哺乳动物细胞表达重组蛋白
cho细胞重组蛋白原理
cho细胞重组蛋白原理
CHO细胞重组蛋白的原理涉及到CHO细胞的特性以及重组蛋白的生产过程。
首先，CHO细胞是一种哺乳动物细胞，常用于生物制药中。
它具有许多优点，如对重组蛋白的翻译后修饰能力强、生长快速等。
重组蛋白的原理是利用这些CHO细胞来表达外源基因，从而生产所需的蛋白质。
具体来说，CHO细胞重组蛋白的原理包括以下几个步骤：
1. 基因克隆，首先需要将所需的外源基因（编码目标蛋白的基因）克隆到适当的表达载体中，通常是质粒。
这个质粒中还包含一些调控元件，如启动子、终止子和增强子，以确保基因在CHO细胞中得到高效表达。
2. 细胞转染，将经过构建的表达载体导入CHO细胞中。
这可以通过化学方法、电穿孔法或者病毒载体等方式实现。
3. 选择和培养，转染后的CHO细胞需要进行筛选，以确保只有含有外源基因的细胞得以生长和繁殖。
通常会加入抗生素或者其他筛选标记物来实现这一步骤。
筛选后的细胞需要进行培养，以扩大
细胞数量。
4. 蛋白表达和纯化，经过培养的CHO细胞会表达外源基因编码的蛋白质。
这些蛋白质可以分泌到培养液中或者留存在细胞内。
随后，需要对培养液或者细胞进行相应的分离和纯化步骤，以获取纯
净的重组蛋白。
总的来说，CHO细胞重组蛋白的原理是利用CHO细胞表达外源
基因，并通过细胞培养和蛋白纯化等步骤最终获取纯净的重组蛋白。
这一技术在生物制药领域得到广泛应用，为生产重组蛋白药物提供
了重要的手段。
重组蛋白的表达系统(详细版)
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.1 表达菌株
原核表达系统刚用的宿主菌有E. coli，Bacillus等。其中革兰式阳性的Bacillus 更适宜在其周质空间分泌表达重组蛋白；革兰氏阴性的E. coli能够广谱表达异 源蛋白。
大肠杆菌表达系统是目前发展最完善的重组蛋白表达系统。常用大肠杆菌菌株 有BL21（DE3）、BL21（DE3）Star、B834（DE3）等，这些菌株都敲除了蛋 白酶，并溶源了噬菌体DE3。DE3是的一种衍生λ噬菌体，带有噬菌体21抗性区 和 lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7 RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基 因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一 旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7 RNA聚合酶 基因转录，在溶原培养体系中加入IPTG诱导T7 RNA聚合酶生产，继而质粒上 的目的DNA开始转录。同时，还有一些特殊设计的菌株以表达有特殊需要的 重组蛋白，如甲硫氨酸营养缺陷型表达硒代甲硫氨酸蛋白，溶解性增强的菌株 表达毒性蛋白，补充了稀有密码子的菌株表达真核蛋白等，表2给出了常用的 大肠杆菌表达菌株。
启动子受细胞类型的限制，在不同的细胞系中有很大不同 ，因此需根据宿主细胞（尤其是真核宿主）的类型选择不 同的启动子以便于目的基因的高效表达。
融合标签： 融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽，方便重组蛋白的纯化、固定和检测，表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋
白进行纯化，尽量不要引入融合标签，以免影响蛋白性质；如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱，如某些金属结合蛋白可以结合 Ni-NTA，某些糖结合蛋白能够特异识别糖类，也不必引入标签。 融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程，并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒，如pET、pGEX等提供了各种纯化标签 和融合蛋白供选，应根据蛋白具体情况进行选择。 His-tag是最常用的纯化标签，它具有很多优点：标签较短（10-20个氨基酸残基），不带电（pH8.0），免疫原性差，通常不影响 重组蛋白的结构和功能，Ni2+亲和力高，能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。 如果蛋白质溶解度不高，导致折叠困难、表达量低，可以选择较大的融合标签（GST、MBP、Trx等）帮助重组蛋白表达和折叠， 提高重组蛋白溶解度，从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止，纯化后发现大部分都是标签蛋白也 是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化，所以在短标签能够达到目的的时候，尽量不要选择大的融合标 签。 