高级生化实验讲义
生化实验讲义
实验一糖的颜色反应及还原性检验A. 莫氏试验①一、目的掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。
二、原理糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚②生成紫红色缩合物。
利用这一性质可以鉴定糖。
三、实验器材棉花或滤纸；吸管1.0ml（×5）、2ml（×1）；试管1.5cm×15cm（×5）；容量瓶50ml （×5）；烧杯50ml（×5）；棕色瓶50ml（×5）；玻璃棒多根、电炉（配石棉网）多个。
四、实验试剂莫氏试剂：称取α-萘酚2.5g，溶于95％乙醇并稀释至50ml。
此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。
1％蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。
1％葡萄糖溶液：称取葡萄糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。
1％果糖溶液：称取果糖0.5g，溶于蒸馏水并定容至50ml。
1％淀粉溶液：将0.5g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至50ml。
五、操作于5支试管中，分别加入1％葡萄糖溶液、1％蔗糖溶液、1％果糖溶液与1％淀粉溶液1 mL和少许纤维素（棉花或滤纸少量浸在1ml水中），然后各加莫氏试剂2－3滴①，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸 1.5ml（切勿振摇！！！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。
注意：①一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。
此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。
②亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替α-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。
B. 塞氏试验一、目的掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。
二、原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液②。
生化实验技术PPT精品课程课件讲义
进行科学的分析；在学习实验技术的同时，自觉
培养分析问题和解决问题能力。
思考题（课前设疑）
1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化
物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条
件下容易变性？
2.一般从天然生物材料制作生化物质的过程
大体可分为几个阶段？
3.在制备生化物质前应如何选择原料？
4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用 上有何区别？
用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解 决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏 糖基化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和 昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完 整表达的问题。 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产 品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用 试剂则是很好的高产方法。
5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？ 对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？ 对两性物质的提取，常在什么条件下进行？
6.以血清球蛋白为例解释提取制备每步骤的 基本原理？
7.干燥离子交换剂应如何进行处理？何谓离子交换剂转 型？ 8.动植物总DNA或RNA提取的方法主要有哪些？以猪脾脏 DNA提取为例试述每步骤主要原理是什么？如何判断所 提取DNA的纯度？
4 ．生化分离制备过程几乎都在溶液中进
行，各种温度、 pH 、离子强度等参数，对溶 液中各种组成的综合影响，常常无法固定， 有些实验或工艺的设计理论性不强，常带有 很大的经验成分。因此，要建立重复性好的
成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助
材料等都要严格地加以规定。
5．生化制备方法最后均一性的证明与
要求，了解这些，可使分离纯化工作事半
功倍，反之则收效甚微。
1．种属
牛胰含胰岛素（insulin)单位比猪 胰 高 ， 牛 为 4000 IU ／ kg 胰 脏 ， 猪 为 3000 IU ／ kg 胰脏。抗原性则猪胰岛素 比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比， 只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基 酸的差异。
生化实验讲义：实验十一亲和层析最后
实验十一亲和层析纯化胰蛋白酶一、引言前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。
但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。
一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。
由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。
