提高显微镜分辨率的方法简述
提高显微镜分辨率的方法
提高显微镜分辨率的方法显微镜是一种非常重要的科学研究工具，它可以让我们观察到微观世界的细节。
然而，显微镜的分辨率一直是一个制约因素，限制着我们观察到更小的结构和更细微的细节。
因此，提高显微镜分辨率是当前显微镜技术研究的一个热点。
下面将介绍一些提高显微镜分辨率的方法。
1. 使用高数值孔径物镜数值孔径是一个衡量显微镜分辨率的参数，它越大，分辨率就越高。
因此，使用高数值孔径物镜是提高显微镜分辨率的一种有效方法。
数值孔径可以通过增加物镜的放大倍数、使用油浸物镜等方法来提高。
2. 使用高数值孔径接收物镜除了使用高数值孔径物镜，使用高数值孔径接收物镜也可以提高显微镜的分辨率。
接收物镜是指在物镜和检测器之间加入的一组透镜，它可以重新聚焦光线，提高分辨率。
3. 使用超分辨率显微镜技术超分辨率显微镜技术是一种新兴的显微镜技术，它可以突破衍射极限，提高显微镜分辨率。
超分辨率显微镜技术包括结构光显微镜、单分子荧光显微镜、PALM/STORM等技术。
这些技术可以将分辨率提高到亚纳米级别。
4. 使用自适应光学系统自适应光学系统是一种可以根据样品的不同特性来调整光学参数的显微镜系统。
它可以根据样品的厚度和折射率等参数来自适应地调整光学系统，提高显微镜分辨率。
5. 使用显微镜前处理技术显微镜前处理技术是一种可以在样品处理前对样品进行处理的技术。
例如，使用荧光染料、金属标记等方法可以提高样品的对比度，从而提高显微镜分辨率。
此外，使用抗振动技术、恒温控制等方法也可以提高显微镜分辨率。
提高显微镜分辨率是一个复杂的问题，需要综合运用多种技术和方法。
随着科学技术的不断进步，相信未来会有更多更先进的技术被应用于显微镜领域，从而让我们更好地观察到微观世界的奥秘。
超分辨率显微镜原理
超分辨率显微镜原理
超分辨率显微镜是一种通过克服传统显微镜的分辨率限制，能够达到更高分辨率的显微镜技术。
其原理主要基于超分辨率成像方法，包括以下几种常见方法：
1. 点扩散函数重建（PSF Reconstruction）：该方法通过量子点等微小发光点的扩散效应，测量系统的点扩散函数（PSF），
并利用逆过程重建样品的高分辨率图像。
通过巧妙选择合适的激发强度和探测方式，可以有效地提高显微镜的分辨率。
2. 结构光显微镜（Structured Illumination Microscopy，SIM）：该方法利用具有特殊图案结构的光源照射样品，通过高频投影的多个子光束和频率分析技术，得到叠加图像，从而在频域上提高了分辨率。
SIM可以将衍射极限下的分辨率提高约2倍。
3. 刺激发射退火显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）：该方法利用激光在大约50纳米范围内
激发荧光标记物，然后通过使用另一束特定的激光束使被激发的标记物发生受激发射退火（STED），从而限制只有核心激
发点发光，提高了分辨率。
4. 单分子定位显微镜（Single Molecule Localization Microscopy，SMLM）：该方法利用碰撞助熄灭的性质，使被标记的单个分子在短暂亮起的过程中精确地定位，通过多个分子的多次定位获得高分辨率的图像。
SMLM能够将分辨率提高到纳米级别，并广泛应用于生物学研究。
这些超分辨率显微镜原理的引入，使得科研人员在微观世界中获得了更为清晰、准确的图像，从而更深入地理解生物学和物理学的相关问题。
近场光学显微镜的提高分辨率研究
近场光学显微镜的提高分辨率研究在科学技术的发展中，光学显微镜一直是重要的工具之一。
然而，传统的光学显微镜在分辨率上存在局限，在观察微小结构时往往显得力不从心。
为了突破这一困境，科学家们开始研究近场光学显微镜，希望通过这种新型显微镜来提高分辨率。
近场光学显微镜利用了纳米尺度下光场与样品之间的相互作用，允许直接获得超分辨图像。
在传统的光学显微镜中，光的传播受到瑞利准则的限制，即光的分辨率不可能超过它的波长。
然而，在近场光学显微镜中，通过控制纳米大小的探测器与样品之间的距离，可以将光场限制在纳米尺度范围内，从而突破传统光学的限制。
在近场光学显微镜的研究中，有两个重要的步骤。
首先是探测器的制备。
传统的近场光学显微镜使用金属探测器，如金属探针或金属膜。
