第三章 酶的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
第三章 酶 一、 名词解释 1 Km 2 限速酶 3 酶的化学修饰 4 结合酶 5
第三章酶一、名词解释1.Km2.限速酶3.酶的化学修饰4.结合酶5.Allosteric regulation6.别构调节7.Activators8.辅基9.反竞争性抑制作用10.酶的特异性二、填空1.在酶浓度不变的情况下，底物浓度对酶促反应速度的作图呈____________双曲线，双倒数作图呈线。
2. Km值等于酶促反应速度为最大速度时的________________浓度。
3.关键酶所催化的反应具有下述特点：催化反应的速度，因此又称限速酶；催化反应，因此它的活性决定于整个代谢途径的方向；这类酶常受多种效应剂的调节。
4. 可逆性抑制作用中，抑制剂与酶的活性中心相结合，抑制剂与酶的活性中心外的必需基团相结合。
5. 酶的化学修饰主要有磷酸化与脱磷酸，，________________，腺苷化与脱腺苷及SH与-S-S-互变等，其中磷酸化与脱磷酸化在代谢调节中最为多见。
6. 同工酶指催化的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质的一组酶。
7. 竞争性抑制剂使酶对底物的表观Km ，而Vmax 。
8. 酶的特异性包括特异性，特异性与特异性。
三、问答1.简述酶的“诱导契合假说”。
2.酶与一般催化剂相比有何异同？3.什么是同工酶？请举例说明。
4.金属离子作为酶的辅助因子有哪些作用？5.说明温度对酶促反应速度的影响及其实用价值。
参考答案一、名词解释1. 即米氏常数。
Km米氏常数是单底物反应中酶与底物可逆地生成中间产物和中间产物转化为产物这三个反应的速度常数的综合。
Km=k2+k3/k1 米氏常数等于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
2.指整条代谢通路中，催化反应速度最慢的酶，它不但可以影响整条代谢途径的总速度，还可改变代谢方向，是代谢途径的关键酶，常受到变构调节和/或化学修饰调节。
3.某些酶分子上的一些基团，受其他酶的催化发生共价化学变化，从而导致酶活性的变化。
4.酶分子中除含有氨基酸残基组成的多肽链外，还含有非蛋白部分。
酶分子的化学修饰
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
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根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
简述酶的化学修饰调节的特点
简述酶的化学修饰调节的特点
酶的化学修饰调节是指通过酶分子上某些化学基团的改变，从而改变酶的活性或特性的过程。
这种调节方式具有以下特点：
1. 调节效率高：酶的化学修饰调节通常可以在短时间内快速响应细胞内环境的变化，使酶的活性迅速改变，以适应细胞的生理需求。
2. 调节方式多样：酶的化学修饰调节可以通过多种方式进行，如磷酸化、乙酰化、甲基化、腺苷酸化等。
不同的修饰方式可以导致酶的活性、稳定性、特异性等方面的改变。
3. 具有级联放大效应：酶的化学修饰调节可以引发一系列的级联反应，从而对细胞内的信号通路产生放大作用。
这种级联放大效应使得细胞能够对微弱的信号做出快速而强烈的反应。
4. 受多种因素调控：酶的化学修饰调节受到多种因素的调控，如激素、生长因子、细胞因子等。
这些因素可以通过影响酶的修饰酶或修饰底物的活性来调节酶的化学修饰。
5. 可逆性：酶的化学修饰调节通常是可逆的，即修饰后的酶可以通过去修饰酶的作用而恢复到原来的状态。
这种可逆性使得酶的活性可以在需要时快速改变，以适应细胞的生理需求。
总之，酶的化学修饰调节是一种高效、多样、可逆的调节方式，对于细胞内代谢、信号转导等过程的精确调控具有重要意义。
酶的化学修饰
酶化学修饰的基本原理
3．抗蛋白水解酶 酶分子的基本结构是蛋白质，所以易受蛋
白酶的攻击而遭破坏。蛋白酶一般是作用于某 些特定氨基酸残基之间的酰胺键，修饰这些氨 基酸残基，可以阻止蛋白酶对这些酰胺键的攻 击。另外，交联于酶分子上的大分子修饰剂能 产生空间障碍，阻止蛋白酶接近攻击点，起到 “遮盖”敏感键的作用。
三、酶化学修饰方法的设计
酶化学修饰的基本原则都是充分利用修 饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或 经过一定的活化过程后与酶分子上的某种氨 基酸残基产生化学反应。
设计酶化学修饰方法时 的注意事项
a. 对修饰剂的要求 在选择修饰剂时一般要求修饰剂有较大的分子
量，良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面 有较多的反应活性基团，与氨基酸残基形成的共价 键稳定，容易鉴定 。
酶改造的两个水平
基因水平：有目的的改变基因中的核苷酸顺序， 从而改变酶的氨基酸顺序，以期获得化学结构更 为合理的酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。
蛋白质水平：人们用化学法或酶法对已合的酶 的结构进行改造，一方面是切除部分肽链和置换 某些氨基酸，另一方面是使酶分子中的某些氨基 酸残基与一些化学试剂反应，加上一些特定的基 团，即酶的化学修饰。由于后一方面技术较为简 单，容易见效，所以这方面的工作做得最多。
高碘酸氧化法
由于反应产物A不稳定，所以用四氢硼钠还原成稳定产物B。用四氢硼钠还原 的反应比较激烈，对酶活性影响较大，因此可在酶与右旋糖酐之间加一个手臂来 减少酶的失活，如加一个联苯胺。
四、修饰剂及修饰反应
1．糖及糖的衍生物
（1）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 右旋糖酐是由α -葡萄糖通过α -1,6-糖苷键形
成的高分子多糖，具有较好的水溶性和生物相容性， 可用作代血浆。右旋糖酐硫酸酯是右旋糖酐分子中 的羟基与硫酸成酯而得。多糖链上的双羟基结构经 活化后可与酶分子上的自由氨基结合。双羟基的活 化除溴化氰法外，还有高碘酸氧化法。高碘酸能通 过氧化邻双羟基结构而将葡萄糖环打开，形成的高 活性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶 共价结合。
酶的化学修饰
第四节 酶的亲和修饰
• 亲和标记：