标签位置的选择也很重要：N端标签（短的或长的）自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子，可以帮助目的蛋白表达，提高表达 量，但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来，降低重组蛋白纯度，对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有 集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签；C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外，如果蛋白的近N端或近C端 有重要功能区，如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等，则要避免纯化标签位于该末端，以免影 响重组蛋白的结构和功能。
cho细胞表达重组蛋白方案
CHO (Chinese Hamster Ovary) 细胞是常用的哺乳动物细胞系统，用于表达重组蛋白的研究和生产。
以下是一般性的CHO 细胞表达重组蛋白的方案：
1. 购买表达载体：选择适合的表达载体，可以是质粒或病毒载体。
载体应包含适当的启动子、选择标记等。
2. 转染CHO 细胞：将表达载体导入CHO 细胞中。
转染方法可以选择经典的化学或电穿孔法，也可以选择使用特定的转染试剂或转染仪器。
3. 选择稳定转染株：在转染后，使用适当的选择剂(如抗生素) 处理细胞，以选择稳定表达重组蛋白的细胞株。
可通过单克隆分离等方法筛选和扩增单一细胞克隆。
4. 细胞培养条件优化：优化培养基配方和细胞培养条件，包括温度、pH 值、培养基组分等，以提高重组蛋白的产量和纯度。
5. 表达蛋白的诱导：使用适当的诱导剂或方法，例如添加诱导剂(如甲酪酸) 到培养基中，以启动重组蛋白的表达。
6. 重组蛋白的纯化和分析：通过细胞破碎和不同的纯化步骤（如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等）从培养基或细胞提取物中纯化目标重组蛋白，并使用适当的分析方法验证表达的蛋白的纯度和功能。
在每个步骤中，需要根据具体的重组蛋白和研究目的进行优化和调整。
此外，合理的培养细胞和操作操作也至关重要，以确保产量和纯度的理想达到。
这些方案的细节将根据具体的实验目的和需要进行个体化定制。
重组菌株外源蛋白生物学信息-概述说明以及解释
重组菌株外源蛋白生物学信息-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容如下：随着生物技术的迅速发展，重组蛋白已经成为了现代生物学研究和应用的重要组成部分。
重组蛋白是通过在不同来源（通常为非人源）的宿主细胞中表达外源基因而产生的蛋白质。
这种技术使得科学家们能够在大规模生产外源蛋白的同时，也能够通过生物学方法对蛋白质进行定点修改。
重组蛋白的应用广泛涉及到各个领域，包括药物研发、生物治疗、农业改良以及基础生物学研究等。
这些外源蛋白的生物学信息包括其序列、结构、功能以及相互作用等方面。
了解和分析这些生物学信息对于研究人员设计和优化外源蛋白的表达、纯化以及功能研究具有重要意义。
本文将重点介绍重组菌株在外源蛋白生物学信息中的应用。
首先，我们将详细探讨外源蛋白的重组技术，包括常用的表达系统和载体选择以及基因工程的策略与方法。
接下来，我们将介绍重组菌株的选择与构建，包括宿主菌株的选择、遗传转化技术以及菌株构建的方法。
最后，我们将讨论外源蛋白的表达与纯化技术，介绍不同的表达策略和纯化方法，并探讨其在重组菌株外源蛋白生物学信息的研究中的应用。
通过对重组菌株外源蛋白的生物学信息的深入研究，我们可以更好地了解外源蛋白的结构与功能，为药物研发和生物应用提供更多的可能性。
然而，重组菌株外源蛋白的研究仍然面临一些挑战，例如蛋白质的折叠和纠正、产生的蛋白质的规模化表达与纯化等。
因此，对于重组菌株外源蛋白的未来研究和应用展望，我们也将进行探讨。
通过对重组菌株外源蛋白的生物学信息的深入研究以及对其应用前景和挑战的探讨，本文旨在推动该领域的发展，并为研究人员在选择和构建重组菌株时提供参考依据，为相关领域的进一步研究和应用提供有益的借鉴。
1.2文章结构文章结构的主要目的是提供读者一个清晰的逻辑框架，使其能够更好地理解和阅读文章的内容。
本文的结构主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分将对本文的主题进行概述，介绍外源蛋白的重要性和应用背景，并提出本文的目的。
克隆与表达重组蛋白的分子生物学方法
克隆与表达重组蛋白的分子生物学方法分子生物学方法的不断发展为克隆与表达重组蛋白提供了广泛的选择与应用。
本文将介绍一些常用的分子生物学方法，包括DNA克隆技术、基因表达系统和重组蛋白纯化方法。
一、DNA克隆技术DNA克隆技术是重组蛋白研究中至关重要的步骤。
常见的DNA克隆方法包括限制酶切、连接反应和转化等。
限制酶切是将目标基因的DNA序列与载体DNA序列选择性地切割。
通过选择合适的限制酶，可以在特定的位点切割DNA，生成兼容的黏性末端或平滑末端。
这些末端序列可被连接反应利用。
连接反应是将目标基因的DNA序列与载体DNA序列连接在一起。
经过连接反应处理后，可以通过转化的方式将重组DNA导入到宿主细胞中，实现DNA的复制和表达。
