等温滴定量热法
ITC等温滴定量热法的操作说明解读
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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典型的ITC数据
等温滴定量热法
等温滴定量热法在一次实验中直接进行关于生物分子亲和力和热力学特性的无标记测定等温滴定量热法（ITC）是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术。
它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。
ITC是唯一一种能够在一次试验中同时确定所有结合参数的技术。
ITC可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。
通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数（K D）、反应化学量（n）、焓（∆H）和熵（ΔS）。
这就提供了有关分子相互作用的完整热力学信息。
ITC不仅可测定结合亲和力，还能阐明潜在分子相互作用的机制。
更深入了解结构－功能关系，让我们能够更加自信地在苗头化合物选择和先导化合物优化方面作出决策。
测量原理：等温滴定量热法用来测定各生物分子之间的反应。
该方法可测定结合亲和力、化学计量以及溶液中结合反应的熵和焓，无需使用标记。
发生结合时，热不是被吸收就是被释放，这是在配体被逐渐滴定到包含目标生物分子的样品池过程中通过灵敏量热计而测得。
工作原理热核心微量热计中有两个池，其中一个含有水，作为参比池，另一个含有样品。
微量热计必须使这两个池保持完全相同的温度。
热敏装置检测发生结合时两个池之间的温差，并反馈给加热器，由加热器来补偿该温差并使两个池恢复到相同的温度。
进行测量参比池和样品池被设定到所需的实验温度。
将配体装入一个非常精确的注射装置上的注射器中。
将注射装置插入包含目标蛋白质的样品池中。
将一系列小份配体试样注入到蛋白质溶液中。
如果有配体与蛋白质结合，则可检测到并测出几百万分之一摄氏度的热量变化。
进行第一次注射时，微量热计测量被释放的所有热量，直到结合反应达到平衡。
测得的热量与结合量成正比。
结果和数据分析在下面的示例中，反应是放热的，这就意味着样品池温度高于参比池并由此导致信号出现下行波峰。
随着两个池的温度恢复到同一水平，信号也回到其起点。
将第二小份配体试样注入到样品池中，同样，微量热计补偿所检测到小幅热量变化。
化学反应的热力学分析方法新技术
化学反应的热力学分析方法新技术一、引言化学反应的热力学分析是研究化学反应过程中能量变化的重要手段。
随着科技的发展，热力学分析方法也在不断更新和创新。
本文将介绍近年来涌现的化学反应热力学分析的新技术，并探讨其应用和优势。
二、等温滴定量热法等温滴定量热法是一种利用量热仪测量化学反应热的方法。
其原理是在恒温条件下，将反应物逐滴加入反应釜中，通过测量反应釜中温度的变化来计算反应热。
相比传统的等温量热法，等温滴定量热法具有较高的灵敏度和准确性，可以更精确地测量反应热。
三、热流量仪测定法热流量仪测定法是一种利用热流量仪测量化学反应热的方法。
热流量仪通过测量流过试样的热量，间接计算出反应热。
与传统的量热法相比，热流量仪测定法具有较高的灵敏度和快速响应的特点，可以实时监测反应过程中的热量变化。
四、微流控技术微流控技术是一种利用微流控芯片进行热力学分析的方法。
通过在微流控芯片中控制反应物的流动速度和反应时间，可以实现对反应过程的精确控制。
微流控技术在化学反应热力学分析中具有快速、自动和高效的优势，可以大大提高实验的效率和准确性。
五、差示扫描量热法差示扫描量热法是一种基于差示扫描量热仪的热力学分析方法。
其原理是将待测样品与参比样品同时加热，通过测量两者之间的温差来计算反应热。
相比传统的量热法，差示扫描量热法具有更高的敏感性和准确性，可以测量相对较小的反应热。
六、计算机模拟方法计算机模拟方法是一种通过数值计算来分析化学反应热力学的方法。
通过建立反应物的分子动力学模型，可以模拟和预测反应过程中的能量变化。
计算机模拟方法具有高度灵活性和可扩展性，可以在实验之前进行预测和优化，为实验提供理论指导。
七、结论近年来，化学反应的热力学分析方法得到了快速发展和创新。
等温滴定量热法、热流量仪测定法、微流控技术、差示扫描量热法和计算机模拟方法等新技术的出现，不仅提高了热力学分析的精确性和灵敏度，还加快了实验的速度和提高了效率。
随着科学技术的不断进步，我们相信这些新技术将会在热力学研究领域发挥更大的作用，并推动化学反应的热力学分析取得更多的突破。
等温滴定量热法
另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸
收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定
