等温滴定量热法讲解
ITC等温滴定量热法的操作说明解读
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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INS
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典型的ITC数据
ITC(等温量热滴定法)
Q = f (t)
GE Healthcare 公开技术质料
ITC分析仪
ITC重要概念
与TP（左）：
KD = 120 nM, 但∆H异常（高出103倍） n = 0.01 过低
因此研究Y与BSA作对比 与BSA（右）： KD，∆H，n 均同Y与TP 的接近
与TP
与牛血清白蛋白BSA
Æ Y与TP无特异性结合，不适于进一步研究
GE Healthcare 公开技术质料
PL shrinkage NP-PL binding
∆H影响曲线与y-轴的截距
n影响积分曲线的拐点
K与结合位点总浓度n [Mt]影响积分曲线的整体形状
GE Healthcare 公开技术质料
ITC曲线分析：反应的结合推动力
吉布斯自由能（∆G）与结合常数（KD）相同、 但结合机理不同的两个结合反应 等温：∆G = ∆H -T ∆S
∆G < 0主要由-T ∆S贡献，该 反应为熵增推动的结合反应
GE Healthcare 公开技术质料
原始数据
ITC实验
积分结果
• 原始数据： 显示随着滴定进行，补偿加热丝补偿给样品池和参比池的热量速率差
• 积分结果： 将每次滴加所产生的热流差对时间进行积分，并以在对应时间点样品 池内反应物反应物的摩尔比为横轴 实线为最佳拟合曲线
ITC分析法能提供哪些信息？
ITC曲线积分结果 GE Healthcare 公开技术质料
反应导致熵减小（ -T ∆S > 0）， 但∆H减小很多，使∆G < 0反应
ITC等温滴定量热法的操作说明解读
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
Assessment of biological activity.
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
1等温滴定量热法isothermaltitrationcalorimetryitc201110132isothermaltitrationcalorimetryitc等温滴定量热技术itc是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术即用一种反应物滴定另一种反应物随着加入滴定剂的数量的变化测量反应体系温度的变化它通过高灵敏度高自动化的微量量热仪连续准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线原位在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法
ITC等温滴定量热法的操作说明资料
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INS
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一
个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动 力学信息，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数（Ka）、 结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔结合熵（△S）、摩尔恒 压热容（△Cp），和动力学参数(如酶促反应的Km和kcat）
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ITC系统是通过细胞反馈网络 CFB来分别测量或者补偿样品和对照由于反应所产 生或者吸收的热量。两个硬币状的东西放置在绝热的圆筒中，通过那个细细的 管子与外界联通。有两个热量检测装置。一个用来检测两个样品之间的热量差， 另一个检测对照和环境的热量差。当样品中发生化学反应的时候，释放或者吸 收热量，因此样品和对照的温度差会通过对样品进行增加或者减少热量而稳定 在一个水平，就是baseline。因此那些用来维持Δ T1=常数的热量就被系统检 7 Page 7 测画作曲线。
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules Lead optimization. Enzyme kinetics.
Assessment of the effect of molecular structure changes on binding mechanisms.
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典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
ITC等温滴定量热法的操作说明
ITC等温滴定量热法的操作说明ITC等温滴定量热法的操作说明1：概述ITC（Isothermal Titration Calorimetry）等温滴定量热法是一种常用于测量化学反应热效应和热力学参数的实验技术。
本文档将详细介绍ITC等温滴定量热法的操作步骤，以及常见问题的解决方案。
2：实验前准备2.1 仪器准备- 确保ITC仪器处于良好的工作状态，并进行必要的校准和检修。