经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。
这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。
另外，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。
这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。
亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。
它具有分离快速，纯化效率高。
特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。
有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。
因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。
二、实验目的与要求1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术；3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。
三、基本原理简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。
许多生物分子都有一种独特的生物学功能。
即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。
如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。
高级生化试验-实验一蛋白质定量分析ppt课件
计算
〔1〕规范管法〔规范比较法〕 实践测定过程中，用一知浓度的测定物
按测定管同样处置显色，读出吸光度，再根 据前式计算。
A规范/A样品= KC规范/ KC样品 C样品=A样品/A规范×C规范
A：吸光度；K：吸光系数；C：溶液浓度；L： 液层厚度
〔2〕规范曲线法
配制一系列知不同浓度 的测定物溶液，按测定 管同样方法处置显色， 分别读取各管吸光度。
测定管
0.1
5.0
实验三 紫外分光光度法
【根本原理】 Tyr and Trp包含不饱和的共轭双键，因此蛋白质具
有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm波优点， 可利用该吸收峰值估计蛋白质浓度; 核苷酸是蛋白质样品中的主要污染成分, 其在280nm 处也有吸收峰, 但最大吸收峰值出如今 260nm;
Protein Conc (mg/ml)=1.45A280-0.74A260; A280/A260>1.5 (核苷酸的污染可以接受) ; 不够准确，但较为简便，样品可回收利用; 灵敏度：50-100μg
2．比尔〔Beer〕定律 一束单色光经过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介
质的浓度的添加呈指数减少。 LgI0/I=KC
I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 K：吸光系数
mbert-beer’s law
一束单色光经过某溶液时，光波被溶液吸收一部分， 吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。
2. 在试管架上有3中蛋白质样品 a. 规范血清，浓度70 mg/ml. 在Improved Lowry Assay中，用于 制备不同浓度的规范样品； b. 用于 Improved Lowry Assay的未知样品； c. 用于 Bradford assay的未知样品(勿稀释).。
高级生化实验讲义
实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用– 16学时一.目的和要求1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。
2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。
二.基本原理报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。
把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。
在动物基因表达调控的研究中，常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。
荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。
自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。
萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)。
荧光素酶作为新型报告基因，与传统报告基因相比，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此在基因工程方面得到了广泛的采用，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。
调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。
很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。
多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。
高级生化课件生物化学技术原理与应用
2.化学处理
（1）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯 （2）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十
二烷基硫酸钠
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3.生物方法