在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持ΔT1=常数的热量就被系统检
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▪ 滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。
▪ 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(ΔG°)、标准状态下的焓变ΔH° 和熵变ΔS°,这部分内容称为滴定量热法。
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产
生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的
管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差，
▪ 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
ITC等温滴定量热法的操作说明资料
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它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、 结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔结合熵（△S）、摩尔恒 压热容（△Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差， 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸 收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
等温滴定量热法
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滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬 浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定 物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引 起的。 实验数据以热谱图形式表示，它提供了有关反应中物质的量（滴定终 点）和反应物质的特性（焓变）的数据。对图进行分析，可以得知反 应容器中发生的反应的类型和数目，以及溶液中存在的各物种的浓度 等信息。这部分内容称为热滴定，同时还可以确定反应的化学计量关 系，计算反应的热力学量,如平衡常数K(Δ G°)、标准状态下的焓变Δ H° 和熵变Δ S°,这部分内容称为滴定量热法。 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、 介电常数、溶剂强度、以及离子强度等)无关,因此可以用于气相、液相、 非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)， – 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、 注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。 – 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还 可以进行后续生化分析。 – 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
翟丽婷 2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
ITC等温滴定量热法的操作说明
ITC等温滴定量热法的操作说明ITC等温滴定量热法的操作说明1：概述ITC（Isothermal Titration Calorimetry）等温滴定量热法是一种常用于测量化学反应热效应和热力学参数的实验技术。
本文档将详细介绍ITC等温滴定量热法的操作步骤，以及常见问题的解决方案。
2：实验前准备2.1 仪器准备- 确保ITC仪器处于良好的工作状态，并进行必要的校准和检修。
- 检查仪器和相关设备的供电和冷却系统，确保正常运行。
- 准备实验所需的试剂和溶液，确保其纯度和浓度符合要求。
2.2 样品准备- 准备待测样品，确保样品的纯度和浓度符合实验要求。
- 储存样品时，注意避免暴露在空气中，以免影响实验结果。
- 如有需要，进行样品的预处理或稀释，以适应实验要求。
3：实验操作3.1 基本操作步骤- 打开ITC仪器，并进行必要的初始化设置。
- 准备试样，通常包括两种液体：溶剂和待测样品。
- 启动实验程序，并按照程序指导添加试样。