这些金属探测器的表面存在许多纳米结构，可以通过调整纳米结构的形状和尺寸来控制传感器与样品之间的相互作用。
此外，科学家们还研究了一些新型的探测器材料，如二维材料和纳米晶体。
第二个重要步骤是信号处理和图像重建。
在近场光学显微镜中，通过控制光源的强度和极化方向，可以获取样品表面的纳米结构信息。
然而，直接从探测器中获取的信号往往不是直接观察到的图像，需要经过一系列的信号处理和图像重建算法才能得到最终的高分辨率图像。
这些算法包括傅里叶分析、小波变换和非线性优化等方法，能够有效地提取出样品表面的纳米结构信息。
近场光学显微镜的研究不仅仅局限于提高分辨率，还包括了许多其他方面的研究。
例如，科学家们开始研究近场光学显微镜的光学成像原理，以及控制光场与样品之间相互作用的方法。
此外，还有人研究近场光学显微镜在生物医学领域的应用，例如细胞和组织的成像，疾病的诊断和治疗等。
近年来，近场光学显微镜的研究取得了一系列重要突破。
科学家们不断改进探测器的制备方法，设计新的信号处理算法，并开发了一些高分辨率的近场光学显微镜。
这些进展使得近场光学显微镜能够以前所未有的分辨率观察到微小结构，为纳米科学和纳米技术的发展提供了有力的工具。
提高显微镜分辨率的方法简述
提高显微镜分辨率的方法简述要提高显微镜的分辨率，可以采取以下方法：1.提高光源质量：适当选择和调整显微镜的光源可以提高分辨率。
可以使用高亮度、高聚光性的光源，例如激光或白炽灯。
同时还可以采用准直光线来避免散射，提高图像的清晰度和分辨率。
2.提高镜头质量：选择高质量的显微镜镜头可以显著提高分辨率。
晶体透镜是传统显微镜中常用的镜头材料，但其折射率有限，所以容易产生色差。
近年来，人们研发了一种特殊的镜头材料，超材料，能够有效解决色差问题，提高分辨率。
3.使用高数值孔径（NA）镜头：数值孔径是一个评估显微镜透镜的能力的量：数值孔径越大，显微镜的分辨率就越高。
因此，使用高数值孔径的镜头可以大大提高显微镜的分辨率。
高数值孔径的镜头一般可以捕捉更多入射光线，使得细小结构能够更清晰地呈现在显微镜中。
4.使用准直光源：通过使用准直光源，可以减小入射光线的散射，提高图像的清晰度和分辨率。
准直光源可以通过利用消色差镜来实现，消除色差，提高出射光线的质量。
5.使用成像增强技术：有许多成像增强技术可以进一步提高显微镜的分辨率。
例如，通过将样本固定在抗漂白剂或增强荧光剂中，可以减小影像模糊的程度，提高分辨率。
此外，还可以应用局部放大或局部可见光技术，使得观察对象的局部区域能更清晰地被观察到。
6.使用计算成像方法：计算成像方法是一种通过计算机处理采集的图像以提高分辨率的方法。
通过计算成像方法，可以通过数学算法对采集的图像进行处理，并消除噪声和模糊，从而提高分辨率。
这种方法可以通过多次拍摄同一场景并合成一幅图像，或者通过提取样本的特定信息进行图像重建。
以上是提高显微镜分辨率的一些方法，通过选择适当的光源、镜头和成像增强技术，以及采用计算成像方法，可以有效地提高显微镜的分辨率，使得观察对象的细小结构能够更清晰地呈现在显微镜中。
提高显微镜分辨率的方法
提高显微镜分辨率的方法
提高显微镜分辨率的方法
一、改善视野条件
1、减少发射源的衰减：通过调整发射源的功率，减少发射源的衰减，改善放大率，提高显微镜的分辨率。
2、改善放大率：在改善发射源的功率的同时，可以通过调整放大率来改善显微镜的分辨率。
3、改善放大镜的结构：改善放大镜的结构，可以改善放大率，提高显微镜的分辨率。
二、改善显微镜的显示系统
1、改善显示系统：通过改善显示系统的参数，可以改善显微镜的分辨率。
2、调整显示面板：调整显示面板的参数，可以改善显微镜的分辨率。
3、改善显示系统的光学结构：通过改善显示系统的光学结构，可以改善显微镜的分辨率。
三、改善显微镜的控制系统
1、调整控制系统的参数：调整控制系统的参数，可以改善显微镜的分辨率。
2、优化显微镜的控制系统：优化显微镜的控制系统，可以提高显微镜的分辨率。
3、改善显微镜的驱动电路：改善显微镜的驱动电路，可以改善
显微镜的分辨率。
四、提高显微镜的显示分辨率
1、利用数字技术提高显微镜的显示分辨率：数字技术可以提高显微镜的显示分辨率，从而改善显微镜的分辨率。