• 又称专一性的不可逆抑制主要指的是修饰 剂具有与底物相类似的结构，对酶活性部 位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨 基酸残基进行共价标记。
• 亲和试剂作为底物类似物应具有的条件： 1）在酶不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形 成可逆的复合物 2）没有反应性的竞争性的配体存在 3）试剂的体积不能过大，防止空间障碍的产 生 4）修饰产物稳定，有利于分析
• 酶的化学修饰（chemical modification）： 酶的化学修饰（chemical modification）： • 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价
结构发生改变。
• 酶选择性化学修饰： • 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。
二、酶化学修饰的目的
第三章 酶的化学修饰
酶作为生物催化剂，其高效性和专 一性是其他催化剂无法比拟的，但是天 然酶的半衰期短，不稳定性等问题限制 了它的应用，如何延长半衰期，提高酶 的稳定性，降低抗原性等越来越引起人 们的关注了。酶的化学修饰是可以从分 子的水平上来改造酶，弥补天然酶缺陷 的一种重要的手段。
一、酶化学修饰的概念
1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范 围。（70年代末之后） 围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。 4）产生新的催化能力。
②化学修饰数据的分析
•
化学修饰的时间进程分析 根据获得的 时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质 和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间 的关系等，实际是通过测定蛋白质的失活 速度常数的测定。大多实验中，修饰剂远 远多于被修饰的残基，可认为是假一级反 应，然后用残余活力的对数对时间作图， 得出失活常数。
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第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合5、酶微环境稳定的维持pH值改变时：①破坏了酶分子上静电形成的化学键，氢键等维持天然构象的平衡力②改变了酶分子上氨基酸残基的离解状态和它们之间的相互结合及作用方式许多大分子修饰剂本身就是多聚电解质，能在酶分子表面或微环境区域形成一层“缓冲外壳”。
第二节酶分子修饰的基本要求和条件一、修饰剂的要求1、修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性2、修饰剂上反应基团的数目及位置3、修饰剂上反应基团的活化方法与条件一般要求较大分子量、良好的生物相容性和水溶性、分子表面有较多反应活性基团；试剂的选择—要根据修饰目的选择例如对氨基修饰可有几种情况——修饰所有氨基而不修饰其它基团；仅修饰 -氨基；修饰暴露的或反应性高的氨基；修饰具有催化活性的氨基；例：如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。
用于修饰酶的氨基酸残基的试剂应具备：⏹选择性地与一个氨基酸残基反应；⏹反应在酶蛋白不变性条件下进行；⏹所标记的残基在肽链中稳定以易于分离鉴定；⏹修饰反应的程度能简单测定；二、酶性质的了解（1）酶的稳定性热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等（2）酶活性中心的状况活性中心基团、辅因子等。
其他如分子大小、性状、亚基数等（3）酶侧链基团的性质及其反应性巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、二硫键、硫醚基等三、反应条件的选择修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。
（1）pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。
由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与修饰剂的比例四、酶蛋白修饰反应的主要类型1. 酰基化反应试剂特点：O含有R-C-结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化可作用基团：氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、酸酐磺酰氯、硫代酸氟乙酰乙酯等。
2. 烷基化反应试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
修饰剂：2，4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。
3. 氧化和还原反应试剂特点：具有氧化性或还原性氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基、咪唑基，酚基等还原剂：2-巯基乙醇、DTT等可被还原的侧链基团：二硫键4. 芳香环取代反应试剂：卤（碘）化，硝化试剂5.溴化氰裂解反应BrCN裂解Met反应可在自发诱导重排条件下导致肽键断裂。
第三节酶分子的修饰方法酶的表面修饰——化学固定化1. 通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上，从而改变酶所处的环境，酶的性质也相应发生改变。
例如：酶固定到电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH发生偏移。
糖化酶固定到阴离子载体上，最适pH4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适pH7.5 靠近，可简化高果糖浆生产工艺。
2. 载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km增加，反之，Km降低。
3. 增加酶分子构象稳定性。
酶的表面修饰——小分子修饰作用⏹利用特定的小分子修饰剂修饰酶表面的一些基团：-COO-、-NH3+、-SH、-OH等。
⏹α-胰蛋白酶表面的-NH3+→NH2COOH→60℃，热稳定性提高1000倍。