- 进行实验过程中，根据实验需要，调整实验参数，如温度、压力、浓度等。
- 当实验结束后，关闭仪器，保存实验数据。
3.2 添加试样的注意事项- 添加试样时，应尽量避免形成气泡，以免影响测量结果。
- 在添加试样前，应将样品和溶剂在相同工作温度下达到热平衡。
- 添加样品时，应使用精确的加样装置，控制加样速度和时间。
4：数据分析4.1 数据处理与解读- 对实验数据进行处理和分析，包括热流曲线的积分和差分操作等。
- 利用数据做曲线拟合，计算反应热和其他热力学参数。
- 根据数据分析结果，解释实验现象和反应机制。
4.2 出现问题的解决方案- 如实验数据异常或与理论不符，可检查实验操作是否正确，并逐步排除可能的问题。
- 如仪器出现故障或异常，应及时联系厂家进行维修或咨询专业人员的意见。
5：附件本文档附带以下附件：- ITX仪器操作手册6：法律名词及注释本文档中涉及的法律名词及其注释如下：- 1：涉及附件: 本文档所附带的相关文件或资料。
等温滴定量热法
等温滴定量热法等温滴定量热法是由19世纪30年代以来，研究热力学热量的一种常用实验方法。
它是基于利用热力学原理、热质平衡原理，在恒定温度的条件下，通过定量的加热来确定物质在反应过程中所改变的热量。
本文将从热力学原理和实验室实践出发，对等温滴定量热法进行全面和系统性地介绍。
一、热力学原理热力学原理是等温滴定量热法的基础。
热力学是物理学的一个重要分支，研究各种形式的热能之间的转换和改变，以及它们在温度和压力下的变化。
它是可以用来研究物质及其化学反应过程中，物质在实验室中的反应性及其根本特性的理论。
根据热力学的第一定律质量-能量守恒定律，在恒定温度下，物质在化学反应过程中总的能量变化等于反应的热量变化。
测量热量的变化，可以用来研究物质的组成和其化学反应的机制。
二、有关实验室实践等温滴定量热法在实验室实践中，需要准备一套热量测试仪器，包括热电阻、浴槽、滴定秤、恒温槽等，滴定秤用来称取两种物质，一种是反应物，另一种是被测物质，热电阻用来监测温度变化，浴槽用来盛装反应液，恒温槽用来调节温度，保证反应过程恒定温度进行。
在实验室实践中，以滴定的方式将物质添加到浴槽中，测量温度变化并记录其变化值；当物质反应完毕时，根据温度变化值可以求出反应热量值；通过热力学原理，可以推断反应机制以及分析物质的特性。
三、实验结果等温滴定量热法被广泛用于材料的加热和热分析研究，以此用来研究物质的组成及其反应的机制。
实验结果表明，等温滴定量热法可用于精确测量反应中所改变的热量；与其他测定热量的方法相比，具有灵敏及准确的特点，可以提供准确的热量测定结果。
四、总结等温滴定量热法是一种依据热力学原理和恒定温度，运用实验仪器测量反应过程中物质热量变化的实验方法。
等温滴定量热法是一种准确性很高的热量测定方法，给研究材料的反应机制和特性提供了可靠的依据。
等温滴定量热法(ITC)
等温滴定量热技术摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。
生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。
相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。
由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。
关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被广泛应用。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用的常用方法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用。
分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础。
生物分子识别过程需要结合反应的热力学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量比（n）、反应焓变（∆H）、熵变（∆S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作用。
ITC(等温量热滴定法)
GE Healthcare 公开技术质料
原始数据
ITC实验
积分结果
• 原始数据： 显示随着滴定进行，补偿加热丝补偿给样品池和参比池的热量速率差
• 积分结果： 将每次滴加所产生的热流差对时间进行积分，并以在对应时间点样品 池内反应物反应物的摩尔比为横轴 实线为最佳拟合曲线
ITC分析法能提供哪些信息？
ITC实验
ITC实验与反应的热力学信息
ITC曲线
ITC曲线积分分析结果
配体溶 液
某生物分 子溶液
逐次、等量滴加
I. 反应完成前：每次滴加 Æ一个ITC峰 随着反应进行，被测分
子逐步被配体饱和， ITC峰减小 II. 反应完成后：ITC峰稳 定，只有稀释热