2、利用抗差异技术提高显微镜的显示分辨率：使用抗差异技术，可以提高显微镜的显示分辨率，从而改善显微镜的分辨率。
3、利用图像处理技术提高显微镜的显示分辨率：使用图像处理技术，可以提高显微镜的显示分辨率，从而改善显微镜的分辨率。
以上就是关于提高显微镜分辨率的方法的介绍，希望对你有所帮助。
如何提高显微镜的分辨率
如何提高显微镜的分辨率显微镜是科学研究和实验中经常使用的一种工具，它可以放大微小的物体，使我们能够观察和研究它们的细节和特征。
然而，显微镜的分辨力是一个重要的参数，它决定了显微镜在放大物体时能够分辨多小的细节。
更高的分辨率意味着更清晰的图像和更准确的观察结果。
那么，如何提高显微镜的分辨率呢？以下是一些方法和技术。
1.使用更高的放大倍数：分辨率与放大倍数成正比。
显微镜的放大倍数越高，它所能够分辨的最小细节就越小。
因此，使用更高倍数的镜头可以实现更好的分辨率。
2.使用抗衍射技术：衍射是显微镜分辨率的一个限制因素。
衍射现象会导致光的波动以特定模式散布，从而形成模糊和不清晰的图像。
通过使用抗衍射技术，如改善光学设计、使用不同的光源和特殊的光学元件，可以减少衍射现象，从而提高分辨率。
3.使用近场扫描光学显微镜（NSOM）：NSOM是一种能够实现超分辨率的显微镜技术。
它通过将样本与探测器之间的距离保持在纳米尺度级别，可以获得比传统显微镜更高的分辨率和更详细的信息。
4.使用高数值孔径（NA）物镜：物镜的数值孔径决定了显微镜的分辨力。
数值孔径越高，分辨力越好。
因此，选择具有高数值孔径的物镜可以增加显微镜的分辨率。
5.使用相干光源：相干光源可以提供更高的分辨率。
由于相干光的波前性质，它可以提供更多的波动信息，并产生更多的细节。
6.使用投射透射电子显微镜（TEM）：传统的光学显微镜受到光的衍射而有限制，而TEM使用电子束而不是光束。
电子波长远小于光波长，因此TEM可以提供比光学显微镜更好的分辨率。
7.使用荧光显微镜和标记技术：荧光显微镜结合了特殊的荧光标记技术，可以使显微镜的分辨率得到进一步提高。
通过标记目标物质，然后使用荧光染料的特殊性质，可以提高显微镜的分辨率和对细节的识别能力。
8.使用超分辨率显微镜技术：超分辨率显微镜技术是一种较新的显微镜技术，它可以实现比传统显微镜更高的分辨率。
这些技术包括结构光显微镜、PALM/STORM、STED和SIM等。
提高显微镜的方法
【摘要】提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。
二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。
生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。
近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。
高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。
【关键词】光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。
对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。
随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。
光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。
在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。
本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。
1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。
类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。
因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF 通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。
