2013-9-26-生化技术
2013级高级生化复习资料
亮氨酸拉链：亮氨酸拉链结构的C端为螺旋区，靠近N端一侧的一段螺旋富含碱性残基，其后的一段螺旋每隔六个残基就有一个亮氨酸，每个这样的螺旋不少于四个亮氨酸，且都处于螺旋同一侧。
当含亮氨酸拉链的蛋白形成同源或异源二聚体时，亮氨酸拉链结构中的亮氨酸残基借助于疏水作用彼此靠拢，形同拉链。
热休克蛋白:生物中广泛存在一类热应急蛋白质。
当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。
许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。
按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白（sHSP）。
结构域:指蛋白质多肽链在二级结构的基础上进一步卷曲折叠成几个相对独立的近似球形的组装体，是蛋白质三级结构的基本单位，其为独立的结构、功能和折叠单位。
核酶:具有催化活性的RNA，即化学本质是核糖核酸（RNA），却具有酶的催化功能。
核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
催化分子内反应的核酶分为自我剪接核酶和自我剪切核酶。
N-聚糖:连接在蛋白质肽链中天冬酰胺残基侧链酰胺-NH2（Asn-x-Ser/Thr）上的寡糖，形成C-N糖苷键。
此类寡糖通常均有一个核心的五糖和类似结构的外周分枝糖链。
O-聚糖:而由糖链还原端与含羟基的氨基酸侧链-OH间形成C-O糖苷键的聚糖称为O-聚糖，这类氨基酸残基包括Ser/Thr、Hyl、Hyp。
细胞凋亡:是正常机体细胞在收到生理和病理性刺激后出现的一种自发的由相关基因调控的死亡过程，也叫PCD。
锚定蛋白:锚定蛋白除结合多种信号分子外，还通过与细胞膜结构结合，把胞浆中与同一信号传递过程密切相关的信号分子定位在近膜区。
G蛋白:即GTP结合蛋白或鸟苷酸调节蛋白，该家族成员有许多在细胞信号转到中起着偶联膜受体与效应器的作用。
G蛋白的GTP结合形式为其活化状态，GDP结合形式为其非活化状态。
生化检验技术
Байду номын сангаас
光的强度愈弱，其定量关系A=K· C。
当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓 度成正比，这就是Beer定律。
3. Lambert-Beer定律
合并Lambert定律与Beer定律可得 A=K· L· C 说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的 浓度和液层厚度成正比。 吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓 度及单位厚度时的吸光度，在给定条件下（波长、 溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数， K 值愈大，能测定的浓度 C 愈小，则灵敏度愈高。
（三）荧光分析法 利用某些物质光致发光的特性，籍此对物 质进行定性，定量分析的方法。 1.基本原理 某些物质的分子吸收了光 能，从基态跃迁至某一电子激发态中的某一振 动能级，处于激发态的振动能级中的分子通过 运动或与其他分子的碰撞而将吸收过多的能量 输给其他分子，并返回到第一激发态的最低振 动能级，同时发射荧光，跃迁到基态发射荧光， 在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液浓度呈 线性关系。
如钠发射光谱波长589nm，钾发射光谱波 长767nm。 由于火焰供给的能量不强，只能激发碱 金属和碱土金属元素，生化检验中常用于钾、 钠的测定。
元素的发射谱线强度与该元素浓度的关 系可表示为I=a· c· b
a是与试样组成，激发温度，激发电位有 关的常数， b为自吸收系数，当浓度很低时， b≈1，所以上式可写成 I=a· c，即发射谱线强度 与测定元素浓度成正比。
离子浓度与离子活度的关系 a=f.c 在稀 溶液中（10－4mol/L以下）活度系数接近1。
ISE分析法的优点： 1. 是一种直接的非破坏性分析方法，可 反复进行，不受样品溶液颜色、浑浊等因素的 干扰。 2. 分析速度快，单次分析通常只1～2min 3. 测量范围宽，4～5个数量级 4. 操作简便 5. 测量特定离子活度，对临床医学和基 础医学更有实用意义
生化技术
生化技术基础知识1、名词解释1 生化技术答案: 生化技术是对组成人体的生物活性物质及其代谢产物，如蛋白质（氨基酸）、核酸（核苷酸）、酶、维生素、糖类物质等进行分离提取、含量测定、活性鉴定、生化分析、制备与改造等的技术。
2 膜分离技术答案: 膜分离技术是指利用具有一定膜孔和选择透过特性的天然或人工合成的分离膜，在某种推动力（浓度差、压力差、电位差等）的作用下，实现物质分离纯化或浓缩的一种操作技术。
2、填空题1 超滤法主要可应用于和。
答案: 脱盐；浓缩2 800B台式低速离心机最高转速可达rpm。
答案: 40003 Ultrafiltration指_______ 。
