细胞活力测定数据统计
细胞活力检测实验报告
一、实验目的细胞活力是细胞生物学研究中非常重要的指标，能够反映细胞在特定条件下的生长、代谢和功能状态。
本实验旨在通过多种方法检测细胞活力，了解细胞在不同条件下的生长情况，为后续实验研究提供依据。
二、实验材料1. 细胞：人胚胎肾细胞（HEK293）2. 试剂：台盼蓝染色液、CCK-8试剂盒、Resazurin细胞活力检测试剂盒、ATP含量测定试剂盒、细胞培养液、培养基、PBS缓冲液等3. 仪器：显微镜、酶标仪、细胞计数板、细胞培养箱、超净工作台等三、实验方法1. 台盼蓝染色法（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）用PBS缓冲液洗涤细胞，加入适量的台盼蓝染色液，室温孵育5分钟。
（3）用PBS缓冲液洗涤细胞，观察细胞染色情况。
2. CCK-8试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl CCK-8试剂，避光孵育2小时。
（4）用酶标仪检测450nm波长下的吸光度（OD值）。
3. Resazurin细胞活力检测试剂盒检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl新鲜培养基。
（3）加入10μl Resazurin试剂，37℃孵育4小时。
（4）用酶标仪检测570nm和600nm波长下的吸光度（OD值）。
4. ATP含量测定法检测细胞活力（1）将HEK293细胞以1×10^5个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后进行实验。
（2）弃去原培养液，加入100μl ATP含量测定试剂盒，室温孵育10分钟。
（3）用酶标仪检测560nm波长下的吸光度（OD值）。
四、实验结果与分析1. 台盼蓝染色法通过显微镜观察，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色。
细胞计数及活力测定
2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
【作业与思考题】
1．根据实验结果，画出生长曲线。 2．试述用MTT法测定细胞生长曲线的过程及注意事项。 3．细胞接种的密度与细胞生长曲线的测量结果之间有 什么关系？ 4．为什么细胞计数时，细胞悬液逸出槽外时要重做？
Experiment 18
细胞计数及活力测定
【实验目的】
1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长 曲线，以了解培养细胞的生长发育特性 2．掌握测定细胞活力的方法
【实验目的】
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长 良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。 细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总 细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细 胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤 作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而 可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂 发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
【注意事项】
1．细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖 片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。 2．MTT法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱酶的活性，反映的是细 胞代谢和增殖活力，而非绝对的细胞数量。
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验
细胞培养中死活细胞测定及细胞活力测定实验日期：2013-03-12 来源：未知标签：细胞活力测定摘要: 细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
细胞培养过程中需要测定细胞的存活率以了解细胞的生长状态，鉴定细胞存活常用的方法有染色法和仪器分析法。
染色法可直接通过细胞形态，区别细胞死亡，它是一种简单的细胞存活鉴定方法。
这里总结下死活细胞测定及细胞活力测定实验原理、实验步骤及注意事项。
【实验原理】(一)染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在：(1)死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
(2)死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。
常见的细胞染料有：中性红(细胞器的专有染料)、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸酯(FDA)等。
①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。
利用细胞膜的通透性差异，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。
中性红无毒，常做活体染色的染料。
②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。
通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。
③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
mtt法测定细胞活力的原理
mtt法测定细胞活力的原理MTT法是一种常用的细胞活力测定方法，它通过测量细胞中还原MTT试剂的能力来评估细胞的生存和代谢活性。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种黄色水溶性化合物，可被细胞内酶系统还原生成紫色的可溶性甲硫唑酮（formazan）晶体，这种生成的晶体可以用光谱法测定其吸光度，从而间接反映细胞的活力。
MTT法的原理基于细胞代谢活性和酶系统的相互作用。
正常活跃的细胞具有强大的代谢能力，其中含有还原酶（主要为线粒体中的NADH/NADPH依赖的酶）。
当细胞处于正常状态时，这些酶可将MTT试剂还原为可溶性甲硫唑酮（formazan）。
甲硫唑酮的形成需要细胞内的还原酶作用以及细胞内的线粒体呼吸产生的还原型辅酶NADH/NADPH。
因此，MTT法测定的是细胞内还原酶的酶活性以及细胞的氧化还原状态。
MTT法的具体步骤如下：1.培养细胞：将需要测定的细胞以适宜的细胞密度接种于培养皿中，使其在培养基中生长至合适的状态。
细胞的密度和培养时间可以根据实验需要进行调整。
2.甲硫唑酮的制备：将MTT试剂溶于PBS（磷酸盐缓冲液）中，摇晃使其完全溶解，准备工作台上的MTT溶液。
3.细胞处理：根据实验设计，给细胞添加待测物，如药物、激素等，使其暴露于不同的处理条件下。