（1）溶胀 （2）自溶 （3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K
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第四节 抽提
一.抽提的含义 二.抽提有效成分的影响因子
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一、抽提的含义
用适当的溶剂和方法，从原料中把 有效成分分离出来的过程。用缓冲液， 稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇） 等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。
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二.吸附法 干葡聚糖凝胶G25或吸水棒加入抽提液， 两者比例一比五，能缩小抽提液体积三 倍左右.
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三.超过滤法 在空气或氮气压力下，使小分子物质通 过半透膜而大分子物质留在膜内的装置。
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四. 透析法 （1）把装透析液的透析袋埋在吸水力强的
聚乙二醇PEG或甘油中； （2）真空透析。
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五.减压蒸馏法 简易减压蒸馏装置（降低沸点）.
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二.抽提有效成分的影响因子
1.PH值 2.溶剂的极性和离子强度 3.水解酶 4.温度：选择合适的抽提温度 5.搅拌：温和搅拌可增加溶解度 6.氧化 7.金属离子 8.抽提液及抽提物的比例:1:5
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1.PH值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电
解质物质，选择抽提液的PH值在偏离等电 点。
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2.溶剂的极性和离子强度
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二.纯化方案的评价 考察比活力、纯化倍数和收得率
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第二编 纯化方法
第二章 沉淀法 第三章 吸附层析 第四章 疏水层析 第五章 离子交换层析 第六章 凝胶过滤 第七章 亲和层析 第八章 聚焦层析 第九章 高效液相色谱 第十章 固定化的酶及微生物
高级生物化学课件
高级生物化学课件一、引言二、生物大分子的结构与功能1. 蛋白质：蛋白质是生命活动的主要执行者，具有多种生物学功能。
本节将介绍蛋白质的一级、二级、三级和四级结构，以及蛋白质的折叠与功能关系。
2. 核酸：核酸是遗传信息的携带者，本节将阐述DNA和RNA的结构、功能及生物合成过程。
3. 糖类：糖类是生物体内重要的能量来源和结构材料，本节将介绍糖类的分类、结构及生理功能。
4. 脂质：脂质是生物膜的主要组成成分，本节将探讨脂质的分类、结构和功能。
三、酶与酶促反应酶是生物体内催化化学反应的生物大分子，具有高效、专一、可调节等特点。
本节将阐述酶的动力学、作用机制、调控原理及酶的应用。
四、生物膜结构与功能生物膜是细胞内外环境的隔离屏障，具有物质运输、信号传递等功能。
本节将介绍生物膜的组成、结构、功能及生物膜与疾病的关系。
五、代谢途径及其调控1. 糖酵解与三羧酸循环：糖酵解和三羧酸循环是生物体内能量代谢的核心途径，本节将阐述这两个途径的反应过程及其调控机制。
2. 生物氧化与氧化磷酸化：生物氧化和氧化磷酸化是生物体内能量代谢的关键过程，本节将介绍这两个过程的反应机理及调控因素。
3. 碳代谢与氮代谢：碳代谢和氮代谢是生物体内物质代谢的重要组成部分，本节将探讨这两个途径的代谢网络及其调控机制。
六、遗传信息的传递与表达1. DNA复制：DNA复制是遗传信息传递的基础，本节将介绍DNA复制的过程、酶学机制及调控因素。
2. RNA转录：RNA转录是遗传信息从DNA向RNA传递的过程，本节将阐述RNA转录的机制、调控及转录后加工。
3. 蛋白质翻译：蛋白质翻译是遗传信息从RNA向蛋白质传递的过程，本节将介绍蛋白质翻译的机制、调控及翻译后修饰。
七、生物化学技术在生命科学中的应用1. 分子克隆技术：分子克隆技术是研究生物分子功能的重要手段，本节将介绍分子克隆的基本原理及应用。
2. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术是研究生物体内蛋白质组成及功能的有效方法，本节将阐述蛋白质组学技术的基本原理及应用。
生化实验讲义(10个)教学内容
生物化学实验讲义赵国芬2010年9月实验之前说明1.各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实验的方法,同时开出不同的10个实验.2.共开出10个不同的实验实验一温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响实验二牛奶中蛋白质的提取与鉴定实验三血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法实验四双缩脲测定蛋白质的含量实验五血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验六植物组织中还原糖和总糖的含量测定实验七应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用实验八植物组织中维生素C的定量测定实验九琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验十植物组织中DNA的提取和鉴定3.穿着要利索,做好实验记录4.注意实验室卫生和安全.一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解.二. 生物化学所用的实验技术1.样品: :血液、血浆、血清、组织植物样品：果实、花蕾、茎等无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆2．移液管的使用：移液管吸管移液管奥氏吸管读数时视线与凹面相平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。