答案: 超滤4 尿中毒的病人通常采用生化技术中的_______ 技术来排出血液中的毒素。
答案: 透析5 过滤是用来分离_______ 和_______ 的一种方法。
若用来收集滤液，必须保证_______ 的一面干净。
答案: 固体,液体,朝向漏斗那一面6 使用离心机时，必须要注意：（1）_____________________ ；（2）__________________；（3）__________________；（4）____________________________________等问题。
答案: 负荷平衡、对称放置；开机前检查转速是否已调至最小；缓慢升速；待离心机停稳后，方可打开离心机盖取出样品7 强腐蚀性的废弃试剂、药品、废纸及其他固体废物或带有渣滓沉淀的废液均应倒入_________内，不能倒入_________内，否则会_________。
答案: 垃圾桶内,水槽,堵塞和腐蚀下水道8 要量取3.5mL的溶液，应选取量程为_________mL吸量管最佳。
答案: 59 为便于准确快速选取所需吸量管，ISO统一规定了吸量管的色环颜色，量程0.5、1、2、5和10mL的吸量管，色环颜色分别为、、、和。
答案: 绿色，黄色，黑色，红色，桔红色3、判断题1 用微量取液器量取液体时，应将“取液、放液按钮”按至第一档取液。
生化技术PPT教学课件
缺点：易变性
操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加 少量无机盐，pH接近pI，用量试验确定， 可先浓缩。
3.4 选择性变性沉淀 杂蛋白变性沉淀，不影响所需蛋白
三 核酸的沉淀分离
温度：0～4℃ ，防止变性和降解 加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水
解 1 有机溶液沉淀法 乙醇 2 等电点沉淀法 3 钙盐沉淀法（氯化钙＋乙醇） 4 选择性溶剂沉淀法
多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定 如淀粉，可用酸解或酶解
操作要点
（1 ）斐林试剂的标定
（a）标定预备试验
A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀， 加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡 萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1 ％或0.2％）V1mL。 （b）标定
（b）定糖
A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶 中中） 预摇 先匀 加， 入补 （加V2（-1)Vm0L-V标2）准m葡L萄水糖，液并，从摇滴匀定后管 加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用 标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内 完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V
（1）铜试剂的配制 主要提供二价铜离子及碘
（2）标准曲线的制作
（a)标准葡萄糖液的配制
0.1%或0.05％（根据所用铜离子试剂定）
（b)三角瓶编号
1 2 3456
葡萄糖标准液（mL ) 0 1 2 3 4 5
蒸馏水（mL )
5 4 3210
铜试剂（mL )
5 5 5555
沸水浴10min，冷却至室温
1996 “多莉”羊诞生
第一篇 生化分离技术
第一章 生物大分子的提取与沉淀分离 技术
生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖 和脂类
生化技术
2.光聚合
光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光 照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引 发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的 增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办 法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆 盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些 金属等可抑制聚合反应。
生化技术
广州中医药大学
生物化学教研室 吴映雅
• 1定义 • 生化技术——在生物化学及其相关学科应 用的各种技术，主要指生物体内物质及其 代谢产物，特别是生物大分子的分离、检 测、制备与改造技术。
2发展过程
