第二章动物细胞培养
高中生物选择性必修三 学习笔记 第2章 第2节 第1课时 动物细胞培养
第2节动物细胞工程第1课时动物细胞培养[学习目标] 1.阐明动物细胞培养的条件和过程。
2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。
一、动物细胞培养的条件和过程1．动物细胞工程(1)常用技术：动物细胞培养、________________和________________等。
(2)基础：________________。
2．动物细胞培养(1)概念：从动物体中取出相关的组织，将它分散成________，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞__________和__________的技术。
(2)培养条件①营养a．合成培养基：将细胞所需的________(糖类、氨基酸、无机盐、维生素等)按________和_____ ________严格配制而成的培养基。
b．天然成分：使用合成培养基时，通常需要加入________等一些天然成分，原因是__________ _________________________。
c．培养动物细胞一般使用______________，也称为________。
②无菌、无毒的环境a．对培养液和所有培养用具进行________处理。
b．在________环境下进行操作。
c．培养液需定期________，以便清除________，防止细胞代谢物________对细胞自身造成危害。
③温度、pH和渗透压a．温度：以36.5 ℃±0.5 ℃为宜。
b．pH：以pH为________为宜。
c．适宜的渗透压。
④气体环境a．组成：动物细胞培养所需气体主要有________和________。
b．不同气体的作用O2：________________________。
CO2：________________________。
c．培养容器：通常采用________或________。
d．培养仪器：含有________________的混合气体的____________。
(3)培养过程①②过程(4)相关概念①细胞贴壁：悬液中分散的细胞往往______在培养瓶的瓶壁上。
第2节 动物细胞培养技术
传代培养技术过程 注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻， 以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白 酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用 Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 制备细胞悬液：用吸管吸取营养液轻轻反 复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离。 6. 计数后，分瓶置温箱中培养。
原 代 培 养 传 代 培 养
Ⅳ、大规模培养技术 悬液培养，使用微球载体 在液体培养体系中加入一定量的微球载 体，让培养细胞贴壁在载体上。待细胞培养
到一定量时再将细胞消化下来转入转代培养。
(2)组织消化培养技术 离心、计数：500-1000rpm、5min；倒置显微镜 下计数（单层覆盖瓶底）。 培养：向合成培养基上接种消化后的单层细 胞，于37°C、CO2培养箱（瓶塞用透气 无菌棉塞）中培养。 监控：1-2天后镜检（细胞形态）；培养液pH值 （正常呈桃红色，pH7.2-7.4；若发黄 说明偏酸，更换培养液）
期稳定的传代培养后还会产生一些变异.
二、体外培养细胞基本技术
体外培养特点
体外培养工具 体外培养条件 体外细胞生长增殖过程 培养方法 大规模培养技术
（一）体外培养特点
1.营养条件苛刻 除一般的营养物质外,还要血清. 2.适应性差, 对环境敏感 包括对PH、溶解氧、二氧化碳等。 3.培养时间长，易污染 主要是生长缓慢;显著的污染是培养基的 PH迅速改变.
第二节 动物细胞培养技术
一、 动物细胞培养的特点 （一）动物细胞特点 无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 培养中需氧量少，对搅拌敏感 多以聚集体存在 原代细胞培养50代即开始退化 细胞连接复杂
（二） 动物细胞培养定义
动物细胞与组织培养是从动物体内取出
细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无
2.2.1动物细胞培养(教师版)
《第2章细胞工程》第2节动物细胞工程一动物细胞培养必会知识考点梳理拓展延伸易错警示必会知识一动物细胞工程和动物细胞培养1．动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
2．动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。
(1)相关组织：一般是指动物胚胎或出生不久的幼龄动物组织，因为这些组织细胞比老龄动物的组织细胞生命力旺盛，易于培养，同时增殖能力也更强。
(2)适宜的培养基：不同的细胞、组织适合生存的环境不同，需要配制不同的培养基。
3．动物细胞培养的条件(1)营养条件：细胞在体外培养时，培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质。
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分。
培养动物细胞一般使用液体培养基，也称为培养液。
(2)无菌、无毒的环境：在体外培养细胞时，必须保证环境是无菌、无毒的，即需要对培养液和所有培养用具进行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。
培养液还需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。
(3)温度、pH和渗透压：维持细胞生存必须有适宜的温度。
哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜。
多数动物细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。
此外，渗透压也是动物细胞培养过程中需要考虑的一个重要环境参数。
(4)气体环境：动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2。
O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有95%空气和5% CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养。