3．离心机的使用：平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停4．分光光度计机器原理和测定原理（比尔定律）5．水浴锅的使用三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写）目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、实验目的通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。
二、实验原理酶的化学本质是蛋白质。
凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。
此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。
酶的活性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。
本实验用唾液淀粉酶作用的底物—淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。
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实验一、转录增强因子在DNA转录中的调控作用– 16学时一.目的和要求1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。
2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。
二.基本原理报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。
把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。
作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。
在动物基因表达调控的研究中，常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。
荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。
自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。
萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)。
荧光素酶作为新型报告基因，与传统报告基因相比，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此在基因工程方面得到了广泛的采用，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。
调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。
很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。
多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。
自然启动子，如c-fos启动子，含有Serum inducibleelement(SIE)、Serum response element（SRE）、cAMP response element（CRE）等一系列转录因子结合位点，这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。
人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件，如cAMP反应元件（CRE）。
G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）通过与异源三聚体G蛋白的相互作用广泛参与胞内第二信使的调控，从而实现细胞外到细胞内乃至细胞核的信息流通。
受体激活后，G蛋白解离为α亚基和βγ亚基并各自激活胞内信号。
其中，与Gaq相偶联的GPCRs 通过激活磷脂酶Cβ（PLCβ）使质膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）两个第二信使。
IP3与内质网上的IP3配体结合，开启钙通道，使胞内Ca2+浓度升高，激活各类钙离子依赖蛋白。
DG可活化与质膜结合的蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC），活化后的PKC通过磷酸化蛋白质的丝氨酸/苏氨酸促使细胞产生不同的反应；与Gas偶联的GPCRs通过激活腺苷酸环化酶（adenylyle cyclase，AC）产生cAMP；与Gai相偶联的GPCRs抑制AC并减弱cAMP水平。
同时，来自Gai和其他G蛋白的βγ亚基可通过激活有丝分裂激活蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAP kinase）途径从而活化一系列效应系统。
Gas偶联的GPCRs，在激动剂结合后，可造成胞内cAMP水平的升高，进而激活PKA。
活化后的PKA可通过磷酸化CREB（CRE binding protein），促使CREB入核并与特定基因的CRE 启动子序列结合，从而促进基因转录。
促生长素抑制素（somatostatin）、绒毛膜促性腺激素（α-chorionic-gonadotrophin）和促肾上腺皮质素释放激素（corticotrophin-releasing hormone）基因启动子中的CRE序列由TGACGTCA组成，而c-fos启动子中的CRE则由TGACGTTT 组成。