• • • • • • • • • • • • • • 1923 Svedberg设计超速离心机 1925 Warberg发明微量检压仪 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用 1931 Kuhn柱层析分离α、β-胡萝卜素 1940 电泳、层析技术 50-52 气相色谱（GC） 1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构 1953 Watson、Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构 1960 操纵子学说 1964 人工合成胰岛素 1969 固定化酶、细胞技术 1973 基因工程 1975 细胞工程（杂交瘤技术） 1990 启动人类基因组计划
• 另外根据支持介质形状不同，区带电泳可 分为：薄层电泳、 板电泳、柱电泳。 • 据用途不同，可分为：分析电泳、制备电 泳、定量、免疫电泳。
电泳的基本原理
电泳是在电场的作用下而产生的物质 运动，不同的物质在一定的电场强度 下，由于所带电荷不同，因此受到的 引力不同，向相反电极泳动速度不同 进而达到分离目的。
生化技术
1光谱分析技术：指利用各种化学物质（包括原子、基团、分子及高分子化合物）具有吸收、发射或散射光谱谱系的特点，对物质进行定性或定量分析的技术。
①分类：根据光谱谱系特征分为吸收光谱分析、发射光谱分析和散射光谱分析。
②特点：灵敏度高、精密度和准确度高、选择性较高、仪器设备简单、操作易掌握、用途广泛等。
2光的本质是不连续的微粒性和连续的波动性矛盾的对立和统一，即光的波粒二象性。
3可采用钨灯做可见光分光光度计的光源（350-2500nm）；氢灯可作为紫外分光光度计的光源（185-400nm）。
4分子能级是电子能级、振动能级和转动能级之和。
5吸收光谱曲线（吸收光谱）：当一定光源所产生的电磁波通过液态、气态或固态物质时，物质的原子或分子对电磁波进行选择性吸收，从而产生原子吸收光谱或分子吸收光谱；被吸收的光谱称为该物质的吸收光谱。
根据其形状和λmax可进行定性分析；定量分析用λmax作测定的波长。
6跃迁所需能量σ→σ*＞n→σ*＞π→π*＞n →π*。
紫外及可见光分光光度法在有机化合物中的应用，多数都是建立在π→π*和n→π*跃迁的基础上。
π→π*跃迁与n→π*跃迁的重要区别①摩尔吸光系数不同：π→π*摩尔吸光系数在104左右，n→n*跃迁的摩尔吸光系数小，在10-100范围②溶剂的极性对这两种跃迁的吸收峰波长影响不同（溶剂效应）：溶剂极性增加时，π→π*红移，n→π*蓝移。
7透光率/透光度T：透过光的强度It与入射光的强度Io之比，T=It/Io。
光的吸收定律（朗伯—比尔定律）：一束平行的单色光通过稀溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度及液层厚度的乘积呈正比A=kcl。
8分光光度计都是由光源、单色器、比色杯、检测器和显示器五大部件组成。
9紫外可见分光光度法常用的单组分定量方法有吸光系数法、标准曲线法和标准对比法。
多组分定量方法有解联立方程法和双波长分光光度法。
10显色剂：用来使被测物质显色、生成有色化合物的试剂。
选择原则-入射光波长吸收最大干扰最小；吸光度0.2-0.8；狭缝宽度为吸收峰半宽度的1/10。
生化技术复习资料
机械破碎法：通过机械运动所产生的剪切力，使细胞破碎的方法物理破碎方法：通过温度压力声波等各种物理因素的作用是组织细胞破碎的方法温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎的方法压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞突然破碎的方法超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的10~25khz的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用而使细胞破碎渗透压破碎法：利用渗透压的变化使细胞破碎化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法酶促破碎法;通过细胞本身酶系的作用外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到破碎细胞的方法自溶法：利用细胞本身酶系的作用，在一定PH值和温度条件下，保温一段时间，使细胞破坏，而使细胞内物质释放出来的方法抽提：指在一定条件下，用适当的溶剂处理原料，使欲分离物质充分溶到溶剂中的过程盐溶：在低浓度盐存在的条件下，蛋白质的溶解度随盐溶度的升高而增加盐析：盐溶度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐溶度的升高而降低ββββ沉淀分离法：通过改变某一条件后添加某些物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出而与其它溶质分离的技术Ks分段盐析：Ks为盐析系数，主要取决于盐的性质，Ks的大小与离子价数成正比，与离子半径和溶液的介电常数成反比，也与蛋白质的结构有关β分段盐析：主要取决于蛋白质的性质，也与温度和PH值有关。
