蛋白质组学常见问题
蛋白质组学质谱问题个人总结
1.色谱柱中为什么极性大(盐)的组分要用极性较大的溶剂洗脱吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。
当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。
当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。
对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大，吸附能力就愈高，但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。
供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种，本实验选择中性氧化铝。
化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强。
对氧化铝的吸附性递减：酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >烯 > 饱和烃。
先将要分离的样品溶于一定体积的溶剂中，选用的溶剂极性要低，体积要小。
如有的样品在极性低的溶剂中溶解度很小，则可加入少量极性较大的溶剂，使溶液体积不致太大。
色层的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。
然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来.2.反相色谱，是非极性固定相和极性流动相，用于分离非极性或者弱极性物质。
我想请教的是，如果流动相极性偏大，是不是分离效果不好？还有就是如果分离度不好，加大水的比例，延长保留时间，会不会影响到分离效果？对于液相色谱分离，影响因素多，有两点因素最影响分离，第一是物质与流动相的极性，第二个叫洗脱能力:出峰快与慢以及分离效果，用极性来理解出峰顺序，反相色谱一般使用强度因子来表示，一般极性参数大的，强度因子就小，但甲醇与乙腈比较特殊，极性参数甲醇与乙腈分别为5.1与5.8，强度因子却是甲醇3.0，乙腈3.2。
临床蛋白质组学 缺失值
临床蛋白质组学缺失值
在临床蛋白质组学中，缺失值是指在蛋白质组数据集中缺少的值。
缺失值可能是由于实验技术的限制、实验操作的不确定性或者数据处理过程中的错误等原因导致的。
缺失值在临床蛋白质组学中是一个常见的问题，因为蛋白质组学技术本身的复杂性和挑战性。
处理缺失值的正确方法对于准确分析和解释蛋白质组数据非常重要。
下面是一些常见的处理临床蛋白质组学中的缺失值的方法：
1. 删除缺失值：简单粗暴地将含有缺失值的样本或特征删除。
这种方法适用于缺失值占比较小的情况，但可能会导致数据的损失和偏差。
2. 填充缺失值：使用一些统计方法来估计缺失值。
填充方法可以包括均值填充、中位数填充、众数填充、回归填充等。
这种方法可以保留更多的数据信息，但可能会引入估计偏差。
3. 插值方法：使用插值方法来填充缺失值，如线性插值、多项式插值、样条插值等。
这种方法可以更准确地估计缺失值，但对数据分布假设要求较高。
4. 缺失值模型：建立更复杂的模型来估计缺失值。
例如，可以基于其他特征来预测缺失值，使用机器学习方法或深度学习方法等。
这种方法可以更精确地估计
缺失值，但计算成本较高。
在选择处理缺失值的方法时，需要根据具体数据集的情况和研究问题的要求来决定。
同时，还需要注意处理缺失值可能引入的偏差和不确定性，以及对结果解释的影响。
蛋白质组学研究基本策略
蛋白质组学研究基本策略蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质的总体组成、结构和功能的一种科学研究方法。
由于蛋白质是生物体内最重要的基本构建单元之一，它们在细胞代谢、信号传递、基因表达调控、代谢调节、免疫防御等方面发挥着重要的作用。
近年来，随着高通量分析技术的应用和发展，蛋白质组学研究已成为生命科学研究的重要分支之一，它可以帮助我们更加深入地了解生物体的生理和病理过程，为生物医学和生物技术的研究提供了强有力的工具支持。
蛋白质组学的基本策略主要涉及样品处理、蛋白质分离、蛋白质质量鉴定和蛋白质表达谱分析等方面，下面我们将对这些方面进行详细介绍。
一、样品处理样品处理是蛋白质组学研究中非常重要的环节之一，它直接关系到后续的蛋白质分离和鉴定结果。
样品处理的目的是将样品中的蛋白质分离出来，同时去除其中的其他干扰物和噪声。
在样品处理过程中，有一些重要的指标需要考虑，比如选择合适的裂解方式、针对不同类型样品采用不同的前处理方法、去除样品中的盐、肉眼可见颗粒等物质，同时也需要进行蛋白质质量的检测，确保样品中蛋白质的浓度和完整性。
二、蛋白质分离在样品处理之后，需要对样品进行蛋白质分离。
蛋白质分离的目的是将样品中的蛋白质获得比较纯净的组分，并使蛋白质真实且广泛地表达。
蛋白质分离的方法很多，其中电泳是一种非常常用的方法，它可以通过不同的电泳技术和硅胶柱层析技术将复杂的蛋白质混合物分离成单独的组分。
电泳的种类包括：SDS-PAGE、二维电泳等等。
在蛋白质分离过程中，还需要注意分离后蛋白质组分的集中度、分辨度，并进行蛋白质谱图的理解。
三、蛋白质质量鉴定鉴定蛋白质的质量是蛋白质组学研究的核心步骤之一。
蛋白质质量的鉴定可以通过不同的方法来实现，比如西方印迹、MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS等技术。
这些技术不仅可以鉴定蛋白质的分子量、差异分子、台阶分子等特点，还可以分析蛋白质的化学性质、生理功能等方面的信息。
四、蛋白质表达谱分析蛋白质表达谱的分析是利用上述鉴定方法，对大规模蛋白质样品进行分析，并确定不同样品蛋白质谱图的变化趋势，从而揭示蛋白质数量和质量的组成成分比例。
蛋白质表达研究中的难点和挑战
蛋白质表达研究中的难点和挑战蛋白质是生物体中不可或缺的组成部分，它们在细胞中扮演着重要的功能角色。
研究蛋白质表达，即在生物体内合成蛋白质的过程，是生物医学科学领域中的一个重要研究方向。
然而，在进行蛋白质表达研究时，研究人员面临着一些难点和挑战。
本文将介绍蛋白质表达研究中的一些常见难点，并探讨如何应对这些挑战。
一、蛋白质结构复杂多样的挑战蛋白质的结构复杂多样，包括氨基酸序列、三维结构以及其所处的细胞环境等。
对于研究人员来说，了解蛋白质结构对于准确表达目标蛋白质至关重要。
然而，确定蛋白质的准确结构是一项相当困难的任务。
许多蛋白质的结构尚未被完全解析，或者存在变异和异常表达。
这为蛋白质表达研究带来了挑战，需要针对具体蛋白质结构的特点进行设计和优化。