抗原刺激T细胞后可激活PLC，接着PLC活化转录因子NFAT（nucler factor of activated T cells）。
PLC激活后可通过水解磷酸肌醇增加肌醇磷酸和二酰基甘油的浓度，后两者分别可增加胞内钙离子水平和激活PKC，PKC可促进AP-1即刻早期基因的两组成蛋白Fos和Jun 的形成。
而钙离子的升高可激活依赖钙调蛋白的磷酸酯酶（calcineurin），使NFAT去磷酸化并入核与Fos和Jun形成转录复合物，最终协同诱导NFAT和AP-1反应元件控制下基因的表达。
血清反应元件（SRE）通过MAP激酶途径激活。
SRE由血清反应因子和三元复合因子（如：Elk-1）组成。
MAP激酶通过磷酸化三元复合因子而使复合物起始转录。
来自于Gai的βγ亚基通过激活Ras依赖的MAP激酶激活此条途径，而通过Gaq偶联的受体则依赖PKC的激活而活化MAP激酶途径。
本实验利用转录增强因子CRE及报告基因荧光素酶建立大麻素受体CB1的功能检测模型三、材料与试剂3.1 实验材料(1) 基因组DNA及CRE-VIP专一性引物(2) HEK293（人胚肾细胞株）3.2 实验试剂(1) PCR试剂盒。
(2) PBS(3)胰酶(4) DMEM培养基(5)胎牛血清(6) 转染试剂（脂质体转染试剂、磷酸钙转染试剂）(7) 激动剂、拮抗剂(8) Forskolin(9)荧光素酶检测试剂盒3.3 实验器材① PCR管和EP管；②微量移液枪；③细胞培养器材（100 mm dish、6-well palte、24-well palte、移液管）④离心机；⑤PCR扩增仪；⑥核酸电泳仪；⑦凝胶成像仪；⑧细胞超净台；⑨细胞培养箱；⑩倒置相差显微镜四、操作方法4.1人类基因组DNA提取（略）4.2 基因组DNA 扩增VIP-CRE序列CRE-VIP代表一个CRE序列和一个VIP序列，它的长度为290bp。
以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增,两端的酶切位点分别为BamH I和Hind III。
●PCR反应液组成Buffer：5μlddH2O：37μl模板（基因组）：2μl引物（上）：1μl引物（下）：1μldNTP（10mM）：4μlTap酶：0.25μl●CRE-VIP的PCR扩增条件：94℃(5min)－[94℃（1min）－56℃（50s）－72℃（40S）]30cycles-72℃(5min)4.3 载体构建（略）4.4 质粒提取及检测所用质粒为PCMV-CB1 和 PBLUESCRIPT-3CRE-VIP-荧光素酶4.5 细胞培养●培养条件细胞培养基：含10%FBS的DMEM/Low Glucose温度：37度二氧化碳浓度：5%●传代方案1. 待细胞汇合度达到80-90%时，弃培养液。
2. 用1X PBS 漂洗细胞。
漂洗后，将PBS吸出。
3. 用含有0.25% (w/v) 的胰酶快速润湿细胞，润湿完毕后，弃胰酶并放置37度CO2培养箱孵育1-5分钟。
4. 消化期间可在显微镜中观察，若发现细胞变圆，立即停止孵育，加适当培养液。
5. 用吸管或枪头轻轻吹匀后根据实验需要选择合适的传代密度，推荐1:2至1:5。
4.6 转染●转染此实验步骤适合于进行6孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染。
1. 收获细胞，将处于生长状态良好的293细胞，以3-5×105的密度接种于6孔培养板中。
在37℃，5％CO2培养箱中继续培养18－24h。
2. 转染五、细胞模型的功能检测●细胞准备1.将6孔板中转染后的293细胞，以合适密度接种于48孔培养板中。
2. 在37℃，5％CO2培养箱中培养18-24h，使在进行实验的当天细胞达到70-80％的汇合度。
●药物刺激● 1. 提供CB1的激动剂WIN-55212-2， CB1的拮抗剂SR141716。
2. a.加含不同浓度WIN-55212-2的培养基，做激动剂刺激实验。
设对照。
设置平行组。
B.加含100nM 的WIN-55212－2 的不同浓度的SR141716培养基，做拮抗剂功能实验。
另设一空白对照、一正对照及一孔只含100nM WIN-55212－2。
设置平行组。
3. 于37℃，5％CO2培养箱培养中孵育4-5小时后，按荧光素酶报告基因检测部分，测定荧光素酶活性●荧光素酶报告基因检测1. 将细胞培养基从待检细胞中吸出。
2. 向细胞培养板中加入适当的1X 裂解缓冲液（48孔板：50ul）。
冰浴裂解10min。
3. 为萤光光度计(BERTHOLD, FB12 Luminometer)设置合适的时间延迟及测量时间。
典型的延迟时间为2 秒，典型的读数时间为4秒。
4. 取25μl 萤光素酶检测试剂加入事先收集的25μl细胞裂解上清液中，马上放入萤光光度计中读数。
如果产生的光强度足够，可以缩短检测时间。
5. 记录结果。
六、作图分析、讨论（PRISM绘图软件）实验设计（三选二）：A.不同转染试剂：lipofectamine 2000磷酸钙转染试剂B.不同的质粒比例C.激动剂和拮抗剂实验二、GPCR受体的膜定位和激活后内吞的观察– 16学时一、目的和要求1. 了解绿色荧光蛋白在受体表达定位及受体活化后内吞中的应用。
2. 理解受体失敏和内吞的含义，了解受体内吞在胞内信号转导中的地位。
二、基本原理G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）是一类高度保守的膜蛋白超家族,广泛存在于从真菌到哺乳动物的几乎所有生命体中。
细胞外信号通过G蛋白偶联受体将信息传递至胞内并通过效应系统发挥广泛调控作用。
绝大多数与G蛋白相偶联的受体在激动剂的长期或反复刺激下都会出现反应性降低现象称受体失敏（desensitization），而且随着作用时间的延长受体会经历不同的变化过程。
受体失敏发生在激动剂刺激后几秒至几小时内,此时虽然受体对刺激的反应性降低,但细胞膜表面的受体数量并未减少。
如果激动剂持续存在则会在几分钟至几小时内引起细胞膜表面的受体数量降低,即内吞(internalization)。
内吞的受体可能发生两种变化:一是在内含体（endosome）内发生去磷酸化,通过再循环回到胞膜表面,完成复敏( resensitization);二甚至受体进一步发生不可逆的降解, 从而引起受体下调( down-regulation)。
G蛋白偶联受体在特定激动剂诱导下，受体构象发生改变，构象改变后的受体被第二信使依赖的激酶或G蛋白偶联受体激酶识别并发生快速磷酸化。