拟南芥种植及处理基本方法

1 培养基

MS培养基（Sigma公司）

B5培养基（pH 5.5）

改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）：

2 植物材料的常规种植

拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌

发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 o C，

16/8 h的光照培养间中生长。

3 拟南芥种子的表面灭菌处理

1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天。

2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。

3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。

4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。

5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。

6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。

7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。

4 植物材料的水培体系

拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。

水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。

5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法

到网站/tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RP

T-DNA LB：LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT

LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG

用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP＋RP，BP＋RP扩增基因组DNA。

方法：

1)将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭

石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。

2)DNA提取缓冲液的配制：

3)剪取一片叶于1.5 ml Eppendorf管中，液氮充分研磨。

4)加40 μl 提取缓冲液，涡旋充分混匀。

5)95℃中水浴20分钟，间或混匀几次。

6)12,000 rpm离心15分钟。

7)吸取上清于一新的Eppendorf管，取10 μl稀释50倍。然后取稀释后的DNA

用于PCR扩增。

PCR扩增体系为（25 μl体系）：

PCR反应程序：