当温度和PH值一定是，β为一常数等电点沉淀法：通过调节溶液的PH值至某种溶质的等电点，使其溶解度降低，沉淀析出，而与其他组分分离有机溶剂沉淀法：利用欲分离物质与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使某种有机溶质沉淀析出，从而与其他组分分离复合沉淀法：在溶液中加入某些物质，使它与蛋白质等形成复合物而沉淀下来，从而达到分离的方法金属盐沉淀法：利用溶液中某些溶质与某些金属离子反应，生成金属盐沉淀，而与其他组分分离的方法选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分离过滤：根据过滤的介质不同，过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类，粗滤和部分微滤采用高分子膜以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤，简称为过滤粗滤：由于过滤介质截留悬浮液中的物质直径大于2um，这种固形物与液体分离的技术称为粗滤常压过滤：以液位差为推动力的过滤加压过滤：以压力泵或压缩空气产生的压力为推动力减压过滤：真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，以增加过滤介质上下方之间的压力差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法过滤速度：单位时间内通过单位过滤面积的液体体积膜分离技术：借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术加压膜分离：以薄膜两边的流体静压力差为推动力的膜分离技术微滤：以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术超滤：又称超过滤，是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的技术反渗透：反身体的孔径小于20A，被截留的物质分子质量小于1000Da，操作压力为0.7~13MPa，主要用于分离各种离子和小分子物质。
生化技术(xia)
3．测定 吸取0.5ml样品液于试管中（重复2 次），加蒸馏水1.5ml，同制作标准曲线的步骤， 按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测 定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下 式计算测试样品中糖含量。
2.5 蒽酮法
1．葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不 同浓度的标准葡萄糖溶液。 在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓 H2SO4，摇匀后，打开试管塞，臵沸水浴中煮沸10分钟， 取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的 光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度 值为纵坐标，作出标准曲线。 糖含量测定 2.用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加 1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意： 浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻 摇匀，再臵沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与 0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。 冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。 查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。
生化技术
第二篇 生化检测技术
第一章 生物大分子化学和光学检测技术 糖的化学及光学检测技术 蛋白化学及光学检测技术 核酸化学及光学检测技术
第一节 糖的测定
1.1费林试剂热滴定法（兰-爱龙法）