二、蛋白质表达的低产量和不稳定性在蛋白质表达中，研究人员常常面临低产量和不稳定性的问题。
很多目标蛋白质在表达时难以得到足够的产量，甚至无法进行充分表达。
此外，有些蛋白质在表达过程中容易失去折叠或聚集成大量的非功能性物质，从而难以获取纯净的目标蛋白质。
这些问题不仅会延长研究时间，还会增加实验的复杂性和成本。
因此，提高蛋白质表达的产量和稳定性是一个重要的挑战。
三、选择适合的表达系统在蛋白质表达研究中，选择适合的表达系统是一个关键的决策。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
不同的表达系统具有各自的特点和优势，因此选择合适的表达系统对于获得高效的目标蛋白质表达至关重要。
然而，确定适合的表达系统需要综合考虑蛋白质的生理特性、表达需求以及其它实验条件的限制。
这需要研究人员具备丰富的经验和专业知识。
四、后续处理和纯化的困难蛋白质表达的成功并不意味着表达的蛋白质已经满足研究的需求。
在蛋白质表达后，研究人员需要进行后续的处理和纯化步骤，以获得纯净的目标蛋白质。
这些步骤通常包括分离、浓缩、纯化和结晶等过程。
然而，这些步骤可能会影响蛋白质的结构和功能，导致实验结果的偏差。
蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学的研究方法蛋白质组学是运用先进的分析技术，通过对细胞内的蛋白质分子进行检测、分离、同位素标记与定量等方法，研究不同细胞型、组织型、发育阶段以及病变状态等生物样本中蛋白质组成及其功能性调控的科学。
它是一门综合性学科，既涉及生物化学、蛋白质工程、分子生物学等学科，也涉及信息学及计算机科学等学科，运用了各种生物学技术和数学模型，将复杂的生物体蛋白质组织成一个有机的整体，从而更好地了解蛋白质的结构与功能关系。
蛋白质组学的研究方法主要包括：一、蛋白质分离与鉴定：蛋白质分离是蛋白质组学的基础步骤，其目的是从生物样本中提取蛋白质。
常用的技术包括凝胶电泳、膜分离、微萃取、液相色谱法以及离心分离等。
蛋白质分离之后，还需要进行鉴定，以获得蛋白质的名称及其细胞定位等信息，以便进行后续研究。
常用的方法包括凝集试验、蛋白质印迹、Western blotting、质谱分析以及二级结构分析等。
二、定量蛋白质组学：定量蛋白质组学是指利用有效的检测技术，对生物样本中的蛋白质进行定量分析，以便获得蛋白质组成及其功能性调控情况的精确信息。
定量蛋白质组学技术主要包括酶标记蛋白质定量、质谱定量以及流式细胞蛋白质定量等。
三、蛋白质组学的应用：蛋白质组学的研究结果可以用来研究基因调控、细胞信号转导、疾病机理等方面的问题。
它可以帮助研究人员更好地理解生物的复杂性，并为有效的治疗策略的制定提供重要的参考和指导。
它还可以用于研究新型药物的研究和开发，为疾病的治疗提供新的思路。
蛋白质组学的发展前景广阔，它不仅可以用于解决当前生物学上的实际问题，还可以为未来的研究提供重要的科学研究基础。
随着技术的进步和数据量的增加，蛋白质组学技术将会为生物学研究带来更多的惊喜和发现。
蛋白质组学常见问题
HPLC 篇1 ． HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足：解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多：调整衰减即可。
检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。
检测池中有气泡：解决办法为排气。
记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。
流动相流量不合适：调整流速即可。
检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
2 ．做 HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在? 如何解决?原因可能有： ?泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；比例阀失效，更换比例阀即可。
泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；系统检漏，找出漏点，密封即可。
梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
3 ．我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高，请问为什么?柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。
将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子， ( 此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性 ) 。
这时，如果柱压仍不下降，再检查；更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
4 ．液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
蛋白质组学 数据预处理
蛋白质组学数据预处理简介蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质的总体组成、结构和功能的科学领域。
在蛋白质组学研究中，数据预处理是非常重要的一步，它涉及到对原始数据进行清洗、校正和标准化等操作，以确保后续分析的准确性和可靠性。
本文将详细介绍蛋白质组学数据预处理的流程和方法，并提供一些常用的工具和技术。
数据清洗数据清洗是蛋白质组学数据预处理的第一步，其主要目标是去除无效或错误的数据，以提高后续分析的可信度。
缺失值处理在实际应用中，蛋白质组学实验往往会产生大量的缺失值。
缺失值可能是由于实验操作、仪器故障或其他原因导致的。
处理缺失值时，可以采取以下几种常见方法：1.删除含有缺失值的样本：如果某个样本中存在大量缺失值，可以考虑将该样本从分析中删除。
2.删除含有缺失值的特征：如果某个特征在大部分样本中都存在缺失值，可以考虑将该特征从分析中删除。
3.填充缺失值：对于某个特征中的少量缺失值，可以使用插值法（如均值、中位数或回归模型）来填充。
异常值处理异常值是指与其他观测值明显不同的数据点。
在蛋白质组学数据中，异常值可能是由于实验误差、技术问题或其他原因导致的。
处理异常值时，可以采取以下几种常见方法：1.删除异常值：如果某个观测值明显偏离其他观测值，可以考虑将其删除。