4.添加MTT试剂：将上述处理后的细胞分别加入到含MTT试剂的培养基中，使细胞与MTT试剂接触。
5.孵育细胞：在适宜的温度和气体环境下，培养细胞和MTT试剂的混合物一段时间（通常为2～4小时），使细胞内酶系统完全还原MTT试剂为甲硫唑酮。
6.溶解甲硫唑酮：去除培养基，向培养皿中加入溶剂（一般为DMSO），使甲硫唑酮溶解。
DMSO具有良好的溶解MTT产物的能力。
7.吸光度测定：将溶剂溶液转移至96孔板或玻璃瓶中，使用酶标仪或分光光度计测定甲硫唑酮的吸光度。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg./ml，抽虑除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
细胞计数及细胞活力检测
细胞计数
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
1.将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上；
2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；
3.静置3分钟；
4.镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的,然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×稀释倍数×104
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
细胞计数板
细胞活力测定
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。
复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。
1.将细胞悬液以0.5ml加入试管中；
2.加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2-3分钟；
3.死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
细胞存活率为：活细胞数÷总细胞数×100％。
注意：活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
MTT法测定细胞相对数和相对活力
MTT法测定细胞相对数和相对活力一、原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3）MTT：以PBS配制成5mg /ml，抽滤除菌，保存在4˚C4）DMSO（二甲基亚砜）5）96孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（适用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。
3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。
4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。
5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。
7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
三、结果统计学处理所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。
可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。
或计算抑制率。
四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。
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空白对照 试验对照 药物浓度 药物浓度 药物浓度
0.304
1.733
1.862
1.322
0.989
0.313
2.049
2.0671.796Fra bibliotek1.986
0.304
2.276
2.108
2.052
1.347
0.307 1.426 1.555 1.015 0.682
1.742 1.76 1.489 1.679
药物浓度 细胞相对活 力
0 0.050805 0.152416 0.457247 1 0.995912 0.827137 0.66206
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
y = -0.0637x + 0.8295 R² = 0.8089
系列 线性
5
10
15
2.细胞倍比稀释的 作图同上（例如理 想状态） 细胞相对活力 细胞密度（10的6 次方个每ml）
细胞活力
1
0.5 0.25 0.125
5
2.5 1.25 0.625
1.2 1
0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
1
2
3
4
细胞浓度（10的6次方）
选中数据-插 入-图表-XY 散点图-下一 步-下一步标题（对标 题和X轴Y轴 进行命名， 如第几个试 验，X轴为药 物浓度，Y轴 为细胞活 力）-下一步 -完成。可见 图已经画 好，右键单 击图中一点添加趋势线 （线性回 归）-线性选项-勾选显 示公式和显 示R值-确定 。根据公式 计算药物的 IC50
6
次方）
0.57154 0.474401 0.096944 0.035819 0.017715
1.371742 4.115226 12.34568 37.03704 111.1111
0.57154 0.474401 0.096944 0.035819 0.017715
0.0637x + 0.8295 R² = 0.8089
1.337 1.191 0.317 0.086 0.055
0.525015 0.306015 0.059568 0.021024 0.004672
0.408799 0.421647 0.046136 0.036208 0.016352 0.780806 0.695542 0.185128 0.050224 0.03212
药物浓度 （X轴）细胞相对 活力（Y 轴）的作 图步骤如 下：
系列1 线性 (系列1)
y=0.5时 的药物浓 度
R值越接 近1说明 实验结果 越可靠
0.0625 0.03125 0.015625 0.3125 0.15625 0.078125
y = 0.2x R² = 1
系列1 线性 (系列1)
5
1.969 1.801 1.745 1.04
1.712333333 0.832782 0.908118 0.592759 0.398287
1.017325 1.027837 0.869574 0.980534 1.149893 1.051781 1.019077 0.607358
1 0.995912 0.827137 0.66206
药物浓度 药物浓度 药物浓度 药物浓度 药物浓度
1.206
0.831
0.409
0.343
0.315
1.007
1.029
0.386
0.369
0.335
1.644
1.498
0.624
0.393
0.362
0.899 0.524 0.102 0.036 0.008
0.7 0.722 0.079 0.062 0.028