原理 还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖） 的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中， 还原糖能将Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金属离子还原， 而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常 被用于糖的定性和定量测定。 本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种 溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示 剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将 一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠 反应，生成氢氧化铜沉淀：2NaOH + CuSO4 = Cu(OH)2+ Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸 钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：
生化检验技术的名词解释
生化检验技术的名词解释生化检验技术是现代医学和生物科学领域中不可或缺的重要工具，它能够通过测量和分析生物体内的化学物质，帮助医生和研究人员了解疾病的发生机制、诊断疾病、评估治疗效果以及探索生物体的基本功能。
本文将对一些常见的生化检验技术及相关术语进行解释。
一、测定方法生化检验技术中常用的测定方法有吸收分光光度法、发光法、比色法、高效液相色谱法等。
其中，吸收分光光度法是最常见、简便的一种方法。
它基于不同物质对特定波长的光的吸收程度不同的原理，通过测量被测物质对光的吸收强度来间接分析物质的浓度或反应性质。
二、血液指标1. 血红蛋白（Hb）：血红蛋白是红细胞内的一种蛋白质，它能够通过结合氧分子进行携带和传递氧气。
血红蛋白的测定可以反映贫血的情况，帮助医生了解患者的氧气供应状况。
2. 血糖（GLU）：血糖是指血液中的葡萄糖浓度，它是人体细胞供能的重要来源。
血糖的测定对糖尿病的诊断和治疗监控非常重要。
3. 血脂：包括总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等。
这些指标可以评估患者的血脂水平，早期发现和干预异常的血脂代谢对预防心血管疾病具有重要意义。
三、肝功能指标肝功能是评估肝脏正常工作状态的重要标志。
常见的肝功能指标有谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）等。
这些指标可以反映肝细胞的损伤程度、胆红素代谢的情况等，有助于诊断肝炎、肝硬化等疾病。
四、肾功能指标肾功能是评估肾脏正常工作状态的指标，常用的肾功能指标有尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCR）等。
这些指标可以反映肾脏排除废物和调节体内水电解质平衡的能力，有助于诊断肾病、评估肾脏功能损害的程度。
五、炎症标志物炎症标志物是反映患者体内炎性反应程度的指标，常见的炎症标志物有C-反应蛋白（CRP）、白细胞计数（WBC）等。
这些指标的升高常见于感染、炎症以及某些疾病的发作，可以用于炎症性疾病的诊断和疗效评估。
生化分析检测技术
光学检测技术
吸收光谱法
01
利用物质对特定波长光的吸收特性进行分析，如紫外-可见分光
光度法。
发射光谱法
02
通过激发物质使其发射特定波长的光，进而进行分析，如荧光
光谱法和化学发光法。
散射光谱法
03
根据物质对光的散射特性进行分析，如瑞利散射和拉曼散射。
电化学检测技术
电位分析法
利用电极电位与待测物质浓度的 关系进行分析，如pH计和离子选
药物研发
通过生化分析技术对药物进行筛选和评估，提高 药物研发的效率和质量。
基因工程
利用生化分析技术检测基因的表达和调控，研究 基因与疾病的关系。
细胞培养与分析
通过生化分析技术对细胞进行培养、分离和分析， 研究细胞的生理功能和病理变化。
04
生化分析检测技术挑战与问题
样品前处理挑战
样品复杂性和多样性
生化分析样品来源广泛，成分复杂，前处理过程需充分考虑样品特 性，确保分析的准确性和可靠性。
前处理方法的优化
针对不同类型样品，需开发高效、简便的前处理方法，提高处理效 率，减少分析误差。
自动化和智能化需求
前处理过程涉及多个步骤，操作繁琐，易引入误差。发展自动化和智 能化前处理技术是提高分析效率和质量的关键。
微型传感器应用
微型传感器在生化分析检测中发挥着重要作用，能够实现对待测物 质的快速、灵敏响应，提高检测效率。
多功能集成化发展趋势
多参数同时检测
生化分析检测技术正朝着多参数同时检测的方向发展，实现在同一平台上对多种生物标志 物的同时测定。
多功能模块集成
将不同功能的模块集成到同一系统中，如样品前处理、分离纯化、检测分析等，提高检测 流程的连续性和自动化程度。
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生物化学技术的定义
基础： 基础 依据近代物理学、化学及生物学基本理论和实 验方法而建立起来的生物化学研究技术，使生 物化学在基础理论和应用方面迅速发展； 定义： 应用生物学、化学、物理学的原理和研究方法 建立的一系列提取、分离、纯化各种生物大分 子、生物材料、成份（活性成份）的技术和方 法；并进行鉴定、分析、改建实现品种优化的 目的；是实现分子生物学和现代生物技术的基 本手段之一。