GE Healthcare 公开技术质料
通过将原始ITC曲线积分， 可计算：
bound-NP cause LP gel-fluid
Proc. Natl. Ac18171–18175
因此，化合物X适于进一步研究
化合物X与TP的ITC结果
GE Healthcare 公开技术质料
ITC应用举例
软凝聚态物理：纳米颗粒（NP）与脂质体（LP）的作用研究
酸性NP + 流动相LP
碱性NP + 凝胶相LP
ITC应用举例
药物研发早期阶段对假正面结果的排除 化合物Y，是否与目标蛋白TP有特异性结合？
与TP（左）：
KD = 120 nM, 但∆H异常（高出103倍） n = 0.01 过低
因此研究Y与BSA作对比 与BSA（右）： KD，∆H，n 均同Y与TP 的接近
与TP
与牛血清白蛋白BSA
Æ Y与TP无特异性结合，不适于进一步研究
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等温滴定量热法(ITC)的简易操作流程：
①样品的准备，包括滴定物与被滴定物(如DNA滴定蛋白质)。
a.实验前的蛋白质样品需用缓冲溶液透析(注意透析袋的正确使
用)，透析时间一般为24小时，buffer体积为1L，且中途注意更换buffer，其目的是为了减少由于溶液组成不同而产生的滴
定误差；
b.样品的浓度要求，一般要求的浓度为微摩尔级，且滴定物(DNA)
的浓度是被滴定物(蛋白质)的十倍左右为宜，且实验前需要再
次确认所配样品的浓度是否符合要求；
c.在进行滴定实验前，用于空白对照的缓冲液，蛋白样品以及
DNA均需抽真空除气泡(15Mins左右为宜)。
②仪器的清洗。
a.在进行真空除气泡前，除气泡用容器均需用超纯水清洗三次左
右，且清洗完毕后擦干内壁，防止由于残留缓冲液的稀释而导致样品浓度的改变；
b.样品池(sample cell)的清洗，用超纯水清洗15次左右(每次2ml
左右)，清洗完毕后，一定要将残留的超纯水吸干净；
c.注射器(syringe)的清洗，用超纯水清洗3次以上(专用注射器清
洗,此时无需点击open,close和purge选项)，清洗完毕后将注射器的头部擦干，之后清洗装DNA的小试管，步骤同注射器的
清洗。
③设置空白对照试验（DNA滴定缓冲液），将缓冲液置于小试管中(为
了防止空气的进入，一般添加样品的量大于其实际所需的量)，打开控制界面，点击open之后，用手动注射器缓慢拉动活塞，此时注射器管中的液面上升，然后点击close, 注射器会自动将小试管中的缓冲液吸入注射器中，当缓冲液完全吸入注射器之后点击pump键，除去气泡；在清洗样品池的同时就设置所需的实验温度（套管温度，一般较反应温度稍低），并输入样品的实际浓度以及实验数据文件名和储存路径等一系列参数（如注射时间，注射次数，注射间隔时间）。
④设置滴定实验，步骤同空白试验，只需将样品池中用于空白对照
的缓冲液换成蛋白样品同时修改文件名(先准备样品池中的样品，后准备注射器中的样品)。
⑤试验结束后需依次使用缓冲液和超纯水清洗样品池、注射器、小
试管等所有使用容器。
⑥实验数据的处理和拟合模型的选择，根据所得数据选择适当的参
考模型后进行曲线拟合来得到我们预先设想的结果。
附：一、样品浓度的确定，以DNA滴定蛋白质为例
[P]=2.25mg/ml/9500g/mol=0.237mmol/L
①验证DNA的用量开始时测得的蛋白质浓度[P]Vp/[D]Vd=1/2.5=0.237mmol/L×1.4ml/[D]×0.28ml
[D]=2.96mmol/L
②假设每一次使用一整管DNA(使用前离心)，则有
1mol=384.1umol/L
[P]Vp/
DNA的
③蛋白质的稀释过程：
n(稀释前)=n(稀释后)
即[P1]V=[P2]V2
实际准备的蛋白样体积为
2.5ml
0.237mmol/L×V1=0.0307mmol/L×2.5ml
V1=0.324ml
则需要加入的buffer的体积为V’=2.5ml-0.324ml=2.176ml,
因此取0.324ml稀释前的蛋白样品后加入2.176ml的buffer即可
④待上述过程完毕过后，进行实验之前需再次分别测定蛋白质样品和DNA的浓度，后测得:[P]实际=0.0273mmol/L
[D]实际=492ng/ul/1718g/mol=0.2864mmol/L 则实际计算得：
Vd=0.0273mmol/L×1.4ml/0.2864×0.28
二、实际控制界面
磁石
样品放置位置
温度显示屏(一般设置为20℃) 1.在桌面点击VPViewer2000之后会弹出如下界面
2.在ITCcontrols中输入反应物的浓度
DNA实际浓度
更改文件名称
3.在thermostat/Calib中设置夹套温度(最好在清洗样品池的同时就设置，避免因降温缓慢而等待)。
设置夹套温度(18℃)
温度更改后，点击Set Jacket Temp后则更改成功。
4.在Setup/Maintenance中更改数据的保存位置更改文件的的保存
设置文件保存位置(如Nieyao)。