拟南芥种植及处理基本方法
[转载]拟南芥培养
![[转载]拟南芥培养](https://img.taocdn.com/s3/m/d965915f68eae009581b6bd97f1922791688bed3.png)
[转载]拟南芥培养一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。
MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm 的培养皿用12.5ml。
加培养基时先将凝固的培养基用微波炉高温5分钟左右至全部解冻，然后慢慢冷却至不太烫手时倒板，如要加潮霉素等抗生素也是在此次加，加入后摇匀然后倒板。
倒板后至自然冷却即可铺种，如水分较多或板不够硬，亦可于倒板后将培养皿盖打开晾10分钟左右（此时超净台要关闭）。
种子的杀菌、清洗、铺板等过程在超净工作台上无菌操作，操作者进入超净工作台要用酒精棉球擦拭手、器具、超净台，防止感染细菌、真菌。
二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。
这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。
现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／LKI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／LFeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／LⅣA肌醇 20 000ⅣB烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸 400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。
拟南芥种植方法.doc
培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。
1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。
1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。
土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。
2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。
（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。
4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。
浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。
当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。
开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。
实验室拟南芥常用种植方法
贮存过程中影响种子寿命的主要是温度和含水量。温度越高，含水量越多，则种子寿命 越短。因此刚采集的种子必须要经过干燥才能保存。最安全的种子干燥的方法是将采集的种 子置于干燥环境下，在室温条件下放置 2-3 周便可。
种子的贮存可根据贮存的目的不同，分为短期、中期、长期贮藏。一般短、中期贮藏是 将种子贮存在 4℃，而长期贮藏是保持在-20℃温度下。当取用长期贮藏的种子前，先将贮 存种子的容器预热到室温，或者将其置于 37℃水浴 10min，以尽量使冰害降至最低。为了 及时了解贮存过程合适与否，一般对种子定期进行生活力测定，而种子发芽率是测定其生活 力的最佳选择。
拟南芥实验室的常用种植方法刘金亮西北师范大学生命科学学院730070摘要拟南芥由于其生活周期短种植和生长不受季节限制并且为自花受粉植物而作为实验最常用的模式植物因此拟南芥如何能够在实验室较好较快地生长便成为实验成败的关键由于拟南芥存在多种生态性各实验室均有各自适合栽培种植的方法如在土壤石英砂琼脂等均可种植但土壤种植种子萌发率低生长过程中受其它方面影响大故本方法重点介绍利用琼脂无菌培养基培养幼苗和移植相结合的方法来快速种植拟南芥该过程主包括种子的处理琼脂无要菌培养基上种子的培养和幼苗的移植以及成熟后种子的保存
过厚或过薄。过薄，点种子后水分蒸发快，培养基有可能干涸；过厚，种子发芽后，有可能 使叶子浸入平板中，影响幼苗后期发育并且过厚平板易开裂。
1.2 种子处理 1.2.1 种子消毒处理
在培养基中点样前，必须对对钟子进行消毒，防止感菌，具体方法为：利用 1%Naclo 浸泡 10min，离心后，倒掉 Naclo，然后用无菌蒸馏水洗涤 5-6 遍，时间间隔为 1min，注意 的是 Naclo 浓度不易过高和种子处理时间不易过长，有可能伤害种子。
拟南芥植物组织培养
拟南芥植物组织培养 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。
方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。
消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。
方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。
二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。
（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。
糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。
如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。
）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。
（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。
MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。
（如不行，可适当添加琼脂）。
四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。
3天后即可取材用于器官离体再生实验。
萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。
拟南芥种植及处理基本方法
1 培养基MS培养基（Sigma公司）B5培养基（pH 5.5）改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）：2 植物材料的常规种植拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。
置于23 o C，16/8 h的光照培养间中生长。
3 拟南芥种子的表面灭菌处理1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天。
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。
3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。
4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。
5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。
6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。
7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。
4 植物材料的水培体系拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。
水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。
培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。
将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。
塑料膜覆盖，2-3天后揭去。
整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。
5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法到网站/tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RPT-DNA LB：LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACTLBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG用于PCR扩增。
采用双引物法，分别用LP＋RP，BP＋RP扩增基因组DNA。
方法：1)将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。
2)DNA提取缓冲液的配制：3)剪取一片叶于1.5 ml Eppendorf管中，液氮充分研磨。
拟南芥种植方法