1、 DNA分子的体外重组——连接反应 P204-213 2、重组DNA导入宿主细胞——转化和筛选 P213-222
参考书 1. 现代分子生物学实验手册 张维铭 科学出版社 2003 2. 分子生物学基本技能和策略 周俊宜 科学出版社 2003 3. 生物化学技术原理及应用 赵永芳科学出版社 2002 4. 现代生化技术(第二版)郭勇 华南理工大学出版社 2005 5. 分子克隆（第三版 上、下册）科学出版社 2002 6. Gene Ⅵ Lewin B Oxford University 1997 Gene VII 7. 精编分子生物学实验指南[美] F.奥斯伯 科学出版社 2001 8. 生物化学与分子生物学实验技术 杨安钢等 高教社 2004 新技术方法介绍： （1） 各大公司广告 如何获取——学术会议和讲座 （2）各种杂志《生命的化学》《生物化学与生物物理进展》、 《生物工程进展》等
术、 中子散射技术、声谱技术、微量测压技术等。
4. 综合性技术
（1）DNA重组技术 ——生物学为主、化学知识 （2）DNA测序技术 ——生物学、物理学、化学 （3）酵母双杂交系统 （4）噬菌体表面呈现技术 （5）固定化技术 ——固定化酶、细胞和细胞器 （6）RT-PCR技术、FPLC技术等
1953年Waston和Crick提出DNA的双螺旋模型
生物技术
农业生物技术 医药生物技术 生物技术疫苗 生物技术诊断 家畜生物技术 海洋生物技术
现代生物技术发展的主要趋势
1.新技术、新方法一产生便迅速通过商业渠道出售并应
用； 2.基因工程药物和疫苗研究的开发，新的生物治疗制剂的 产业化前景光明； 3.转基因植物和动物取得重大突破，现代生物技术在农业 上的广泛应用，给农业畜牧业生产带来新的飞跃； 4.基因组及其编码蛋白质结构与功能的阐明； 5.基因治疗可能革新整个疾病的预防和治疗领域； 6.继基因工程后蛋白质工程的发展，将分子生物学、结构 生物学、计算机技术结合形成一门高度综合的学科； 7.信息技术 发展渗透到生命科学领域，形成用途广泛的 生物信息学。
六. 相关生化技术实验室的基本知识 1.试剂的配制及一些常用数据表； 2.实验室的安全与急救处理； 3.实验室的常识； 4.玻璃器皿的洗涤与各种洗液的用途； 5.重要标识； 6.试剂标签的内涵及信息。
Boyer-Cohen 实验
（三）现代生物技术研究进展和成就(详见附件)
DNA重组技术使生物技 术过程中生物转化得 以优化和有效；不仅 可以分离到高产菌， 并可制造高产菌，原 核、真核细胞都可以 成为生物工厂生产胰 岛素、干扰素、生长 激素等外源蛋白。 1953 DNA双螺旋的发现 1973 DNA重组技术的建立 1978 在大肠杆菌中表达 胰岛素 1988 PCR方法问世 பைடு நூலகம்997 克隆羊多莉 2003 人类基因组测序完成 －－蛋白组工程
2013-7-18
185,000,000条
2009-9-18
2010-9-18
克隆种类
克隆 (clone)来自同一始祖的相同拷贝的集合。 分子克隆 细胞克隆 动物克隆
先进的技术和成果在生化领域中的应用
1、电子计算机用于核酸、蛋白质等大分子的结构分析 ——结构生物学、生物信息学 2、DNA序列分析、氨基酸序列分析自动化 （DNASIS——分析核酸、 PROSIS——分析蛋白质二 级结构预测） 3、聚丙烯酰胺凝胶的发明，使得PAGE成为可能。 还有RT-PCR技术、FPLC技术、噬菌体表面呈现术、 酵母双杂交系统等都是不同学科交叉发展的结果。
生物化学与分子 生物学技术
主讲：刘德立、熊 许文亮、耿 2013.9.26 丽、 辉
生化与分子生物学技术
绪论 第一章 第二章 第三章 第四章 第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章
——刘德立
生物大分子的制备 色谱技术 电泳技术 离心技术（见习） 分光光度技术（见习） 基因克隆技术 PCR技术 DNA测序技术 标记技术 新进展与新技术
5. 琼脂糖凝胶电泳 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同 长度的DNA分离开。 6. DNA测序技术 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert 发明了DNA快速测序技术。
1980年Nobel化学奖
（二）、基因工程的诞生 1. Berg的开创性实验 1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成 了首次体外重组实验： 将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片 断连接起来。
DNA双螺旋结构示意图
DNA双螺旋结构
1953年James D. Watson和 Francis H. C. Crick揭示 了DNA分子的双螺旋结构和 半保留复制机制。