如何提高显微镜的分辨率
如 何 提 高 显 微 镜 的胡
玉 华
分胡 玉 芝
辨陈 守 清
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48
□
显 微 镜 是 实 验 室 最 重 要 的 设 备 之 一 ，而 评价光学显微镜及电子显微镜性能的重要 指标都是分辨率。
1 、显微镜的分辨率
分辨率是指能清楚地分辨两个小点或 两线间的最小距离。人眼本身就是一台显微 镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离（国 际 公 认 为 25cm） 上 的 分 辨 率 约 等 于 1/ 10mm。对于观察两条直线来说，由于直线 能 刺 激 一 系 列 神 经 细 胞 ，眼 睛 的 分 辨 率 还 能 提 高 一 些 ，这 就 是 显 微 镜 的 分 划 板 使 用 双 线 对准的原理所在。
●如何提高电子显微镜分辨率 电子显微镜就是利用短光波来提高分 辨力以检视较小物体的。物镜分辨力的高低 与造象是否清楚有密切的关系。而目镜没有 这种性能，因为目镜只放大物镜所造的象。 为 此 ，提 高 电 子 显 微 镜 放 大 率 的 方 法 可 从 以 下几个方面考虑：①保持良好的加速电压。 加速电压不能很低，正常应保持在 20~30KV。②尽量缩短工作距离。工作距离不 能太大，一般保持在 5~8mm，以缩短探头接 收 信 号 的 距 离 。 ③ 保 持 好 样 品 的 倾 斜 度 ，样 品倾斜 10~150，使二次电子发射及接收的 多。 ④ 聚 光 镜 放 在 600~ 650 左 右 ，（数 值 越 大 ，束 斑 尺 寸 越 小 ，分 辨 率 越 高）。 ⑤ 对 中 良 好 ，保 证 电 子 束 对 中 ，信 号 强 ，亮 度 好 。 ⑥ 及 时 更 换 新 的 灯 丝 ，使 灯 丝 饱 和 ，束 流 稳 定 ，并 使束流值保持在 100~150。⑦物镜光阑合轴 好（特征点在 2000X 倍以上时，基本 同 心 聚 焦 散 焦）。 ⑧ 延 长 抽 真 空 的 时 间 以 提 高 真 空 度（一般在 30 分钟以上基本达到平衡）或检 查真空系统的密封状态。（作者单位：建平县 产品质量监督检验所）
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目录1 选题背景 (1)2 方案论证及过程论述 (1)2.1 像差 (1)2.1.1 球面像差 (1)2.1.2 慧形像差 (2)2.1.3 色像差 (2)2.2 照明对显微镜分辨率的影响 (2)2.2.1 非相干光照明 (2)2.2.2 相干光照明 (2)2.2.3 部分相干光照明 (3)2.2.4 临界照明 (3)2.3 衍射 (3)2.3.1 对两个发光点的分辨率 (3)2.3.2 对不发光物体的分辨率 (4)2.4 光噪声 (6)3 结果分析 (6)4 结论 (7)4.1 提高光学显微镜与电子显微镜分辨率的方法 (7)4.1.1 提高光学显微镜分辨率的方法 (7)4.1.2 如何提高电子显微镜分辨率 (7)参考文献 (9)1 选题背景显微镜是实验室最重要的设备之一，对观察微小物体细节的显微镜来说，评价光学显微镜及电子显微镜的重要指标之一是分辨本领。
显微镜的分辨能力是指其分辨近距离物体细微结构的能力，它主要是显微镜的性能决定。
通常是以显微镜的分辨率级即显微镜能分辨开两个物点的最小距离d来表示，d值越小，则显微镜的分辨能力越强。
人眼本身就是一台显微镜，在标准照明条件下，人眼在明视距离(国际公认为25cm)上的分辨率约等于1/10mm。
对于观察两条直线来说，由于直线能刺激一系列神经细胞，眼睛的分辨率还能提高一些，这就是显微镜的分划板使用双线对准的原理所在。
人眼的分辨率只有1/10mm，那么比1/10mm小的物体或比1/10mm近的两个微小物体的距离，人眼就无法分辨了。
这时人们开始研制出放大镜和显微镜，显微镜的分辨率计算公式为：d=0.61入/NA；式中：d为分辨率(μm)；入为光源波长(μm)；NA为物镜的数值口径(也称镜口率)。