2.替换异常值：对于某个观测值较为极端但仍具有一定意义的情况，可以考虑用均值、中位数或其他合理的替代值来代替异常值。
数据标准化数据标准化是将原始数据转化为具有统一尺度的数据，以便后续分析和比较。
在蛋白质质谱数据中，常见的标准化方法包括：1.最大最小归一化：将数据线性映射到[0, 1]区间内。
2.Z-score标准化：通过计算数据与其均值之间的差异，并除以标准差，将数据转化为标准正态分布。
3.小数定标标准化：将数据除以一个固定的基数，如10的幂次，以确保数据位于[-1, 1]或[0, 1]区间内。
数据校正数据校正是蛋白质组学数据预处理的第二步，其主要目标是消除由于技术偏差、仪器漂移或其他原因导致的系统误差。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
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HPLC 篇1 ． HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法样品量不足：解决办法为增加样品量样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器检测器衰减太多：调整衰减即可。
检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。
检测池中有气泡：解决办法为排气。
记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。
流动相流量不合适：调整流速即可。
检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
2 ．做 HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在? 如何解决?原因可能有： ?泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；比例阀失效，更换比例阀即可。
泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；系统检漏，找出漏点，密封即可。
梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
3 ．我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高，请问为什么?柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。
将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子， ( 此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性 ) 。
这时，如果柱压仍不下降，再检查；更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
4 ．液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
存在干扰峰，解决办法为使用较长柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。
双向电泳篇1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？一般情况下是可以的。
但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。
所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。
为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。
由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。
如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。
为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。
3. 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？电流的平方和功率成正比。
电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。
当温度超过30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
4. 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。
所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。
由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。
当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的pH 区域移动。
5. 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。
溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。
溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
6. 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
7. 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。
这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
8. 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。
这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。
双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。
当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。
而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。
