微生物学教案

3、固体培养基分离纯培养物的基本方法和原理纯培养指的是只有一种微生物组成的细胞群体。

自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。

进行微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基由于能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体－即纯培养，而成为常用而简便的分离介质和营养介质。

固体培养基分离纯培养物由于稀释方法的差异和接种平板的方式差异而分为以下几种方法：（1）划线平板法将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板，按以下方法划线：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。

（2）倾注平板法和涂布平板法这两种方法的共同点就是在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，参考下图：随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。

染色操作的基本程序为：制片，干燥，固定，染色，水洗，干燥，镜检。

ˉ革兰氏染色（于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。

）结晶紫初染，碘液媒染，酒精脱色，番红复染。

教案三第三章：微生物细胞的结构与功能第一节：原核微生物1、微生物的主要类群：2、原核微生物指细胞核无核膜包裹，只存在由裸露DNA组成的核区（nuclear region) 的原始单细胞生物。

主要类群包括细菌与古生菌。

细菌又称真细菌（eubacteria），包括普通细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原体等 (三菌三体）。

古生菌，在进化谱系上与真细菌及真核生物相互并列，且与后者关系更近，而其细胞构造却与真细菌较为接近，同属于原核生物。

3、细菌细胞的基本形态基本形态：球状、杆状、螺旋状和其他形状。

球状菌：细胞个体呈球形或椭圆形，球菌在细胞分裂时形成的不同空间排列方式，常被作为分类依据。

杆状菌：细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，可作为分类依据；而长度和排列方式常因生长阶段和培养条件不同而发生较大变化，一般不作为分类依据。

螺旋状：包括（1）弧菌，其菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。

（2）螺菌, 菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异(1-20)。

鞭毛二端生。

细胞壁坚韧，菌体较硬。

（3）螺旋体菌,菌体柔软，螺旋数目因种而异(3-70)。

用于运动的类似鞭毛的轴丝位于细胞外鞘内。

其它形状：包括柄杆菌、星形细菌、方形细菌及各种条件下细胞正常发育受阻而产生的异常形态4、细菌细胞的大小一般细菌大小的度量单位为微米（micrometer, μm），目前发现的细菌中最小的与无细胞结构的病毒相仿（约50 nm）；最大的肉眼可见（ mm）。

一般细菌的大小范围：球菌， ~ 1μm （直径）；杆菌~ 1μm （直径）× 1~ 80μm（长度）；螺旋菌~ 1 mm （直径）× 1~ 50 mm（长度）(长度是菌体两端点之间的距离，而非实际长度)。

5、细菌细胞的基本结构6、细胞壁的主要功能①固定细胞外形和提高机械强度，从而使其免受渗透压等外力的损伤。

②为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需。

失去了细胞壁的原生质体，也就丧失了这些重要功能；③阻拦酶蛋白和某些抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；④赋予细菌具有特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性。

7、革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁的化学组成和结构特点革兰氏阳性（G+）菌细胞壁特点：厚度大（20~80nm），化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。

肽聚糖是真细菌细胞壁中的特有成分。

磷壁酸为革兰氏阳性细菌细胞壁中特有的一种酸性多糖。

革兰氏阴性（G-）细菌细胞壁特点结构分为肽聚糖层和外膜层。

其特点是肽聚糖层薄 (2-3nm)，层次多，化学组分复杂，强度低。

8、肽聚糖单体的化学组成和结构肽聚糖单体中的化学组成：①双糖单位，由由N-乙酰胞壁酸（NAM or M）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG or G）l两种单糖之间以β-1,4-糖苷键[ M(1)-G(4)]连接形成。

该糖苷键很容易被溶菌酶 (lysozyme) 所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。

双糖单位是肽聚糖中糖链骨架的基本结构单位。

②四肽侧链，由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成，连接于糖骨架的N-乙酰胞壁酸分子上。

③肽桥连接一条肽侧链的4位氨基酸和另一条肽侧链的3位氨基酸，变化多样，是不同微生物肽聚糖多样性的基础。

目前所知的肽聚糖已超过100种，主要的变化发生在肽桥上。

（附结构示意图）9、磷壁酸革兰氏阳性细菌细胞壁上特有的化学成分，主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。

膜磷壁酸(又称脂磷壁酸)跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的，由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。

其含量与培养条件关系不大。

可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。

壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。

用稀酸或稀碱可以提取。

磷壁酸的主要生理功能 (p41)①其磷酸分子上较多的负电荷可提高细胞周围Mg2+的浓度，进入细胞后就可保证细胞膜上一些需Mg2+的合成酶提高活性；②贮藏磷元素；③增强某些致病菌如A族链球菌(Streptococcus)对宿主细胞的粘连、避免被白细胞吞噬以及抗补体的作用；④赋予革兰氏阳性细菌以特异的表面抗原；⑤可作为噬菌体的特异性吸附受体；⑥能调节细胞内自溶素(autolysin)的活力，借以防止细胞因自溶而死亡。