三、分子生物学技术 ——现代生物技术
1953 Watson、Crick发 现 DNA双螺旋结构 1973 Herber Boyer、 Stanley Cohen共同 完成了一项著名的 实验－－DNA重组 技术。从而“基因克 隆”的策略被正式提 出。
分子生物学技术
分子生物学技术则是利用先 进的物理、化学手段从分子 水平研究生命现象的实验技 术。特别是生物大分子的分 离制备与改造技术和分子克 隆技术（即基因工程）。
二、种类（或分类）：
生化与分子生物学技术或者说现代生化技术大致可分为三类
1.以生物学原理为基础的技术
（1）生物测定技术 （2）毒理实验 （3）免疫化学技术 （4）组织培养技术 （5）基因工程 （6）PCR扩增技术 Ab—Ag 单细胞培养、克隆技术 综合性技术但以生物学原理为主
2.以化学和物理化学原理为基础的技术
（1）各种色谱技术（吸附色谱、离子交换色谱、 凝胶色谱、亲和色谱等等） （2）各种电泳技术、电位技术、电导技术、电导分 析、极谱分析、酶和细胞膜的分离等等。
3.以物理学原理为基础的技术
（1）光谱技术：紫外光谱分析、红外光谱分析、 可见光谱分析 （2）离心技术： （3）电镜技术 分析型、制备型、高速离心、超速离心 核磁共振、电子自旋共振、X射线衍射技
——刘德立 ——刘德立 ——许文亮 ——许文亮 ——耿辉 ——熊丽 ——熊丽 ——熊丽 ——许文亮/耿辉
绪
论
一、定义：
生化与分子生物学技术是现代生化技术和分子生物学 技术的总称。它包括生物化学技术和分子生物学技术两部分。
生物化学技术
生物化学技术是研究生物体 内物质的化学组成、结构、 功能、人工模拟；以及在生 命活动中各种化学物质代谢 变化、调节控制等的实验方 法。也就是说，在生物化学 及其相关学科应用的各种技 术统称为生化技术。
细 胞 色 素 氧 化 酶 三 维 图
4、生物体作为一个整体，许多反应都是互相关联的。所 以必须考虑其整体性。 即对生化实验结果分析要有一定的灵活性——多价 效应。 5、许多分析技术本身就是从生物学发展起来的——生物 学基础。 如色谱技术最初由俄国植物学家Qsbem研究花粉色素 发展起来的。 免疫技术也是从生物学发展起来的,并加以推广应用。 如现在基因工程中常用的抗体筛选就是从免疫技术发展而 来的。
（一）、基因工程诞生的技术突破 1. 限制性内切酶（restriction enzymes） 1970年H.O. Smith等分离出第一种限制 性核酸内切酶。
Daniel Nathans Werner Arber Hamilton O. Smith 用限制酶切得 理论预见限制酶 得到第一个限制酶 SV40 DNA片断
图1 生化与分子生物学技术
生化技术课程的内容与任务
研究制备分离生物大分子所涉及的各种方法 ——盐析沉淀法，各种色谱技术如吸附色谱、凝胶过 滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱、等电聚胶色谱等 方法。 纯化、鉴定生物大分子的方法 ——电泳、免疫化学、杂交、PCR等。 微量纯化、鉴定分析方法 ——气相色谱、高效液相色谱、FPLC、GC-MS等。
（用DNA末端转移酶，而 非限制性内切酶）
1980年Nobel化学奖
2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡 那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有 四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒 pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同 pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在 菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第 一次成功的基因克隆实验。
四、特点：
现代生化技术作为一门独立的学科，它有自己的特点。 1、许多大分子（如核酸、蛋白质、酶）都有生物活性。 它们都有其空间结构。所以，任何技术应用到生化上 来，都必须考虑大分子的变性问题。 2、生物体内的许多生化反应速度都是相当快的。 如酶促反应。酶量小，反应速度极快。所以，应用于 生化分析的仪器要高度灵敏。同时，在时间上要十分短暂、 准确。 3、生化反应都是在常温、常压下进行。所以，不能加热。 （H+、OH—影响）
五、发展方向
1. 实验技术的联用 如氨基酸自动分析仪是气相色谱和质谱仪的联用。加上用 计算机控制程序，可在几分钟内完成一个10肽以下的多肽分析。 2. 向着快速、高效、超微方向发展 如北京动物研究所建立了一个快速分析装置。可测定5µsec （微妙）的动力学装置，以捕获自由基、中间体等。采用超声 谱可测10-9秒，在量上，可测到10-11g。所以，国外报道，一滴 血可完成20多个项目的测定。电镜发展，使分辨率达到1.4A。除 H原子外的其他原子都能定位，分辨率是两质点间的距离。
转基因动植物