必会知识二动物细胞培养的过程1．体外培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，大多数细胞属于这种类型，这类细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞培养是一种重要的生物技术手段，广泛应用于医药、生物学研究、食
品工业等领域。
通过细胞培养，可以获取大量同质的细胞群体，为疾病治疗、新药研发提供重要的支持。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是将动物组织或细胞在人工培养基中进行维持、增殖、传代等过程。
培养基通常包括营养物质、生长因子、激素等成分，提供细胞生长所需的营养和环境。
动物细胞培养的步骤
1.细胞来源：从动物体内收集组织样本，获得原代细胞。
2.细胞分离：通过消化酶等手段将组织分离成单个细胞。
3.传代培养：将分离的细胞在培养基中培养，定期传代以增殖细胞数
量。
4.检测与分析：对培养的细胞进行检测、分析，确保其健康状态。
动物细胞培养的应用
1.生物医学研究：细胞培养在癌症、遗传疾病等方面的研究中发挥重
要作用。
2.药物研发：通过细胞培养可以进行药物筛选、毒性测试等工作。
3.食品工业：利用细胞培养技术可以生产细胞培养肉等食品。
动物细胞培养的发展
随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也在不断创新和提升。
新的培养
基配方、生长因子的发现以及工程技术的应用，使得动物细胞培养在医学和生物学领域有着广阔的应用前景。
动物细胞培养作为一种重要的生物技术手段，将继续在各个领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究进步做出贡献。
第二章细胞工程第2节动物细胞工程 教学课件人教版高中生物选择性必修3
旁栏边角想一想 动物细胞培养时,除了添加糖类、氨基酸等必要的营养成分外,往往还需添 加血清等一些天然成分,原因是什么? 提示 人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚,血清等一些天然成分 的营养成分比较齐全,可以弥补人工培养基的不足。
结论语句辨一辨
1.在25 ℃的实验条件下可顺利完成人神经细胞的培养。( × )
结论语句辨一辨 1.胚胎干细胞可以来源于早期胚胎,也可以来源于成熟个体。( × ) 2.成体干细胞没有组织特异性,可以分化成特定的细胞或组织,不具有发育 成完整个体的能力。( × ) 3.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用。( √ ) 4.体外培养胚胎干细胞可以不断增殖而不发生分化。( √ )
第2章细胞工程
第2节 动物细胞工程
第1课时 动物细胞培养 第2课时 动物细胞融合技术与单克隆抗体 P34 第3课时 动物体细胞核移植技术和克隆动物 P63
课程标准
1.认同动物细胞培养是模拟体内生理条件在体外进行的培养, 分析动物细胞培养需要的基本条件。 2.尝试构建动物细胞培养的基本流程,比较动物细胞培养和植 物组织培养的异同。 3.概述干细胞的分类,探讨干细胞在临床上的应用及面临的风 险,理性看待生物技术。
(2)培养条件 ①营养条件:将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养 基,称为合__成__培__养__基__,在使用时,通常需要加入___血__清____等一些天然成分。 ②无菌、无毒的环境:在体外培养细胞时,需要对培养液和所有培养用具进 行灭菌处理以及在无菌环境下进行操作。培养液还需要定期更换,以便 清__除__代__谢__物__,防止其积累对细胞自身造成危害。 ③适宜的温度、pH和渗透压:维持细胞生存必须有适宜的温度。哺乳动物 细胞培养的温度多以_3_6_._5_±__0_.5__ ℃为宜。多数动物细胞生存的适宜pH为 __7_._2_~_7_.4___。 ④适宜的气体环境:通常采用培养皿或_松_盖__培__养__瓶__,并将它们置于含有95% 空气和5%CO2的混合气体的_C_O_2_培__养__箱__中进行培养。O2是细胞代谢所必 需的,CO2的主要作用是__维__持__培__养__液__的__p_H___。
第二章动物细胞培养基本知识
动物细胞培养的 基本知识
第二章动物细胞培养基本知识
一、培养细胞的生长类型
贴壁型细胞:附着在某一固相支持物表面才
能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而
在悬浮状态下即可生长的细胞。
绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，
只有少数细胞类型，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长
兼性贴壁细胞
能力强， 当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信
息的结果 2.培养的细胞和基质之间
对细胞外基质仍有依存性
第二章动物细胞培养基本知识
但有不同 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全 相同 当细胞被置于体外培养后 久了,必然发生变化
与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的一些影响
第二章动物细胞培养基本知识
第二章动物细胞培养基本知识
1、成纤维细胞型
胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞 质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外， 凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、 成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。培养中细胞 的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。
第二章动物细胞培养基本知识
小鼠成纤维细胞 第二章动物细胞培养基本知识
皮肤成纤维细胞（ 100 倍）
第二章动物细胞培养基本知识
体外培养的年轻和老的人成纤维细胞的显微形态
左边是只分裂了几代的年轻成纤维细胞，呈现薄层、细长 的形态；右边是分离了50次的老的成纤维细胞，开始衰退，
并很快死亡。
第二章动物细胞培养基本知识
第二章动物细胞培养基本知识
第二章动物细胞培养基本知识
悬浮型
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌 细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于 支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
第二章 动物细胞培养
