活力测定细胞复苏
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞计数及活力测定
2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
【作业与思考题】
1．根据实验结果，画出生长曲线。 2．试述用MTT法测定细胞生长曲线的过程及注意事项。 3．细胞接种的密度与细胞生长曲线的测量结果之间有 什么关系？ 4．为什么细胞计数时，细胞悬液逸出槽外时要重做？
Experiment 18
细胞计数及活力测定
【实验目的】
1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长 曲线，以了解培养细胞的生长发育特性 2．掌握测定细胞活力的方法
【实验目的】
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长 良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总 细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细 胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤 作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而 可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂 发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
【注意事项】
1．细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖 片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。 2．MTT法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱酶的活性，反映的是细 胞代谢和增殖活力，而非绝对的细胞数量。
细胞活力测试实验报告
通过本实验，了解细胞活力测试的基本原理和方法，掌握MTT法（MTT比色法）测定细胞活力的操作步骤，并分析细胞在不同条件下的活力变化。
实验时间：2023年4月10日实验地点：细胞生物学实验室实验材料：1. 细胞系：人肺上皮细胞（A549）2. MTT试剂：3-（4，5-二甲基噻唑-2-yl）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）3. DMSO（二甲基亚砜）4. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素5. 细胞培养瓶、细胞培养板、移液器、吸管、试管、离心机、酶标仪等实验方法：1. 细胞培养：将人肺上皮细胞（A549）接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 细胞传代：待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代至新的培养瓶中。
3. 实验分组：将传代后的细胞分为实验组和对照组，实验组细胞在特定条件下培养，对照组细胞在正常培养条件下培养。
4. 细胞接种：将实验组和对照组细胞分别接种于96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为5×104个。
5. 细胞培养：将细胞培养板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。
6. MTT实验：向每孔细胞中加入20μl MTT试剂，继续培养4小时。
7. 终止培养：弃去孔内液体，向每孔加入150μl DMSO，振荡混匀。
8. 比色：用酶标仪在490nm波长下测定各孔的吸光度（OD）值。
9. 数据分析：计算实验组和对照组的细胞活力，并比较两组间的差异。
1. 实验组细胞活力较对照组显著降低，说明特定条件下细胞活力受到抑制。
2. 不同浓度药物处理的实验组细胞活力呈剂量依赖性下降，说明药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验结论：通过MTT法测定细胞活力，可以有效地评估细胞在不同条件下的生长状态。
本实验结果表明，特定条件下细胞活力受到抑制，且药物浓度越高，细胞活力抑制越明显。
实验讨论：1. MTT法是一种简单、快速、灵敏的细胞活力测定方法，适用于多种细胞系和药物筛选实验。
细胞活性测定方法介绍和使用探讨
1.细胞活性测定方法介绍和使用探讨细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍：1、MTT法MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
2、XTT法XTT：化学名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞2.细胞复苏方法1．从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。
2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。
细胞复苏及存活率测定
细胞工程实验报告实验课程：细胞工程实验内容：细胞复苏及存活率测定一实验目的1、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
2、掌握染料排除法鉴定细胞死活的原理。
3、学习用血球计数板进行细胞计数测定细胞的存活率的方法。
二实验原理在显微镜下从形态上很难区分死、活细胞。
但是，死细胞可被某些染料如台盼蓝、伊红和苯胺黑等染上相应的颜色，而活细胞则不会被染色。
因此，可根据细胞是否被染料着色来区分细胞的死活。
血球计数板：血球计数板是一块上面刻有“H”型凹槽的特制的厚玻璃板。
H 型凹槽在玻璃板中间围成上下两个平台，而且中间这两个平台比两侧平台要低0.1 mm。
计数室：每一大方格面积为1 mm×1 mm，由于有0.1mm的凹度空隙，因此盖上盖玻片后容积为0.1 mm3，（0.1ul）三、主要仪器试剂设备：血球计数板、滴管、试管、倒置显微镜、超净工作台、改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、二氧化碳培养箱、恒温水浴锅、离心管等。
试剂： MEM+10%小牛血清液、胰蛋白酶、PE液、0.4%台盼蓝等。
四实验步骤（复苏）●从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入36～37℃恒温水浴中，不时轻轻摇动，使其在40～60秒内尽快解冻。
●用75%酒精擦拭消毒细胞冻存管，在超净工作台上打开盖，将细胞悬液倒入培养瓶中，快速加3ml MEM血清培养液，摇匀后静置，→30min后在显微镜下检查贴壁情况→大部分细胞贴壁后，从侧面轻轻吸出培养液2ml MEM血清培养液置培养箱中培养→从侧面加入新培养液，培养，一周后观察。
（细胞死活鉴定及计数）➢用95%酒精冲洗血球计数板及盖玻片，用电吹风吹干。
把盖玻片覆在计数板上面，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液。
➢取吸管一支，伸入培养瓶中，吸取细胞悬液向一小试管中滴入6滴，再滴入0.4%台盼蓝3滴，混匀，染色2-3分钟。
➢如果细胞悬液含细胞过多，可先用MEM培养液稀释，稀释倍数视情况而定，然后再进行染色。
细胞活力检测方法
细胞活力检测方法细胞活力是指细胞内外环境稳定，细胞结构完整，代谢活跃，功能正常的状态。
细胞活力的高低直接影响着生物体的生长、发育、免疫功能等多个方面。
因此，准确、快速地检测细胞活力对于生物学研究和临床诊断具有重要意义。