造成显微镜光学像欠缺的因素主要在物镜组，有像差、衍射和光噪声等，它们是影响显微镜分辨率的主要因素，其次照明对显微镜的分辨率也有一定的影响。
对于显微镜的使用者来讲，应该对造成显微镜分辨率下降的因素有比较清楚的认识，并知道克服和减少这些因素的方法。
本文从几何像差、色像差、衍射、干涉和照明几个方面分析了对显微镜分辨率的影响,指出了孔径数的增加，从衍射角度看对显微镜分辨率的提高有好处，但从几何像差的角度看则会降低显微镜的分辨率;并指出了照明对显微镜分辨率的影响是不可忽略的等。
2 方案论证及过程论述2.1 像差像差可分为单色像差和色像差两大类。
单色像差有五种：（1）球面像差；（2）彗形像差；（3）像散；（4）像场弯曲；（5）畴变。
其中（1）和（2）是由大孔径引起的，（3）、（4）、（5）是由大视场引起的。
显微镜需要大孔径，但不需要大视场，所以显微镜的单色像差主要是（1）和（2）。
2.1.1 球面像差单球面公式只有在满足近轴光线的条件下才能成立。
当孔径较大时，有许多远轴光线也进入了透镜，近轴光线和远轴光线经透镜折射后不能在同一点上会聚。
换句话说，主轴上一物点经透镜成像后，像不是一个点，而是一个圆斑，这样就产生了球面像差。
消除的方法有二：一是在透镜前加一光阑，用以限制远轴光线的进入。
这样做，会使显微镜的孔径数降低，从而降低了显微镜的分辨率。
二是用复合透镜法，显微镜物镜就是采用这种方法制作的。
2.1.2 慧形像差傍轴物点.它正适用于显微镜发出的宽阔光束经透镜后在像平面上不再交于一点，而是形成如彗星样的亮斑，称为慧形像差。
球差和慧差往往混在一起，只有当轴上物点的球差已消除时，才能明显地观察到傍轴物点的慧差。
2.1.3 色像差由于折射率随颜色、波长而变，同一物点不同颜色的光所成的像，无论位置和大小都不同，这样就产生了色像差。
消除的方法是采用消色差透镜组，即用冕牌玻璃的凸透镜和火石玻璃的凹透镜组成复合透镜。
当把由几何光学计算得到的几何像差和色像差基本消除后，由于存在衍射效应，理想成像条件仍不能满足。
2.2 照明对显微镜分辨率的影响2.2.1 非相干光照明瑞利判据的前提就是两光点的光是非相干光。
一般我们讨论的两光点都是自然光，这样，由两点发出的光在像面上叠加时，遵守强度叠加法则。
当一个物点（点光源）在像平面上产生的爱里斑的中心正好落在近傍的第二个物点（点光源）所产生的爱里斑的边缘上时，则说它们是显微镜刚能分辨的两个物点（点光源），绘出两物点（等亮度）间隔为瑞利间格(即后面（8）式中的d)时两个爱里斑的重叠情况，就能得到合强度曲线，这曲线在两个峰值的中间有一个凹陷，其最低点的强度I c等于峰值I o的0.735倍，即：I c：：I o = 0.735 ：1这可以看作是瑞利判据的强度表述：若在两个点像的中央，合成强度分布有26.5%的下陷，则我们说对应的两个物点刚刚能被分辨。
2.2.2 相干光照明用发自一点的单色光来照明标本，从标本上相邻两点发出的光是相干光。
在两物点间隔为瑞利间格时，将像的强度曲线绘制出来。
这时我们看到两个像点中央的光强度没有凹陷，反而高出原最大值的47%。
为什么会这样呢？是因为相干光照明引起的。
当两物点（点光源）发出的光是相干光时，在像平面上是振幅相加（干涉）而不是强度相加。
为了对相干照明下的两物点也规定一个分辨标准，并且这个标准对不同的相干性照明都适用，比照瑞利判据，我们采用像平面上光强曲线在两个峰值间有一个凹陷，其最低点的光强等于峰值的0.735倍，这时我们认为对应物平面上的两点是刚好能被分辨的。
于是，增大两物点间距，使像平面合强度曲线有26.5%的中央凹陷，经计算：d＇= 0.77λ/NA （1）此距离d＇即为最小分辨距离。
2.2.3 部分相干光照明实际显微镜的照明都是部分相干的，完全的相干照明只是极限情况，而完全的非相干照明只存在于一些特殊的距离。
对于部分相干照明来说，分辨本领介于相干情形和非相干情形之间，其最小分辨间隔可以表示为：d〞= Cλ/NA （2）系数C介于0.61和0.77之间，它的值与相干度有关。
调节照明的相干度，可以在一定的范围内改变显微镜的分辨本领，改变的范围为：(0.77-0.61)/0.61 *100%= 26.4% （3）可见改变的范围为26.4%这个数值是不可忽略的。
2.2.4 临界照明无论点光源还是扩展光源，它们都是程度不同的相干照明。