而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。
也可以用体系内已知蛋白来做比对。
11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。
竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。
12. 什么成分会影响 2D 胶的效果？核酸，盐，去垢剂等等。
13. 2D 胶的上样量应该在什么范围？上样量和样品有关。
样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。
一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。
14. 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？蛋白质的浓缩有很多方法。
大致有超滤法，沉淀法和透析法。
超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。
它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。
另外超滤对样品的要求比较高。
甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。
沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。
缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。
沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。
使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。
透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。
透析法可以和超滤法联用。
先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
酶解篇1. 用 Trypsin 酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？酶解时碳酸氢氨的浓度一般在 10 ～ 50 mM 之间。
碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的水解环境，因为 Typsin 的活力在 pH8 ～ 9 之间最高。
最常用的碳酸氢氨浓度有 20 mM ，40 mM 。
盐浓度过大时，后续的冻干过程中会有较多的盐析出；盐浓度过小时，则不能有效的提供碱性 pH 的水解环境（尤其是在样品的 pH 值低，而且体积大时）。
为了确定酶解体系的 pH 值，可以用2. Trypsin 储存液的作用是什么？Trypsin 在 pH8 ～ 9 活力最高，所以为了防止酶的自水解， Trypsin 母液要处于一个酸性的环境里以便长期保存。
Trypsin 储存液的 pH 大约是 5.3 ，是用来稀释母液用的。
如果所需的酶量较大，可以直接用碳酸氢氨溶液来稀释母液。
如果酶解的样品少，可以用储存液来稀释，这样剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。
3. Roche 的酶和 Promega 的酶，那个更好？Roche 的酶有自降解，而 Promega 的酶基本上没有自降解。
由于酶的自降解峰可以用来做很好的内标，所以一定限度的酶自降解对 MALDI 数据的校准很有帮助。
4. 什么情况下需要用 Ziptip 来处理样品？当样品含有大量的盐时，需要用 Ziptip 来除盐；当样品量很少，但体积比较大时（ 20 微升以上）时，需要用 Ziptip 来浓缩。
如果样品中有甘油， SDS ，或其他杂质时， Ziptip 的使用要格外当心，在这种情况下， Ziptip 的填料容易被杂质堵塞；另外 Ziptip 使用不当时，样品会有损失。
所以当样品比较珍贵（的来不易）时，最好先用其他样品做预实验，摸顺条件后，再作真正的样品。
MALDI 篇1. 怎样邮寄我的样品？冻干的胶或干粉可以直接邮寄。
切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在 EP 管中 ( 不加任何缓冲液 ) ；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。
液体样品的邮寄方式同湿胶一样。
2. 为什么要使用内标？用内标做校准可以大大减少MALDI-MS 的误差（<70ppm ），从而提高查库结果和可靠性。
好的内标肽段需要有以下的要求：最好有两个肽（两点一线）；质量不要在大多数的肽段范围内（ 1200 ～ 2500 Da ）；内标的量要与样品的量成比例；内标对其他肽段离子化的抑止要小。
我们实验室使用的内标是 25fmol 的——和——。
不过，一般情况下，使用外标做校准也可以达到比较满意的数据（ <150ppm ）。
所以，顾客可以根据自己的需要来选择是否使用内标。
3. 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供 (exact) 对照两块胶？正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。
负对照（空白胶）主要是看样品是否有污染（比如角蛋白的污染）；正对照（已知胶，比如同一块胶上的标准蛋白）主要是检测酶解和质谱的效果是否正常。
如果客户不能提供正负对照，我们可以使用自己预先准备的胶条。
如果顾客的样品量大（ >10 个 2D 胶上的点），则顾客必须提供正负对照。
4. 对于胶上蛋白质的鉴定，我应该提供多少蛋白质？一般情况下，考染能看得见的点都有机会鉴定出来。
分子量在 2 － 5 万之间的蛋白质，鉴定成功率一般比较大。
分子量小的蛋白酶切位点少，合适的肽段（ 1000 ～ 3000 Da ）就少，所以鉴定的成功率相对较低。
而分子量太大的蛋白质，在同等质量的情况下，蛋白的摩尔数 (pmol) 较少；而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低（因为整个蛋白质较大），从而影响鉴定的成功率。
5. 为什么我的 MALDI 图谱中都是相差 44Da 的峰，肽段的峰则全被抑制了？相差 44Da 的峰可能是 Triton X 峰，也可能是 polymer （ -CH2CHOH- ）峰。