下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。
一、MTT法。
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
其原理是将MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）加入培养基中，MTT会被细胞内的还原酶还原为可溶性的紫色产物，然后用溶剂将产物溶解，最后用酶标仪测定其吸光值。
吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。
二、CCK-8法。
CCK-8法是一种新型的细胞活力检测方法，其原理是将CCK-8（Cell Counting Kit-8）溶液加入培养基中，CCK-8会被细胞内的还原酶还原为橙黄色的产物。
然后用酶标仪测定其吸光值，吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。
相比MTT法，CCK-8法更为灵敏和稳定。
三、荧光染料法。
荧光染料法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理是利用荧光染料（如FDA、PI等）染色活细胞和死细胞，然后观察染色情况来判断细胞的活力。
活细胞呈绿色荧光，而死细胞呈红色荧光。
通过计数活细胞和死细胞的比例，可以间接反映细胞的活力情况。
四、细胞代谢物测定法。
细胞代谢物测定法是一种直接反映细胞活力的方法。
通过测定细胞产生的代谢产物（如乳酸、ATP等）的含量，可以客观地评价细胞的活力情况。
这种方法不仅可以用于细胞培养液的检测，也可以用于组织样本的检测。
综上所述，细胞活力的检测方法有多种多样，每种方法都有其独特的优势和适用范围。
在实际应用中，我们可以根据具体情况选择合适的方法来检测细胞活力，以便更好地开展生物学研究和临床诊断工作。
希望本文介绍的内容对您有所帮助。
细胞冷冻复苏实验报告
实验名称：细胞冷冻复苏实验实验日期：2023年11月10日实验人员：张三、李四、王五一、实验目的1. 熟悉细胞冷冻和复苏的操作步骤。
2. 掌握细胞冻存过程中的保护剂选择和浓度控制。
3. 了解不同冷冻复苏方法对细胞活力的影响。
二、实验原理细胞冷冻复苏技术是将细胞置于超低温环境中，使细胞代谢活动减缓或停止，从而实现长期保存的技术。
复苏过程是将冻存的细胞恢复到正常生理状态，使其重新生长和分裂。
三、实验材料1. 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）2. 培养基：DMEM培养基3. 保护剂：二甲基亚砜（DMSO）4. 冻存管：无菌冻存管5. 液氮：液氮罐6. 移液器：移液器、枪头7. 培养箱：细胞培养箱8. 显微镜：倒置显微镜9. 台盼蓝染色液四、实验方法1. 细胞培养：将MEF细胞接种于培养皿中，置于培养箱中培养至对数生长期。
2. 细胞冻存：（1）将细胞用DMEM培养基洗涤2次，收集细胞。
（2）用移液器将细胞重悬于含有10% DMSO的DMEM培养基中，使细胞浓度为1×10^6个/mL。
（3）将细胞悬液转移至无菌冻存管中，每管1.5 mL。
（4）将冻存管置于-80℃冰箱中过夜。
（5）将冻存管转移至液氮罐中，长期保存。
3. 细胞复苏：（1）将冻存管从液氮罐中取出，置于37℃水浴中快速融化。
（2）将细胞悬液转移至培养皿中，加入适量DMEM培养基，置于培养箱中培养。
4. 细胞计数：用血球计数板对复苏后的细胞进行计数。
5. 细胞活力检测：用台盼蓝染色法检测细胞活力。
五、实验结果1. 细胞冻存：冻存后细胞形态正常，无死亡。
2. 细胞复苏：复苏后细胞形态正常，生长良好。
3. 细胞计数：复苏后细胞数量为1.2×10^6个。
4. 细胞活力检测：台盼蓝染色结果显示，复苏后细胞活力为95%。
六、实验讨论1. 细胞冻存过程中，选择合适的保护剂和浓度对细胞活力至关重要。
本实验中，使用10% DMSO作为保护剂，可有效保护细胞免受冷冻损伤。
细胞复苏流程
细胞复苏流程细胞复苏是指将处于休眠状态的细胞重新恢复活力，使其恢复正常生理功能的过程。
细胞休眠可能是由于低温、缺氧、营养不足、药物作用等原因导致的。
细胞复苏的过程包括一系列复杂的生物化学反应和细胞内的分子修复机制。
首先，在细胞复苏的过程中，环境条件起着重要的作用。
对于低温导致的细胞休眠，温度的升高是细胞复苏的首要条件。
在逐渐升高的温度下，细胞开始逐渐恢复活力，并逐渐恢复正常的细胞膜功能。
此外，提供营养物质和氧气也是细胞复苏不可或缺的条件。
通过提供必要的营养和氧气，细胞可以开始分解和代谢有害物质，并逐渐恢复正常的细胞代谢功能。
其次，细胞复苏的过程中还涉及到一系列细胞内分子修复机制。
在细胞受损的过程中，细胞内的DNA和蛋白质可能会受到损伤，导致细胞功能的丧失。
在细胞复苏的过程中，细胞会启动一系列分子修复机制，修复受损的DNA和蛋白质。
具体来说，细胞会产生一些特定的酶，如DNA修复酶和蛋白质修复酶，来修复受损的分子。
这些酶可以修复DNA链断裂、修复DNA碱基上的氧化损伤、修复蛋白质的氨基酸缺失等。
通过这些修复机制，细胞可以逐渐恢复正常的的DNA结构和蛋白质功能。
此外，细胞复苏的过程还涉及到细胞内部的能量代谢。
在细胞复苏的过程中，细胞会逐渐恢复正常的能量代谢功能。
具体来说，细胞会逐渐恢复正常的ATP合成和氧化磷酸化代谢。
通过这些代谢过程，细胞可以产生足够的能量来维持正常的生理功能。
细胞复苏的过程是一个复杂而多步骤的过程，涉及到多个细胞内分子修复机制和能量代谢过程。
在这个过程中，环境条件的改变和提供必要的营养物质和氧气都是至关重要的。
尽管我们已经了解到了细胞复苏的一些基本原理，但是细胞复苏的具体机制仍然有待进一步深入研究。
深入了解细胞复苏的过程将会有助于我们更好地理解细胞的功能和疾病的发生机制，从而为疾病的治疗和预防提供重要的科学依据。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受 损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油， 它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿 透细胞。
影响冷冻效果的因素
①从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃温水中并 不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
②打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
③1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
④沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分 钟，弃上清液。
⑤加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃ 培养，第二天观察生长情况。
⑤细胞浓度计算： 四大格的细胞总数除以4，得 出平均每大格的细胞数，每大格的容积为 0.1mm3，因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞 浓度可用下式计算：
细胞浓度（细胞数／ml）＝（四大格的细胞数／ 4）ⅹ10000ⅹ稀释倍数
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团， 应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明 分散不好，需重新制备细胞悬液
1、冷冻速率 细胞冷至-10--15℃之间时，细胞外溶液先