培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。
1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。
1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。
土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。
2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。
（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。
4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。
浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。
当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。
开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。
拟南芥种植
拟南芥种植方法
一．拟南芥生长条件
拟南芥生长的适宜温度白天为22-24℃左右，夜温最好比日温低2℃。
拟南芥在日照长于12小时下才会开花，一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳，土壤湿度70%—80%，营养土：蛭石=1：1，3—4天浇一次营养液，从底盘浸入。
二．种子处理
1.取适量种子置于标记好的1.5ml离心管中，加入1 ml 70％乙醇轻微振1 min；
2.去乙醇，加入1 ml体积分数为10％的NaClO (次氯酸钠), 消毒5~10 min；
3.吸去NaClO, 用无菌水冲洗种子5次后, 加入600μl无菌水；
4.取适量拟南芥种子至10 ml 离心管中，加入0.05%的琼脂悬浮，置于4℃冰箱低温春化处理2-3 天。
三．土壤培养
将已春化处理的拟南芥种子，用消过毒的牙签或者移液枪将种子，点播在土壤中，一盆2—3颗即可，将花盆放入有水的底盘中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来，待花盆中的基质湿透后即可点播。
用保鲜膜覆盖1-2天后揭膜，如果苗很弱，则在此基础上还需多覆盖1天。
当到4叶期时，要适当移苗，每盆一株。
小心轻轻用镊子拨开周围土壤，连根取出小苗（注意不要伤害根部）。
苗期不使用营养液，移栽后3-4天使用一次营养液，期间视情况浇水，但不要在底盘中始终保持水层。
在开始收籽期,不再需要过多的水分，可保持底盘干燥，此时每隔7-10天加一次水即可。
在种荚变黄，变干时可以收籽。
将种子抖落在纸上，用金属滤网过一下以除去杂质，将种子装入写了标记的小纸袋中，放于干燥的环境中让种子进一步干燥后，封存于1.5ml试管中，切记越干越好，长期保存的种子必需要干燥保存到4℃。
拟南芥培育方法
拟南芥培育方法—通用指南一、原理拟南芥作为高等植物的模式生物被全世界的植物生物学实验室广泛研究。
然而，照顾好这种小植物可能不是那么容易。
这里介绍一个马里兰大学帕克学院的HevenSze实验室的通用指南。
Sze实验室及其他实验室的成员为建立这个在实验室培育拟南芥的通用指南做出了许多努力。
二、步骤1. 准备种植用土我们使用Miracle-Gro混合土（2立方英尺一袋）与Miracle-Gro珍珠岩（8夸脱一袋）来培养拟南芥，在一个可以放下2袋混合土的大容器中和土，1袋混合土（2立方英尺）混入半袋珍珠岩（4夸脱）。
注意：Sze实验室在装土之前经常将土灭菌！（方法如下）（1）将干土放入灭菌容器中，直至与顶部相差一英寸，将土拍实。
（2）用铝箔纸将容器封住，在每一个容器上放一张灭菌用胶带，缠好。
确保容器外没有土，放入灭菌锅。
（3）用常规/秒速/快速模式灭菌30~50 min，灭菌模式及时间取决于灭菌的容器数量。
（4）当温度降至室温，将土放入花盆，轻轻压实。
记住将灭菌土保存好，避免种子或菌类污染。
灭过菌的土至少可以使用两星期，如无需要请不要多次灭菌。
（5）将花盆用去离子水浸没（不要超过土表面）用humidomes覆盖，使其吸水3-6小时或过夜。
吸水后应该还保存约1英寸高的水，如果没有请添水。
（6）此时的土可以用于种植拟南芥。
2. 种子消毒方法A（1）取适量种子（野生型、突变体或互补株系）置于一个EP管中，加1 ml 消毒溶液。
消毒溶液：20%Chlorox消毒液0.05%Tween-20用新灭过菌的无菌水配制。
（2）用振荡器以最大速度震荡20-30秒。
（3）放置7-10 min，偶尔震荡一下。
（4）8 000 rpm 离心5秒。
（5）仔细将水倒出。
（6）加1 ml 无菌水，震荡重旋种子。
（7）8 000 rpm 离心5秒，倒去上清。
（8）重复步骤6-7，重复四次。
（9）将灭菌的种子移到底部铺有无菌滤纸的小Fisher盘（100×15 mm）中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
培养基
MS培养基 (Sigma公司)
B5培养基 (pH 5.5)
Content mg/L Content mg/L Content mg/L
KNO3 2500
ZnSO47H2O 2.0
Nicoti nic
1
CaCl22H2O 150 H3BO3 3.0 Thiami ne HCl 10 MgSO47H2O 250 KI 0.75 Pyri ndox ine 1 NaH2PO4'H2O 150 Na2MoO42H2O 0.25 m-I no sitol 100 FeSC47H2O 27.8 CoCl26H2O 0.025 Glyci ne 200 MnSO4H2O 10 Na2EDTA 37.3 Ki netin 0.1 CuSO45H2O 0.025 IAA 0.1-1
改良的1/4 Hoagland 培养液(mM, pH6.0):
Content mM Content mM
KNO3 1.25
Zn SO40.002
Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050
MgSO40.75 KCl 0.050
KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7°24 0.075
FeSq
0.072 CuSO40.0015
Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1
2植物材料的常规种植
拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌
o
发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。
置于23 C，16/8 h的光照培养间中生长。
3拟南芥种子的表面灭菌处理
1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟
3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。
4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。
5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。
6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。
7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。
4植物材料的水培体系
拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/ 皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。
水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。
培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagla nd培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。
将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。
塑料膜覆盖，2-3天后揭去。
整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换
一次培养液。
5拟南芥T-DNAS入突变体的筛选方法
到网站输入salk号设计引物LP、RP
T-DNA LB : LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
用于PCR扩增。
采用双引物法，分别用LP + RP, BP+ RP扩增基因组DNA
方法:
1）将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。
2） DNA提取缓冲液的配制：
Genome\ /Flankira SaaiifincfiL
Pa
N
pZme Exl5Ext3pZcne
EPa
w
3）剪取一片叶于1.5 ml Eppendof管中，液氮充分研磨。
4）加40 I提取缓冲液，涡旋充分混匀。
5） 95C中水浴20分钟，间或混匀几次。
6） 12,000 rpm 离心15 分钟。
7）吸取上清于一新的Eppendof管，取10 I稀释50倍。
然后取稀释后的DNA 用于PCR扩增。
PCR扩增体系为（25 l体系）：
PCR反应程序:。