酶分子的侧链基团修饰⏹采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
⏹酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。
主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。
催化活性/非催化活性基团的修饰⏹对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。
⏹经常被修饰的残基是：亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His⏹亲电的Tyr、Trp⏹对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。
研究热点-核酸类酶的修饰RNA酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。
主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。
氨基的化学修饰：来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂:三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修饰剂：2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差常用水溶性羰二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸，可定量测定酶分子中羧基的数目巯基的化学修饰来源：Cys 饰反应:烷基化修饰剂：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM)N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂）汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸(pCMB)和2-氯汞硝基苯酚等Ellman试剂：5，5’二硫-二-（2-硝基苯甲酸)是目前最常用的巯基修饰试剂，还可用来测定酶蛋白巯基含量胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2－环己二酮酚羟基的化学修饰来源：Tyr修饰反应：芳香环取代反应、酚羟基的修饰修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、硝化试剂四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰咪唑基的化学修饰来源：His修饰反应:酰基化与烷基化酰基化修饰剂: 焦碳酸二乙酯烷基化修饰剂：碘乙酸吲哚基的化学修饰来源：Trp修饰反应：氧化反应修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）4-硝基苯硫氯二硫键的化学修饰还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）解释修饰效果须十分小心，因为：①任何一种修饰剂不是绝对专一的。
②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活。
③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。
酶的表面修饰——大分子修饰（大分子结合修饰），是目前应用最广的酶分子修饰方法。
1定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。
2修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子结合。
非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。
一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。
另一类添加物就是蛋白质。
蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。
共价修饰⏹用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
⏹例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。
⏹每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；⏹每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍。
大分子修饰(共价)的过程⏹修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。
例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。
要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。
⏹修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。
使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。
⏹修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。
⏹分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得有较好修饰效果的修饰酶。
聚乙二醇及其修饰反应聚乙二醇的特点：①线性分子(HO-CH2-CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在体内无毒性、无残留、无免疫原性；④末端活化后可与酶产生交联；⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变。
聚乙二醇作为修饰剂应注意的问题：①PEG分子量为750~5000的修饰效果较好，用甲氧基PEG效果更好；②修饰效果还与所用活化剂与酶的配比有关，PEG : E=15~50 : 1 → 40%活力保持。