出现结冰，而细胞细胞内仍保持未结冰状 态、细胞内未结冰的水分子会向细胞外流 动。 冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞内 溶质浓度增高、细胞不发生结冰。 冷冻速度快，细胞内水分没足够时间外渗， 会发生结冰。
2、冷冻保存温度 液氮（-196 ℃）是最佳保存温度。
活细胞中的脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝 紫色产物（甲臜，Formazan)，并沉淀在细胞中， 其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。而 死细胞没有这种功能。
酸化异丙醇能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比，最 后用酶标仪测定OD值。
①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 ②沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 ③37℃下保温2小时。 ④加入4-5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 ⑤1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度
一、实验目的： 1．掌握测定细胞活力的方法。
二、实验原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能 生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每 毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细 胞计数相同。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞， 总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由 组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离 的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也 要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
作业： 1．细胞冻存与复苏的基本原则是什么？ 2．冻存液的作用是什么？
2．细胞活力测定
台盼蓝活力测定机理： 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，
使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完 整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成 蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细
胞已经死亡。
①将一定浓度的细胞悬液与0.4%台盼兰以9:1混 合。
②染色2一3分钟。
⑥贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管 外拴一金属重物和一细绳。
⑦按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰 箱冷冻室（-20 ℃ ）（1小时）→气态氮（过夜） →液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期 检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立 升பைடு நூலகம்液氮能用1～1.5月。
2．复苏
四、操作步骤 1．冻存
①胰酶消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 ②1000rpm离心5分钟，弃上清液。 ③沉淀加含保护液的培养基（培养基： DMSO=1:1），计数，调整至5×106/ml左右。 ④将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
⑤将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封 口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色， 从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些 酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相 对数和相对活力。
三、实验材料
仪器、材料与试剂 1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、
吸管、分光光度计。 2．材料：细胞悬液。 3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮
③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细 胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外， 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑 到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
3．MTT法测细胞相对数和相对活力
计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，
不能测定细胞绝对数。
细胞的冻存和复苏
一、实验目的
掌握细胞冻存的方法。
二、实验原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外 环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机 械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、蛋白 变性等，引起细胞死亡。
3、复温速度 越快越好，37 ℃水浴中，1-2min完成复温。
4、冷冻保护剂 保护细胞免受冷冻损伤的物质，常用甲亚 砜（DMSO）和甘油。
三、实验材料
1．仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮罐，离心 机，水浴锅，微量加样器等
2．材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿 瓶）、离心管、吸管等。
3．试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培 养基（即冻存液）等。
唑盐（MTT）、酸化异丙醇
四、操作步骤
1．细胞计数 ①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖
片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，
使悬液充满盖片和计数板之间。 ③静置3分钟。
④计数 ：在低倍镜下计算计数板的四角大方格 （每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。数 出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细 胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。