化学修饰酶
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰就是在分子水平上 对酶进行改造，以达到改构和改性的目 的。在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化 酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗 原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延 长了半衰期，从而提高了药效。
PEG是线性大分子，具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、 无免疫原性，并可消除酶分子的抗原性， 被广泛用于酶的修饰。
PEG末端活化后可以与酶产生交联，使酶 分子被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导 致动力学发生改变，从而产生许多有用 的性质，如可以在广泛的pH范围内溶解、 不被离子交换剂吸附，电泳迁移率下降 等。
加酶液
E E E
S
P
图：反相胶团的结构和酶的分布
二、酶分子的内部修饰 （一）非催化活性基团的修饰：通过对 非催化残基的修饰可以改变酶的动力学 性质，改变酶对特殊底物的亲和力；
（二）酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶 法进行修饰，用蛋白酶对主联进行部分 水解，可以改变酶的催化特性。
（三）催化活性基团的修饰：通过选择 性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨 基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转 化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称 为化学突变法。
46
40 20 50 0
64
90 99 95 80
二、抗原性：修饰酶的抗原性与修饰剂 有关，目前比较公认的是PEP和人血清白 蛋白在消除酶分子抗原性方面效果较好。
修饰酶的抗原性变化
酶
胰蛋白酶 过氧化氢酶 Arg 酶
04酶分子的化学修饰
猪肝尿酸酶 糜蛋白酶 吲哚-3 -链烷羟化酶 猪肝尿酸酶 产沅假丝酵母尿酸酶
修饰剂
白蛋白 肝 素 聚丙烯酸 PEG PEG
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2 8.2
修饰酶
7.4 - 8.5
9.0 5.0 - 5.5 9.0 8.8
作业题：
1、名词解释：酶分子修饰 2、酶分子的化学修饰方法有哪些？ 3、酶肽链的大分子共价修饰的修饰剂和修 饰反应有哪些？ 4、分析说明修饰酶的性质。
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，
作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质， 抑制剂的性质等。
（二）酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心
的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子 等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性 1、对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂和Ellman试剂等。 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂友乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、 2，4-二硝基氟苯、烷基化时剂、丹磺酰氯(DNS)和 苯异硫氰酸酯（ PITC)等。 3、羧基的化学修饰： 水溶性羰二亚胺或氨化反应、硼氟化三甲锌盐反应、 甲醇-盐酸酯化反应等。 4、咪唑基的修饰反应： 焦碳酸二乙酯反应、碘代反应、碘化反应等。
（三）酶蛋白修饰反应的主要类型 酯化及相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应 溴化氰裂解反应
第三节 酶蛋白肽链的大分子修饰
一、聚乙二醇及其修饰反应：聚乙二醇（PEG）是线 性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体 内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶分子 的抗原性，被广泛用于酶的修饰。 聚乙二醇末端活化后可以与酶产生交联，使酶分子 被覆盖上一层疏松的亲水外壳，导致动力学发生改 变，从而产生许多有用的性质，如可以在广泛的 pH范围内溶解、不被离子交换剂吸附，电泳迁移 率下降等。 主要的修饰方法有：叠氮法、琥珀酸酐法、三氯均 嗪法、羰二亚胺法、重氮法。
酶的化学修饰调节的特点
酶的化学修饰调节的特点酶的化学修饰调节是生物体内的一种重要调节方式，其特点主要包括以下几个方面：1、具有高度选择性：酶的化学修饰调节通常具有高度选择性，只针对特定的酶进行修饰，而对其他酶几乎没有影响。
