟南芥植株。
然后呢，你得想好要转进去啥基因，这就
跟你决定给菜加啥调料一样重要。
接下来就是关键步骤啦！得把你想要的基因给弄出来，这可不是随
随便便就能做到的哦。
就好像从一堆宝贝里精准地挑出你最想要的那
一个。
挑出来基因后，还得找个合适的载体，让这个基因能跟着载体一起
进入拟南芥里。
这载体就像是一辆小车子，载着基因去它该去的地方。
然后呢，就是把带着基因的载体和拟南芥凑到一块儿啦。
这可不是
简单地放一起就行，得用一些特别的方法，就好像要把钥匙插进锁孔里，得找对角度和力度。
等基因进去了，还得让拟南芥好好长一长，看看基因是不是真的转
进去了。
这就跟等菜做好了，尝尝味道对不对一样。
哎呀，你说这过程是不是挺复杂的？但这也是科学的魅力所在呀！
每一步都得小心翼翼，就跟走钢丝似的。
要是有一步出了错，那可能
就前功尽弃啦。
你想想，要是能成功地把想要的基因转到拟南芥里，那多有成就感啊！就好像你自己创造了一个小小的奇迹。
而且这转基因拟南芥用处可大啦！可以帮助我们研究基因的功能，可以让我们更好地了解植物的生长发育，还能为农业生产带来新的希望呢！
总之呢，转基因拟南芥虽然步骤多，过程复杂，但只要你有耐心，有细心，就一定能做好。
你说是不是呢？可别小瞧了这小小的拟南芥哦，它里面蕴含着大大的科学奥秘呢！。
拟南芥隐性抗盐单基因突变体的筛选与鉴定
郭美丽：拟南芥隐性抗盐单基罔突变体的筛选与鉴定１．１２４抗氧化防御系统的活性Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ等ｐ“提出的自由基伤害学说，已广泛削于需氧生物细胞伤害机理的研究。
二十世纪８０年代以后，人们对盐分胁迫Ｆ植物体内抗氧化防御系统进行了大量的研究，并己确定它由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、过氧化氢酶（ｃＡＴ）和抗坏血酸（ＡｓＡ）等，它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害，而单一的抗氧化酶不足以防御这种氧化胁迫。
如ＳＯＤ催化两个超氧自由基发生歧化反应形成０２和Ｈ２０２，Ｈ２０２再被ＰＯＤ和ＣＡＴ催化除掉。
在整个氧化防御系统中，ＳＯＤ是所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧化酶。
根据结合金属离子的不同，ＳＯＤ可分为Ｃｕ／Ｚｎ—ＳＯＤ，Ｍｎ．ＳＯＤ和Ｆｅ—ＳＯＤ３种类型，Ｃｕ／Ｚｎ－ＳＯＤ主要存在与叶绿素和细胞质中，Ｍｎ．ＳＯＤ主要存在于线粒体中，Ｆｅ—ＳＯＤ主要存在与叶绿体中【３“。
一般来讲，在盐分胁迫下，植物体内的ＳＯＤ等酶活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关，而且在盐分胁迫下，盐生植物与非盐生植物相比，其ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ活性更高，因而更能有效地清除活性氧，阻抑膜质过氧化。
此外，在盐胁迫下，植物体内的某些过氧化物质，如抗坏衄酸也有清除体内自由基的生理功能。
刘婉等ｐ…认为，离体小麦叶片在盐胁迫加强条件下，体内抗坏血酸含量下降，用活性氧清除剂处理可明显缓解抗坏血酸含量下降，且外源抗坏血酸能明显缓解由盐胁迫造成的对细胞膜的伤害，降低ＭＤＡ含量，提高叶绿体的Ｈｉｌｌ反应活力、叶片光合速率和叶片线粒体呼吸速率。
可见ＳＯＤ和抗氧化物质等自由基清除系统对保护膜结构，提高植物耐盐性有～定作用。
１１．２．５盐胁迫蛋白研究发现，植物在盐胁迫Ｆ，体内合成一些新蛋白称为应激蛋白或胁迫蛋白，而且证明某些应激蛋白与植物的抗盐性有关。
Ｎ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ【４０】等首次报道了，在烟草盐适应悬浮细胞中存在盐胁迫蛋白，此后又发现在烟草、苜蓿、玉米、甜菜等许多作物中存在盐胁迫蛋白，而且尤以分子量为２６ｋＤ蛋白质的含量显著，可占总蛋白的１０％～１２％，且增加量与总蛋白置呈正相关Ｈ”。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Step 1. 打开NCBI主页：
打开的页面如下：
如下
得到如下页面：
进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：
记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因
接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。
但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法
它的搜索界面一目了然,使用也很方便。
下面介绍SALK突变体库的使用方法：
Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中
从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向)
点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。
祝实验顺利！
T-DNA Primer Design
( Powered by GEBD )
Please use the backup page served by AtTA, if the tdnaexpress server is down.
The new T-DNA Primer Design Tool is now powered by Genome Express Browser Server (GEBD). The new tool can return the primers faster, and also give the insertion location information, the estimated T-DNA confirmation product size, as well as primer3-like format output. (July 28, 2005)
Important Change: Now the RP is always on the side of the flanking sequence, that is, RP is always on the 3' end of the insertion. Therefore, the PCR reaction should always be set up as LB+RP for HM and LP+RP for WT. (Feb. 04, 2005)
1. Protocol for SALK T-DNA primer design
Note:
N - Difference of the actual insertion site and the flanking sequence position, usually 0 - 300 bases MaxN - Maximum difference of the actual insertion site and the sequence, default 300 bps
pZone - Regions used to pick up primers, default 100 bps
Ext5, Ext3 - Regions between the MaxN to pZone, reserved not for picking up primers
LP, RP - Left, Right genomic primer
BP - T-DNA border primer LB - the left T-DNA border primer
BPos - The distance from BP to the insertion site
LB - Left border primer of the T-DNA insertion:
>LBb1 of pBIN-pROK2 for SALK lines
GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
> (Newly used by Salk Genotyping Project and with better results)
ATTTTGCCGATTTCGGAAC
>LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines
TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
>LB_6313R for SALK lines
TCAAACAGGATTTTCGCCTGCT
>LB1 for SAIL lines C/418-451 of pCSA110-pDAP101_T-DNAs
GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC
> >LB2 for SAIL lines C/390-423 of pCSA110-pDAP101_T-DNAs
GCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACA
>LB3 for SAIL lines C/350-383 of pCSA110-pDAP101_T-DNAs
TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC
To download SAIL pCSA110 & pDAP101 T-DNAs.
By using the three primers +LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion) should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of . However, the protocol requires the
same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.
You can set up two paired reactions, LP+RP and LB+RP. You should get a product in the LP+RP reaction for WT or HZ lines or get blank for HM lines, while get a band in the LB+RP for HM or HZ lines.。