因为在细胞正常分裂时，自溶素可使旧壁适度水解并促使新壁不断插入，而当其活力过强时，则细菌会因细胞壁迅速水解而死亡。

10、革兰氏阴性细菌的细胞壁（1）肽聚糖它的肽聚糖埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm)，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。

四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys，而是内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)，一种只有在原核微生物细胞壁上才有的氨基酸。

没有特殊的肽桥，其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸——D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸——mDAP的氨基直接相连 ,只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套。

（2）外膜位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层，由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜，有时也称为外壁。

a 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）位于革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的一层较厚（8~10nm）的类脂多糖类物质，由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链（O-specific side chain，或称O-多糖或O-抗原）三部分组成。

Man, mannose, 甘露糖Abe, abequose, β-脱氧岩藻糖Rha, rhamnose,鼠李糖Gal, galactose, 半乳糖Glu, glucose, 葡萄糖（1）假肽聚糖(pseudopeptidoglycan)细胞壁：代表菌——甲烷杆菌属( Methanobacterium )。

（2）独特多糖细胞壁：代表菌——甲烷八叠球菌( Methanosarcina )（3）硫酸化多糖细胞壁：代表菌——盐球菌（Halococcus）（4）糖蛋白(glycoprotein)：代表菌——盐杆菌属( Halobacterium)（5）蛋白质细胞壁：有的是由几种不同蛋白组成，如甲烷球菌( Methanococcus )和甲烷微菌( Methanomicrobium )；有的则由同种蛋白的许多亚基组成，甲烷螺菌属( Methanospirillum )。

12、缺壁细菌（1）L型细菌（L-form of bacteria）：细菌在某些环境条件下（实验室或宿主体内）通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷变异型。

因英国李斯德（Lister）预防研究所首先发现而得名（1935年，念珠状链杆菌Streptobacillus moniliformis）。

大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌、分枝杆菌和霍乱弧菌等20多种细菌中均有发现，被认为可能与针对细胞壁的抗菌治疗有关。

特点：没有完整而坚韧的细胞壁，细胞呈多形态；有些能通过细菌滤器，故又称“滤过型细菌”；对渗透敏感，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落（直径在左右）；（2）原生质体（protoplast）在人为条件下，用溶菌酶处理或在含青霉素的培养基中培养而抑制新生细胞壁合成而形成的仅由一层细胞膜包裹的，圆球形、对渗透压变化敏感的细胞，一般由革兰氏阳性细菌形成。

特点：对环境条件变化敏感，低渗透压、振荡、离心甚至通气等都易引起其破裂；比正常有细胞壁的细菌更易导入外源遗传物质，是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。

（3）球状体(sphaeroplast)? ，又称原生质球采用上述同样方法，针对革兰氏阴性细菌处理后而获得的残留部分细胞壁（外壁层）的球形体。

与原生质体相比，它对外界环境具有一定的抗性，可在普通培养基上生长。

（4）枝原体(Mycoplasma)在长期进化过程中形成的、适应自然生活条件的无细胞壁的原核生物。

因它的细胞膜中含有一般原核生物所没有的甾醇，所以即使缺乏细胞壁，其细胞膜仍有较高的机械强度。

13、细菌细胞膜的特点细胞质膜是紧贴在细胞壁内侧、包围着细胞质的一层柔软、脆弱、富有弹性的半透性薄膜，厚约7～8nm，由磷脂（占20%～30%）和蛋白质（占50%～70%）组成。

膜蛋白包括具运输功能的整合蛋白）或内嵌蛋白；具有酶促作用的周边蛋白或膜外蛋白等。

细菌细胞膜是一个重要的代谢活动中心，其膜蛋白约占细菌细胞膜的50%～70%，比任何一种生物膜都高，而且种类也多。

真核生物细胞膜中一般含有胆固醇等甾醇，含量为5%-25%。

原核生物与真核生物的最大区别就是其细胞膜中一般不含胆固醇，而是含有（hopanoid）。

由磷脂分子形成的双分子膜中加入甾醇类物质可以提高膜的稳定性。

14、细菌细胞膜的生理功能①选择性地控制细胞内、外的营养物质和代谢产物的运送；②是维持细胞内正常渗透压的屏障；③合成细胞壁和糖被的各种组分（肽聚糖、磷壁酸、LPS、荚膜多糖等）的重要基地；④膜上含有氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢的酶系，是细胞的产能场所；⑤是鞭毛基体的着生部位和鞭毛旋转的供能部位.15、古生菌的细胞质膜——重点在于其独特性和多样性在本质上也是由磷脂组成，但它比真细菌或真核生物具有更明显的多样性。