这种选择性保证了生物体内不同酶的活性能够被精确地调控。
2、调节效果稳定：酶的化学修饰过程通常比较稳定，一旦酶被修饰，其活性往往会持续较长时间。
这使得酶的化学修饰调节能够在生物体内发挥持久的调节作用。
3、可逆性和可调控性：许多酶的化学修饰是可逆的，这使得酶的活性可以在不同的生理状态下进行动态的调整。
例如，在饥饿状态下，某些酶可能会被磷酸化而失活，而在饱食状态下，这些酶可能会被去磷酸化而重新激活。
这种可逆性和可调控性使得酶的化学修饰调节能够很好地适应生物体的不同生理需求。
4、具有级联放大效应：酶的化学修饰调节往往具有级联放大效应，即当一个酶被修饰后，会进一步影响其他酶的活性，从而产生更大的生理效应。
这种放大效应使得微小的调节信号能够引发一系列的生理反应，最终导致显著的生理变化。
5、参与能量代谢的调节：酶的化学修饰调节在能量代谢过程中发挥着重要作用。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，控制糖原的合成和分解，以及脂肪酸的氧化和合成等过程。
这些过程对能量的产生和利用至关重要，因此酶的化学修饰调节在能量代谢的平衡中起到关键作用。
6、涉及多种修饰方式的协同作用：酶的化学修饰包括多种方式，如磷酸化、乙酰化、甲基化等。
不同的修饰方式可以产生不同的调节效果，有时甚至可以相互拮抗或协同。
这种多种修饰方式的协同作用使得酶的化学修饰调节更加精细和复杂。
7、参与信号转导：酶的化学修饰不仅调节酶的活性，还参与信号转导过程。
例如，当细胞受到外界刺激时，某些酶会被磷酸化或去磷酸化，从而触发一系列的信号转导通路，最终导致相应的生理反应。
综上所述，酶的化学修饰调节具有高度选择性、调节效果稳定、可逆性和可调控性、级联放大效应、参与能量代谢的调节、多种修饰方式的协同作用以及参与信号转导等特点。
酶分子的化学修饰
酶分子的化学修饰，就是在分子水平上对 酶分子的化学修饰 酶进行改造，以达到改构和改性的目的。 即：在体外将酶分子通过人工的方法与一 些化学基团(物质)，特别是具有生物相容 性的物质，进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这种物质被称为修饰试剂 修饰试剂。 修饰试剂 化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾 病治疗。医疗用酶要求酶的稳定性高、纯 度高、无免疫原性。
•脂质体包裹 脂质体包裹
酶脂质体包埋属于固定化修饰之一。许多医 药酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量大，不 易进入细胞内，而且在体内半衰期短，产生 免疫原性反应。这些是酶在临床上必须解决 的问题。为此，可通过酶的表面化学修饰来 解决。例如：SOD用聚乙二醇(PEG)修饰后， 其在体内的稳定件及免疫原性都大大改善。 至于如何进入细胞内，用脂质体包裹是个有 效的方法。
（2）酶蛋白主链的修饰
至今，酶蛋白主链修饰主要是靠 酶法。例如：用蛋白酶对ATP酶有 限水解，切除其十几个残基后，酶 活力提高了5.5倍。该活化酶仍为 四聚体，亚单位分子量变化不大。 这说明天然酶并非总是处于最佳的 催化构象状态。
（3）催化活性基团的修饰
通过选择性修饰氨基酸侧链成分来实现氨基酸的 取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的 氨基酸侧链的方法叫化学突变法 化学突变法。例如：Berder 化学突变法 等人，将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转 化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或酯没 有水解能力，但能水解硝基苯酯等高度活化的底 物。这种方法由于受到专一试剂、有机化学工业 水平的限制，没有蛋白质工程技术普遍，但它通 过产生非蛋白质氨基酸的能力，可以有力地补充 蛋白质工程技术。
②大分子共价修饰
用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素 等，通过共价键连接于酶分子的表面、形成一层 覆盖层。这种可溶性酶有许多有用的性质：如用 聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(S0D)，不仅可以降 低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药 效。日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋 白酶上所得产物溶于有机溶剂，仍能有效地起作 用。嗜热菌蛋白酶通常在水介质中催化肽链裂解， 但用聚乙二醇共价修饰后，可在有机溶剂中催化 肽键合成，已用于合成甜味剂。
酶分子的化学修饰
2、定点突变和化学修饰结合技术
利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出 了新型的酶制剂。将定点突变所得酶进行化学修饰， 得到一些新颖的酶制剂。利用定点突变技术在酶的关 键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰 法对突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化 合物，得到一种化学修饰突变酶。