此时需做分离培养即传代，否则细胞轻则中毒，发生形 态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。
第三节、影响体外细胞培养的理化因素
• 动物细胞的体外培养，根本特点是模拟体 内的条件，因此，其重要的条件可以概括 为无菌、生长环境(PH值、温度等)和营养 三个方面。
4、多形细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形 态，可统归于此类。
2.悬浮型（P65 图4-3、4-4）：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细 胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容
易大量繁殖。
特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团。 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态。 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长。
无菌操作意识在动物细胞培养中非常重要！
水 ：
体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯 度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即 使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长， 甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水， 可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。
配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次 蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。 最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。
主要过程: 游 离 吸 附 贴 壁 扩 展
细胞状态：可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相
潜伏期影响因素：
1.细胞密度 接种密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境， 潜伏期越短 2.细胞类型
传代细胞潜伏期比原代细胞短。
动物细胞培养
一、动物细胞培养技术
1.概念：
从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单 个细胞，然后放在适宜的液体培养基中，让这些细 胞生长和增殖。
2. 原理： 细胞增殖
3. 目的：获得细胞或细胞产物
2017/8/15
CO2
动 物 细 胞 培 养 技 术
4. 动物细胞培养的条件（识记）
(1)无菌、无毒的环境：培养液和用具无菌处理，加抗 生素抑制细菌生长，定期更换培养液 (2)营养： 液体的合成培养基：葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量 元素、维生素、通常加入动物血清、血浆等
动物细胞培养过程（识记）
胚胎或幼龄动物的组织块
胰蛋白酶处理分 剪碎 散成单个细胞。 加培养液
细胞悬液
放培养瓶进行原代培养
通常将动物组织消化后的 初次培养称为原代培养
2017/8/15
6、在这个培养瓶中细胞因为接触抑制现象而不再 继续分裂增殖。但细胞的数量并未达到人们的需求， 应该怎么办？
转入培养液中 进行原代培养
原理 培养基性质 培养基特有成分 培养结果 培养目的 分散处理 脱分化
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细胞的全能性 固体培养基 蔗糖 植物激素
植物体
细胞增殖 液体培养基
葡萄糖 动物血清
细胞群 细胞或细胞产物 有 无
快速繁殖、培育 无病毒植株等 无
有
1、与植物组织培养及基相比，动物细 胞培养液有何独特之处？
2、动物细胞培养能否像植物组织培养 那样最终培养成新个体？
①②③④ ①②③④⑥
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5、动物细胞培养的特点
（
A ）
①细胞贴壁 ②有丝分裂 ③细胞分化 ④接触抑制 ⑤减数分裂 ⑥原代培养一般传1－10代
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The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1912 "in recognition of his work on vascular suture and the transplantation of blood vessels and organs"
Alexis Carrel
传代培养期细胞 的主要特点：
➢持续时间长 ➢ 细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型 ➢ 需早期冻存
衰退培养期细胞 的主要特点：
➢细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖； ➢细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。
无限细 胞系 或
连续细 胞系
注: 细胞永生性和恶性性非同一性状。
3. 每代贴附生长细胞的生长过程
细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：
France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944
动物细胞培养中的常用术语
❖ 细胞培养；组织培养；器官培养 ❖ 原代培养；传代培养；代 ❖ 细胞系；细胞株 ❖ 有限细胞系；无限细胞系 ❖ 体外转化；体外恶性转化 ❖ 细胞分裂指数；克隆形成率
➢是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段 ➢培养物中细胞数量呈指数增长 ➢细胞群体均一，是理想的实验用细胞
接触抑制？ 肿瘤细胞接触抑制消失
停滞期 特点
➢细胞数量达饱和密度，出现密度抑制 ➢细胞活动小, 细胞膜的活动小 ➢生长组分下降: 0－10% ➢及时传代：
一、体外培养细胞的基本特性
（四）体内外细胞的差异
第二章 动物细胞培养
Hela细胞株 人正常胎肝细胞系
动物细胞培养的发展历史
➢1859年,法国解剖学家Valpian最早尝试
了蛙胚尾部组织的体外培养.