- 检查仪器和相关设备的供电和冷却系统，确保正常运行。
- 准备实验所需的试剂和溶液，确保其纯度和浓度符合要求。
2.2 样品准备- 准备待测样品，确保样品的纯度和浓度符合实验要求。
- 储存样品时，注意避免暴露在空气中，以免影响实验结果。
- 如有需要，进行样品的预处理或稀释，以适应实验要求。
3：实验操作3.1 基本操作步骤- 打开ITC仪器，并进行必要的初始化设置。
- 准备试样，通常包括两种液体：溶剂和待测样品。
- 启动实验程序，并按照程序指导添加试样。
- 进行实验过程中，根据实验需要，调整实验参数，如温度、压力、浓度等。
- 当实验结束后，关闭仪器，保存实验数据。
3.2 添加试样的注意事项- 添加试样时，应尽量避免形成气泡，以免影响测量结果。
- 在添加试样前，应将样品和溶剂在相同工作温度下达到热平衡。
- 添加样品时，应使用精确的加样装置，控制加样速度和时间。
4：数据分析4.1 数据处理与解读- 对实验数据进行处理和分析，包括热流曲线的积分和差分操作等。
- 利用数据做曲线拟合，计算反应热和其他热力学参数。
- 根据数据分析结果，解释实验现象和反应机制。
4.2 出现问题的解决方案- 如实验数据异常或与理论不符，可检查实验操作是否正确，并逐步排除可能的问题。
- 如仪器出现故障或异常，应及时联系厂家进行维修或咨询专业人员的意见。
5：附件本文档附带以下附件：- ITX仪器操作手册6：法律名词及注释本文档中涉及的法律名词及其注释如下：- 1：涉及附件: 本文档所附带的相关文件或资料。
ITC(等温滴定量热)培训第一课原理介绍
+
- 焓变和熵变均不利，反应不会自发进行
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ITC 在生命科学和药物研发中的应用
• 分析生物分子的相互作用
– 证实结合以及活性 – 确定化学计量比和热力学参数
• 研究任意两个生物分子的相互作用
– 蛋白，核酸，脂质，药物，抑制剂等 – 结构生物学以及结构-活性间的关系
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热力学 1(4)
kcal/mole of injectant
0
Ligand A into
-2
compound X
-4
-6
-8
-10
-12
-14
0
Ligand B into compound X
1
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Molar ratio
相同的亲和力和化学计量比，但是 不同的焓变 （热量）
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
等温滴定量热法 (ITC) 的介绍
目标
• 等温滴定量热(ITC)的原理介绍 • 介绍焓，熵和自由能的定义，理解生物分子相互作用和分子识
别 • 常用应用的介绍
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为何使用微量热技术?
无标记
宽广的动态范围
信息丰富
使用方便
• 直接测量热量变 化 (ITC)
这告诉我们不同的结合机制
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热力学 2(4)
DG = RT ln KD DG = DH –TDS
ΔH,焓 （enthalpy），反映氢键和范德华键 的变化
-TΔS, 熵（entropy），反映疏水作用的变化 和/或构象变化
等温滴定量热法
等温滴定量热法等温滴定量热法是由19世纪30年代以来，研究热力学热量的一种常用实验方法。
它是基于利用热力学原理、热质平衡原理，在恒定温度的条件下，通过定量的加热来确定物质在反应过程中所改变的热量。
本文将从热力学原理和实验室实践出发，对等温滴定量热法进行全面和系统性地介绍。
一、热力学原理热力学原理是等温滴定量热法的基础。
热力学是物理学的一个重要分支，研究各种形式的热能之间的转换和改变，以及它们在温度和压力下的变化。
它是可以用来研究物质及其化学反应过程中，物质在实验室中的反应性及其根本特性的理论。
根据热力学的第一定律质量-能量守恒定律，在恒定温度下，物质在化学反应过程中总的能量变化等于反应的热量变化。
测量热量的变化，可以用来研究物质的组成和其化学反应的机制。
二、有关实验室实践等温滴定量热法在实验室实践中，需要准备一套热量测试仪器，包括热电阻、浴槽、滴定秤、恒温槽等，滴定秤用来称取两种物质，一种是反应物，另一种是被测物质，热电阻用来监测温度变化，浴槽用来盛装反应液，恒温槽用来调节温度，保证反应过程恒定温度进行。
在实验室实践中，以滴定的方式将物质添加到浴槽中，测量温度变化并记录其变化值；当物质反应完毕时，根据温度变化值可以求出反应热量值；通过热力学原理，可以推断反应机制以及分析物质的特性。
三、实验结果等温滴定量热法被广泛用于材料的加热和热分析研究，以此用来研究物质的组成及其反应的机制。
实验结果表明，等温滴定量热法可用于精确测量反应中所改变的热量；与其他测定热量的方法相比，具有灵敏及准确的特点，可以提供准确的热量测定结果。
四、总结等温滴定量热法是一种依据热力学原理和恒定温度，运用实验仪器测量反应过程中物质热量变化的实验方法。
等温滴定量热法是一种准确性很高的热量测定方法，给研究材料的反应机制和特性提供了可靠的依据。
等温滴定量热法
等温滴定量热法
等温滴定量热法是一种非常重要的实验方法，它可以用来测量溶液中温度与单位时间内所吸收的热量之间的关系。