枯草杆菌蛋白酶化学修饰突变过程
1、交联技术
酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作 用于分子间或分子内部的交联方式，能提高酶的稳定 性，防止酶在不良环境中失活。 Fernandez 等提出了一种新颖的分子内交联方式。 实验表明这种方式在酶主要的氨基基团上，戊二醛 （GLU）对其进行了交联修饰（修饰度45% ~ 55%）， 然后把修饰酶在pH 9 和20C 的条件下老化30 min。在 这段时间内酶的活性虽然有所损失，但是稳定性提高 了3 倍。
实验结果分析： 反应pH对PA-PPL活性的影响—— 修饰酶PA-PPL的水解活性明显高于原酶PPL， 且PPL在修饰前后，最适pH范围未发生明显变 化，均为7.0-8.0。
实验结果分析： 反应温度对PA-PPL活性的影响——
在试验温度范围内，修饰酶PA-PPL的水解活性明显高 于原酶PPL，但二者的最适反应温度相同，都为 40℃ ．
刘宏芳,侯瑶,赵新淮;大豆蛋白限制性酶解修饰与产品的溶解性和保 水性变化[J];东北农业大学学报;2009-01,40(1):97-103. 田国贺,郭佳宓,吕团伟等；聚乙二醇对菠萝蛋白酶的化学修饰[J]； 生物技术；2006-02,16(1):35-38.
二、原理、修饰剂及反应
1、化学修饰原理
1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
酶的化学修饰
酶化学修饰的基本原理
3．抗蛋白水解酶 酶分子的基本结构是蛋白质，所以易受蛋
白酶的攻击而遭破坏。蛋白酶一般是作用于某 些特定氨基酸残基之间的酰胺键，修饰这些氨 基酸残基，可以阻止蛋白酶对这些酰胺键的攻 击。另外，交联于酶分子上的大分子修饰剂能 产生空间障碍，阻止蛋白酶接近攻击点，起到 “遮盖”敏感键的作用。
三、酶化学修饰方法的设计
酶化学修饰的基本原则都是充分利用修 饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或 经过一定的活化过程后与酶分子上的某种氨 基酸残基产生化学反应。
设计酶化学修饰方法时 的注意事项
a. 对修饰剂的要求 在选择修饰剂时一般要求修饰剂有较大的分子
量，良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面 有较多的反应活性基团，与氨基酸残基形成的共价 键稳定，容易鉴定 。
酶改造的两个水平
基因水平：有目的的改变基因中的核苷酸顺序， 从而改变酶的氨基酸顺序，以期获得化学结构更 为合理的酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。
蛋白质水平：人们用化学法或酶法对已合的酶 的结构进行改造，一方面是切除部分肽链和置换 某些氨基酸，另一方面是使酶分子中的某些氨基 酸残基与一些化学试剂反应，加上一些特定的基 团，即酶的化学修饰。由于后一方面技术较为简 单，容易见效，所以这方面的工作做得最多。
高碘酸氧化法
由于反应产物A不稳定，所以用四氢硼钠还原成稳定产物B。用四氢硼钠还原 的反应比较激烈，对酶活性影响较大，因此可在酶与右旋糖酐之间加一个手臂来 减少酶的失活，如加一个联苯胺。
四、修饰剂及修饰反应
1．糖及糖的衍生物
（1）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯 右旋糖酐是由α -葡萄糖通过α -1,6-糖苷键形
成的高分子多糖，具有较好的水溶性和生物相容性， 可用作代血浆。右旋糖酐硫酸酯是右旋糖酐分子中 的羟基与硫酸成酯而得。多糖链上的双羟基结构经 活化后可与酶分子上的自由氨基结合。双羟基的活 化除溴化氰法外，还有高碘酸氧化法。高碘酸能通 过氧化邻双羟基结构而将葡萄糖环打开，形成的高 活性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶 共价结合。
第三章酶的化学修饰
第三章酶的化学修饰第一节酶的分子修饰一、酶的化学修饰原因1、稳定性2、酶反应的最适条件3、酶的专一性4、米式常数过大5、临床应用的特殊要求6、酶种类的限制改变酶特性有两种主要的方法：1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。
二、酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。
三、酶分子修饰的意义⏹提高酶的活力⏹增强酶的稳定性⏹降低或消除酶的抗原性⏹研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响化学修饰效果举例用纤维蛋白的专一性单克隆抗体修饰尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。
用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60℃热处理的稳定性增高了1000倍。
超氧化物歧化酶(SOD)、L-谷氨酰胺酶、L-天门冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％-45％。
