流式测凋亡原理步骤和结果判断
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡
线粒体膜电位变化检测细胞凋亡实验原理JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。
可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。
这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。
常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。
通过JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
JC-1 单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。
实验用品1.12⨯75mm 的Falcon 管和15ml 聚苯乙烯离心管2.微量加样器和加样头3.线粒体检测试剂盒（货号551302，100tests），包括JC-1和10 ⨯ Assay Buffer, 注：每个KIT 包括 4 小瓶JC-1 试剂，每小瓶试剂足够检测25 个样本4.离心机5.CO2 培养箱6.流式细胞仪样本制备图1：试剂准备和JC-1 染色步骤总揽1.在JC-1粉末中加入125ulDMSO使其充分溶解，配成JC-1 Stock Solution，需根据实验的量分装-20度保存。
2.根据样本量配制JC-1 Working Solution，每个样品500ul 1×Assay Buffer + 5ulJC-1 Stock Solution。
流式细胞仪检测细胞凋亡
流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。
流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此，具有其它方法无可比拟的优越性。
本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下，或流式检测。
采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。
凋亡流式检测步骤
凋亡流式检测步骤凋亡是细胞生命的一个重要过程，它在生物体的正常发育和维持内稳态中起着关键作用。
凋亡的流式检测是一种常用的实验方法，通过分析细胞的染色性质和形态特征，可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
下面将介绍凋亡流式检测的具体步骤。
一、细胞样本的准备1. 收集需要检测的细胞样本，可以是细胞培养物或组织样本。
2. 用无菌PBS缓冲液洗涤细胞样本，去除培养基或组织液中的杂质。
3. 用离心机将细胞沉淀下来，去除上清液。
二、细胞的染色1. 用无菌PBS缓冲液重新悬浮细胞，使细胞浓度达到合适的浓度。
2. 加入适量的凋亡检测染料，常用的染料有Annexin V和PI。
3. 在室温下孵育一定时间，使染色剂与细胞充分反应。
三、流式细胞仪的设置1. 打开流式细胞仪，进行仪器的预热和校准。
2. 根据染色的荧光信号选择相应的检测通道，并设置适当的增益和门控。
3. 将已染色的细胞样本加入流式细胞仪的样本管中。
四、数据采集与分析1. 开始流式细胞仪的运行，以恒定的速度将细胞样本通过激光束。
2. 细胞在激光束中逐个通过，激光照射下的细胞会发出特定的荧光信号。
3. 流式细胞仪会记录下每个细胞的荧光信号，并将其转化为数字信号。
4. 利用流式细胞仪软件对采集到的数据进行分析和统计。
5. 根据细胞的荧光强度和染色的特征，可以判断细胞的凋亡状态。
通过以上步骤，我们可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
凋亡流式检测的优点是可以同时检测大量的细胞，具有高通量和高灵敏度的特点。
它在细胞生物学、免疫学和药物研发等领域都有广泛的应用。
值得注意的是，凋亡流式检测中的染色剂选择和流式细胞仪的设置对结果的准确性和可靠性有重要影响。
因此，在进行凋亡流式检测之前，需要仔细选择适合的染色剂和校准流式细胞仪。
同时，对于不同类型的细胞和凋亡机制，可能需要针对性地进行优化和调整。
凋亡流式检测是一种重要的实验方法，可以快速准确地检测细胞的凋亡状态。
通过合理的样本准备、细胞染色、仪器设置和数据分析，可以获得可靠的实验结果。
annexin v-fitc细胞凋亡检测原理
annexin v-fitc细胞凋亡检测原理Annexin V-FITC（荧光素I同型体）细胞凋亡检测是一种常用的流式细胞术，用于检测细胞凋亡的早期事件。
该方法基于细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PS）的外露，这是许多凋亡细胞的特征之一。
Annexin V是一种结合于PS上的蛋白质，它与FITC标记结合后，可以通过流式细胞仪检测到荧光信号。
以下是Annexin V-FITC细胞凋亡检测的基本原理：1.PS外露：在细胞凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞内层翻转到胞外层，暴露在细胞表面。
这一步骤是凋亡的早期事件之一，通常在细胞膜破裂之前发生。
2.Annexin V的结合：Annexin V是一种蛋白质，具有高亲和力与PS结合。
在细胞表面的PS外露后，Annexin V能够结合到PS上形成Annexin V-PS复合物。
3.FITC标记：Annexin V-FITC是一种带有荧光素I同型体（FITC）标记的Annexin V。
FITC是一种荧光标记，可以通过流式细胞仪检测。
4.流式细胞仪检测：经过Annexin V-FITC标记的细胞在流式细胞仪中被激发，FITC会发出荧光信号。
通过检测FITC的荧光信号，可以识别PS外露的细胞，从而确定细胞是否经历了凋亡。
通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测，可以将细胞分为四个主要类别：活细胞（Annexin V-FITC和PI均阴性）、早期凋亡细胞（Annexin V-FITC阳性、PI阴性）、晚期凋亡细胞（Annexin V-FITC和PI均阳性）和坏死细胞（Annexin V-FITC阴性、PI阳性）。
这种方法常用于研究药物诱导的细胞凋亡、细胞毒性等生物学过程。
流式测凋亡原理步骤和结果判断
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断一、原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。
二、步骤：1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。
用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。
待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。
重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。
将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。
整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V荧光，FL2通道检测PI荧光。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡A n n e x i n V检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的D N A断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12⨯75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10⨯，使用时，用稀释为1⨯浓度的应用液。
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度。
凋亡是一种正常的细胞死亡形式，它在维持机体内细胞平衡中起着重要的调节作用。
在流式细胞凋亡结果解读中，我们通常会关注两个参数：细胞凋亡率和凋亡程度。
细胞凋亡率是指在一定细胞总数中凋亡细胞数量所占的比例。
常用的流式细胞仪会使用特定的荧光探针，如Annexin V和PI，以区分细胞的生死状态。
Annexin V可以结合在凋亡细胞表面的磷脂，而PI则能够进入已损伤的细胞。
通过流式细胞仪的检测和分析，我们可以确定细胞的凋亡率。
凋亡程度是指凋亡细胞中发生的具体变化。
在凋亡过程中，细胞会发生DNA 断裂和染色质凝固，体积也会减小。
通过流式细胞仪可以进一步评估这些变化。
例如，可以使用荧光染料如Hoechst 33342染色核酸，以观察DNA断裂。
同时，还可以使用其他荧光探针或标记特定蛋白来检测凋亡相关的分子信号途径。
通过准确评估细胞凋亡率和凋亡程度，我们可以了解细胞对于各种刺激的响应和机体内细胞死亡的调节情况。
这对于研究疾病的发生机制、药物研发以及评估治疗效果都具有重要意义。
总之，流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度和凋亡细胞比例。
这种评估可以为我们研究细胞死亡的机制和判断治疗效果提供重要的参考。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断
一、原理：
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。
二、步骤：
1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。
用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。
待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。
重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。
将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，
混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。
整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V
荧光，FL2通道检测PI荧光。
同时以不加FITC- AnnexinV及PI的一管作
为阴性对照。
三、结果判断：
凋亡中晚期的细胞和坏死细胞其胞膜有损伤，PI能够穿透细胞膜而使DNA被PI着染产生红色荧光。
而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞对于细胞活性鉴定的染料PI有抗染性，则不会有红色荧光产生，正常活细胞与之相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，呈现（FITC+/PI-）。