自发明以来，它已经成为热力学实验中的一种重要方法，并在诸如热力学、物理化学等学科中得到广泛应用。
等温滴定量热法是一种相对简单的实验方法，它需要根据温度上升和下降的情况，来衡量溶液中的热量吸收情况。
它的实验原理是：在一段时间内，将溶液放置在可控温度的实验箱中，当温度提高时，溶质被溶液吸收的热量会比温度降低时要大，从而可以测量热力学的参数。
等温滴定量热法是一种比较常用的热力学实验方法，它不仅能够测量某一特定溶液的吸热或放热情况，而且可以用于测量热力学参数，如比热容、汽化温度、沸点等。
等温滴定量热法是一种比较有效的实验方法，它的测量结果可以反映出物理化学的实际状况。
它的实验过程比较简单，可以在室温下完成，而且测量的精确度很高，因此在化学、物理、热力学等学科中得到了广泛应用。
另外，等温滴定量热法在现代化工程中也得到了广泛应用。
比如，它可以用来测量热负荷和用于进行蒸汽锅炉安全运行时的安全参数，也可以用于溶剂萃取、蒸发空气冷却、热交换量的测量等，以及热分析中的热容量、热导率和热稳定性的测定等。
因此，等温滴定量热法是实验测量技术中的一种重要方法，它可以用来测量某一特定溶液的吸热或放热情况，以及热力学参数，如比
热容、汽化温度等。
它的简单性、精确度和准确性使其在化学、物理、热力学等学科中非常具有重要的意义，也使得它在现代化工程中得到了广泛的应用。
等温滴定量热技术
等温滴定量热技术等温滴定量热技术是一种能够研究溶解热、反应热、吸附热等反应热效应的实验技术，它可以定量测定物质的热化学性质，包括热力学参数、化学反应动力学参数等，是化学和材料学等领域重要的实验手段。
等温滴定量热技术的基本原理是利用微量热法，即将被测样品在等温条件下加入到反应池中，在一定时间间隔内持续注入滴定液，从而发生显著反应，这种反应释放或吸收能量，导致反应体系温度发生变化，采用高精度量热仪测量反应热效应，从而获得样品的热化学性质。
等温滴定量热技术主要分为平衡热量法和动态热量法两种方法。
平衡热量法是通过将反应池维持在等温状态，在一段时间内等待反应体系达到平衡状态，然后进行滴定，测量反应热量。
这种方法可以减小反应过程中外部因素的影响，同时也可以消除热失控导致的误差。
而动态热量法则是在滴定过程中，实时测量反应体系的温度变化，以获得较高的实验精度。
等温滴定量热技术具有以下优点：首先，利用等温条件进行反应，保证了反应的可重复性。
其次，在不需求外热量或热量损失的情况下，可以实现精确测量反应热，避免了因加热或冷却而导致的额外的误差。
最后，由于等温滴定量热技术对样品量非常少，因此可以进行昂贵或危险的试剂或实验条件下的实验。
应用等温滴定量热技术可以获得广泛的信息，例如热容、热力学参数、化学反应速率、表面化学结构和气体吸附等。
在实践中，等温滴定量热技术用于研究各种类型的化学反应，例如溶解、复分解、离子交换等。
它还可以应用于催化剂、生物大分子、纳米材料等重要领域的研究。
总之，等温滴定量热技术是一种非常强大的实验手段，它可以准确地测定物质的热化学性质，从而为学术研究和工业生产提供关键的信息。
随着技术的不断完善，这种实验技术将会发挥越来越重要的作用。
等温滴定量热法讲解
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ITC
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体
注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的
高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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图形
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上图：
横坐标：时间
纵坐标：热功率
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，
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灵敏度的提高
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history
?Since the beginning of 1990s, the number of published papers related to ‘‘isothermal titration calorimetry '' has symptomatically increased due to rapid diffusion of new commercial calorimeters in the scientific community.
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history
?built in the secondhalf of the 1960s to study chemical reactions.
?During the1970s, the sensitivity of instruments was in the range of mJ, and other first applications were developed such as the study of (metal + ligand) complexes [8] and the adsorption of aromatic compounds by molecular sieves .