四、酶化学修饰的基本原理1、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。
使酶的天然构象产生“刚性”结构。
2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：A 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。
“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
B 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
4、如何消除酶的抗原性酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
酶的化学修饰
第五章酶分子的化学修饰主要内容：●酶的活性中心●酶化学修饰的目的●酶化学修饰的原理●酶化学修饰的设计●酶化学修饰的应用第一节酶的活性中心（active site）一、活性中心的概念P12酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.酶的必需集团在一级结构上并不互相毗邻，往往分散在氨基酸系列中，甚至分布在不同肽链上。
当肽链盘曲、折叠形成空间结构时，互相隔离的必需基团彼此靠近，集中在酶分子表面而形成具有三维结构的特定区域。
该区域能与底物结合并发挥催化作用，故称酶的活性中心(active center)活性部位（active site）。
对于结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。
活性中心的重要化学基团——7种氨基酸出现的频率最高：Lys、Asp、Glu、Cys、His、Tyr和Ser（兰天果拌猪肉丝）。
某些功能基团（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。
图释左图：丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基右图：天冬氨酸和谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、酪氨酸和丝氨酸的羟基。
二、活性中心的共性P12(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。
(2)活性部位是一个三维实体(entity)(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。
(4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）(5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。
1．The active site takes up a relatively small part of the total volume of an enzyme.左图：肌球蛋白模型。
只显示出α-碳原子，红的为血红素，绿的是两种关键的组氨酸残基。
右图：来自胞质热激蛋白的ATP酶片段的结构图。
ADP（红的）位于两个结构域（黄和蓝的）之间的裂缝中。
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化学修饰酶
化学修饰酶是一种能够改变生物分子结构和功能的酶类，其作用
范围非常广泛，涉及到细胞信号传导、蛋白质合成、基因调控等多个
生命过程。
在本篇文章中，我们将对化学修饰酶的作用原理、分类、
应用领域等方面进行详细介绍。
一、化学修饰酶的作用原理
化学修饰酶通过加入或者去除细胞内生物分子上的化学修饰基团
来改变其结构和功能。
常见的化学修饰基团包括磷酸基团、甲基基团、酰化基团等。
在细胞生命过程中，化学修饰酶能够调控蛋白质的翻译
后修饰、基因表达、分子信号传递等多个关键过程，从而影响细胞的
生长、分化、凋亡以及疾病进程等生理和病理过程。
二、化学修饰酶的分类
化学修饰酶可以根据其介导的首选化学修饰反应类型被分为酵素
芯片、修饰转移酶、去乙酰化酶等多个类别。
其中，酵素芯片以其高
通量筛选和识别技术在生物芯片、药物筛选等领域发挥了重要作用。
修饰转移酶是一类负责在生物分子上加入新的化学基团的酶类，其在
翻译后修饰、DNA甲基化等关键过程中起到举足轻重的作用。
去乙酰化酶则是负责减少蛋白质酰化基团数量的酶类，对于多种疾病的治疗具
有广泛的潜力。
三、化学修饰酶的应用领域
由于化学修饰酶具有丰富的功能和广泛的应用领域，目前已经成
为分子生物学、药物化学等多个领域的研究热点。
具体而言，它在药
物筛选、肿瘤治疗、神经科学、蛋白质翻译后修饰等领域发挥了重要
作用。
例如，化学修饰酶可以通过调控癌症细胞内的化学修饰作用来
达到治疗肿瘤的目的；它还可以利用其修饰调控蛋白质的方式，探索
各种生命过程中的控制机制，并创造更加精准的基因编辑和定向治疗
方法。
综上所述，化学修饰酶在细胞内的作用机制、分类、应用领域上
都展现出其巨大的潜力。
我们相信，随着对化学修饰酶的研究不断深入，其在医学、生物学等领域中的应用前景也将不断拓展。