➢1885年，Wilhelm Roux把鸡胚的神
经板在温热的盐水中维持其存活若干天；
➢1906年，Beebe和Ewing在动物的血液
中尝试培养了传染性狗淋巴肉瘤的细胞；
➢ 1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴
培养蛙胚神经组织细胞；
➢ 20世纪初，Carrel将外科手术的无菌操
作观念带到了体外培养的实验之中。
Harrison：组织培养之父
Ross Granville Harrison 1870–1959, American biologist and anatomist, b. Germantown, Pa., Ph.D. Johns Hopkins, 1894. He went to Yale as professor of comparative anatomy in 1907 and held various honorary positions there until his death. He is known for his work on nerve development in the embryo and on nerve regeneration as well as for his discovery of a method of tissue culture that permits study of isolated living cells in a controlled environment.
潜伏期 指数增生期
平顶期
潜伏期的 特点
➢细胞由游离逐渐贴附 ➢细胞可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相 ➢当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标
志细胞已进入指数增生期
细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素
相关的过程如细胞种类、支持物、促贴附物质 等。
潜伏期出现 的原因？
影响潜伏期 长短的因素？
指数增生期 特点
成纤维型细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞
2.悬浮型：
形态？ 来源？ 生长特点？
一、体外培养细胞的基本特性
（二）体外培养细胞的超微结构
❖ 细胞外被：糖蛋白膜，利于细胞贴壁。
❖ 细胞骨架：正常细胞微丝微管走行有一定 方向性，转化后行走紊乱。
❖ 细胞器：线粒体、内质网、高尔基体等 多集中在细胞核周围。
1.形态的差异：细胞体外培养形态， 难以完全反应体内情况。
2.分化的差异：体内细胞听命于外源信号， 体外细胞信号来源切断，出现 特定基因分化表达减弱或停止。
二、影响细胞培养的理化因素
➢ 无菌、无毒：体外培养细胞的首要条件。 ➢ 温度：哺乳动物细胞37℃±0.5℃ ➢
第一节 细胞培养需要具备的基本条件
➢体外培养细胞的基本特征 ➢影响细胞体外培养的理化因素
➢细胞培养实验室的设置设备 ➢器具的清洗与无菌操作
一、体外培养细胞的基本特性
（一）体外培养细胞的分型
１.贴附型：按照体外培养细胞的形态，可以分为：
2.悬浮型：
成纤维型细胞 上皮型细胞 游走型细胞 多形型细胞
1. 粘附型
❖ 细胞核：与体内正常细胞差不多。
一、体外培养细胞的基本特性
（三）体外培养细胞的生长和增殖特性 1. 培养细胞的增殖态和功能态
增殖态: 指细胞增殖的状态和过程 功能态: 细胞处于执行特定功能活动（如分泌、
传导、吞噬、收缩等）时期的状态
一、体外培养细胞的基本特性
（三）体外培养细胞的生长和增殖特性
2.培养细胞生命期 （Life Span of Culture Cells）
➢ 渗透压：260-320 mmol/l ➢水：三蒸水或超纯水，存放时间一般不超过2周 ➢ 营养条件：葡萄糖；氨基酸与蛋白质；维生素
与生物活性因子等
➢ 支持物：表面理化性质，细胞与其接触的机会
和亲和性等。
动物细胞 培养实验室的
设置设备
风淋室
传递窗
CO2 培养箱
倒置显微镜
大容量高压灭菌器
全自动三重纯水蒸馏器
细胞在培养中持续增殖和生长的时间， 通常以体外最终可以传代的次数表示。
正常细胞生 命期大致经 历3个阶段
原代培养期： 传代期： 衰退期：
原代培养期细胞 的主要特点：
➢可见细胞分裂，但不旺盛 ➢细胞群是异质的（Heterogeneous） ➢细胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低 ➢初代培养细胞多呈二倍体核型 ➢是检测药物很好的实验对象