让一个亮度均匀的光源紧靠在场阑的后方，并由聚光镜成像在物平面上，对物平面上的标本照明。
由光源上轴点发出的光受孔径光阑的限制，在聚光镜上的光锥截面是一个圆盘，它的半径以α表示，聚光镜到物平面的距离以L表示，其间的煤质折射率以n＇表示，则爱里斑(相干区域)的直径为：D = 1.22λL/n＇·α（4）式中α是受孔径光阑限制的，增大光阑则D变小，于是相干度变小，分辨率提高，反之分辨率降低。
上式中L/n＇·α近似和聚光镜的有效数值孔径N·A＇成反比，即有：D∝λ/N·A＇（5）因此可以说，聚光镜的数值孔径控制照明的相干度，从而影响显微镜的分辨率。
2.3 衍射在衍射理论的基础上，应区分对发光点和非发光物体两种不同情况的分辨。
2.3.1 对两个发光点的分辨率按瑞利判据，在理想成像条件下，对于两个自发光点（即认为各点发出非相干光），在显微镜像平面上两个像点刚好能分辨开的最小距离d＇应等于爱利斑的半径，即为：d＇≈1.22λl＇/Dˊ= 0.61λ/n＇sinu＇（6）式中：Dˊ——入瞳直径；l＇——像点至物镜（入瞳）中心的距离；u＇——物镜像方孔径角见图；由于显微镜的成像满足正弦条件，即有n·d·sinu = n＇d＇sinu＇ (7) 将上述正弦条件代入式（6）中，且有n＇= 1，则得到d = 0.61λ/n·sinu = 0.61λ/NA (8)上式中d即为显微镜物平面上能被分辨的两发光点的最小距离。
2.3.2 对不发光物体的分辨率实际显微镜中的成像情况要更为复杂。
通常被观察的标本并非自发观体，而是由外加光源与照明系统照明的。
标本各点的像是由光源（非点光源）发出的光线照射标本后，由标本上各点的散射或衍射形成的。
阿贝研究并创立了不发光物体的成像理论。
按照这一理论，当用显微镜观察被照明物体的精细结构时，物体对所通过的光束的作用类似于衍射光栅，因此衍射作用对于像的形成具有决定意义。
阿贝所建立的不发光物体分辨率公式，就是选择由许多平行的明暗交替条纹构成的最简单的衍射作为显微镜的理想标本成像而导出的。
根据衍射理论，在垂直的相干光照明条件下，显微镜对不发光物体的分辨率为:d = λ/NA （9）在倾斜照明条件下，显微镜对不发光物体的分辨率为d = λ/2NA = 0.5/NA （10）式中λ是所采用的照明光的波长。
表1-1是采用λ = 0.555μm的绿灯照明时，按式(10)计算得到的不同数值孔径物镜的分辨率值。
表1-1 不同数值孔径显微物镜的分辨率值干系物镜油浸物镜NA 0.10 0.30 0.65 0.95 1.25 1.40d(μm) 2.75 0.92 0.42 0.29 0.22 0.20 式6～10表明，显微镜的分辨率具有波长的数量级，其具体数值取决于照明光的波长和显微镜的数值孔径。
因此，为提高分辨本领，可采用短波长的光照明。
例如，紫外线显微镜、x射线显微镜以及电子显微镜等都是提高显微镜本领的有效途径。
提高分辨本领的更主要途径是增大显微镜的数值孔径，即可通过提高物方折射率和增大物方孔径来达到。
以透射式生物显微镜为例，对于物方（盖玻片与物镜前透镜之间）介质为空气的物镜（通常为干洗物镜），其最大数值孔径为1，对应的物方孔径角μ0(即玻璃-空气界面上的全反射临界角)约为41°实际上干系物镜的数值孔径最大不能超过0.95，由n0·sinu0 = n·sinu可知，其相应的u0和u角的值分别为39°和72°(见图1-1)；增大数值孔径的另一个重要手段是增大ｎ值，使之大于1。
为此采用浸液物镜，即在盖玻片和物镜的前透镜之间充以液体，如图1-2所示。
当以水作浸液时，在盖玻片与浸液的界面上发生全反射的临界角约为61.5°，由工作距离和透镜直径所确定的角u值实际上可以达到64°，因而水浸物镜的最大数值孔径可达NA = n·sinu = 1.33×sin64°= 1.20实际上更多采用的是n = 1.5～1.6浸油，如甘油（n = 1.455）、杉木油（n = 1.515）等。
其中，以杉木油用得最多，因其折射率与盖玻片及物镜前透镜基本相同，光线在界面上既不产生折射，也不产生全反射。
此时，最大孔径角u可达67°，相应数值孔径可达1.40；进一步采用高折射率浸油（如二碘甲烷n = 1.741）可使数值孔径最高达到1.6。