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– 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
– ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术能提 供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固定。ITC 的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常 数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔 结合熵（△S）、摩尔恒压热容（△Cp），和动力学参数(如 酶促反应的Km和kcat）,用来表征生物分子间的相互作用。
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独特特点：
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
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built in the secondhalf of the 1960s to study chemical reactions.
During the1970s, the sensitivity of instruments was in the range of mJ, and other first applications were developed such as the study of (metal + ligand) complexes [8] and the adsorption of aromatic compounds by molecular sieves .
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The inflection points, which reflect the stoichiometry of the formed complexes, are close to one in case of mPEG5kad indicating that each adamantane group is associated with one β-CD molecule. This is in agreement with other reports showing a 1:1 binding stoichiometry between adamantane derivatives and β-CD . In case of mPEG5kchol, the stoichiometry was close to three, which had also been reported previously .The higher order of complexation may be due to self-association of cholesterol and/or partial inclusion of the cholesterol side chain into the β-CD cavity
纵坐标：热功率
峰底与峰尖之间的峰面积为 每次注射时释放或吸收的总 热量。 下图：
横坐标：滴定物与样品溶液 的摩尔比
纵坐标：滴定产生的总热量
反应过程的结合等温曲线
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ITC可以直接测量焓变△H， 结合常数Ka，而不对反应体 系产生影响，也不引入修饰 基团，因此测得的结果更加 可信
典型的ITC数据
配体溶液20次注射到ITC池的 蛋白溶液中。每个注射峰（上 图）下方的区域与注射所释放 的总热量相等。当这种综合的 热量相对添加到池中的配体摩 尔比作图时，就获得了相互作 用的完整结合等温线（下图）。 用单位点模型来验证数据。化 学计量、结合常数及焓的数值 都显示在框内。
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等温曲线
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体
注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的
高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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图形
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上图：
横坐标：时间
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灵敏度的提高
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Since the beginning of 1990s, the number of published papers related to ‘‘isothermal titration calorimetry ’’ has symptomatically increased due to rapid diffusion of new commercial calorimeters in the scientific community.
– 实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，
– 操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、 注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin软件分析 ITC得到的数据)。
– 测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还 可以进行后续生化分析。
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流程
1、微克级
3、配体浓度大于大分子浓度
1、确定合适的反应物浓度虑反应物性质 1、2、设尽置量对避照免组稀释热 2、3、平抽行气试处验理 3、Origin软件
4、校正后的数据非线性回归得到热力学参 数
5、分析模型
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模型分析
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history
During the decade of 1990, isothermal titration calorimetry has evolved from a specialist method to a widely used technique .
During the 2000’s, isothermal titration calorimetry was widely employed in the design and discovery of drugs and in addition to this, in this last decade an isothermal titration calorimeter with open cell was employed for the study of liquid mixtures .
正确理解反应过程首先要理解模型给出的各种参数的正确意义。 根据模型给出的各种热力学参数确定反应的相关性质。
结合位点数不同，平衡常数的物料平衡的表达公式是不同的
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characteristics
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监 测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤 地同时提供热力学和动力学信息，它已经成为鉴定生物分 子间相互作用的首选方法。
– 测温滴定法以热效应为基础,与溶液的许多性质(如粘度、光学透明度、介电 常数、溶剂强度、光谱性质和电学性质以及离子强度等)无关,因此可以用于 气相、液相、非水溶液、有色溶液、胶体溶液和粘稠浆状等体系。
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药剂学方面的应用
we investigated the interactions between β-CD and the two guest molecules by means of isothermal titration calorimetry(ITC)
等温滴定微量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
林杰
ITC
Isothermal titration calorimetry (ITC) is used to measure the heat adsorbed or released during changes in the composition of a system undergoing a titration process. 等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任 何化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着 加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
We found that mPEG5k-chol exhibited a higher binding affinity than mPEG5k-ad
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Applications include:
Characterization of molecular interactions of small molecules.表征小分子的相互作用
Lead optimization.先导物优化 Enzyme kinetics.酶动力学 Assessment of the effect of molecular structure changes
on binding mechanisms.分子结构变化对绑定机制评估的影响 Assessment of biological activity.评估生物活性
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The sample cell was loaded with aqueous solutions of mPEG5k-ad (0.5 mM) and mPEG5k-chol (0.1 mM), respectively. Titrations were carried out by stepwise injection of β-CD solutions (5 mM) into the sample cell (5 ml per injection, 60 s interval). All measurements were done at 25 ± 0.1 C and 37± 0.1 C.