转化是将外源DNA导入到宿主细胞中，并使其在细胞内表达。
可采用多种方法进行转化，如热激转化、电转化和化学转化等。
其中，热激转化是将重组DNA与细胞一起处理，通过热冲击使细胞膜通透性增加，促进DNA的进入。
二、基因表达系统基因表达系统是实现目标基因在宿主细胞中表达的关键技术。
根据表达系统的来源，可分为原核表达系统和真核表达系统。
原核表达系统常用的是大肠杆菌表达系统。
它具有高效率、易操作和较低的成本等优点。
在这种表达系统中，目标基因嵌入到载体中，经过转化进入大肠杆菌细胞，然后通过哺乳动物细胞的重组DNA形式而进行表达。
真核表达系统常用的是酵母和哺乳动物细胞表达系统。
酵母表达系统可以利用酵母菌将目标基因表达为蛋白。
哺乳动物细胞表达系统则能够提供较高的能力，将目标基因表达为高质量的重组蛋白。
三、重组蛋白纯化方法重组蛋白纯化是将表达的重组蛋白从混合物中纯化出来的过程。
常用的重组蛋白纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。
亲和层析是利用蛋白与特定配体之间的亲和性来实现靶蛋白的纯化。
通过调节各种实验参数，如pH值、盐浓度和配体的亲和力，可以使目标蛋白与配体结合并与其他蛋白分离。
离子交换层析是利用蛋白与载体固定相之间的电荷交换来实现分离。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展
中国细胞生物学学报Chinese Journal of Cell Biology 2021，43(4): 905-916DOI: 10.11844/cjcb.2021.04.0025用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展李伟风^樊振林“2张洹瑜U2林艳^王天云G新乡医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，新乡453003;2河南省重组药物蛋白表达系统国际联合实验室，新乡453000;3新乡医学院护理学院，新乡453003)摘要 哺乳动物表达系统因其具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式，已经成为重组蛋白药物生产的主要表达系统。
中国仓鼠印巢(Chinese hamster ovary,C H O)细胞是生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主，目前近70%批准上市的重组蛋白药物是由C H O细胞生产的。
常规细胞培养所用的培养基需要补充血清才能正常生长，但血清存在来源批次不一、下游分离纯化困难、支 原体污染潜在风险等缺点，因此，C H O细胞生产重组蛋白药物要求必须用无血清培养基培养避免以上问题产生。
近年来，围绕无血清培养基进行了大量研究，并取得了显著进展。
该文综述了CHO细 胞的特性、无血清培养基的基础成分及作用，以及一些特殊添加剂的作用等方面的研究进展。
关键词 C H O细胞;无血清培养基;糖蕋化;关键成分Advances of Serum-Free Medium for CHO Cells forthe Production of Recombinant ProteinLI W e i f e n g1’2,F A N Zhenlin1’2,Z H A N G H u a n y u1，2,L I N Y a n1’3,W A N G T i a n y u n1.2* {^Department o f B iochemistry and Molecular Biology, School o f B asic Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China\2H enan International Joint Laboratory o f R ecombinant Therapeutic Protein Expression System, Xinxiang 453000, China\z S chool o f N ursing, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)Abstract M a m m a l i a n expression s y s t e m has b e c o m e the m a i n expression s y s t e m for the production of recombinant protein,d u e to its similarity o f the post-translational modification to the h u m a n cells.C H O(Chinese h a m ster ov a r y)cells are ideal m a m m a l i a n expression hosts for r e c o m b i n a n t protein production.T h e m e d i u m used for routine cell culture requires supplemental s e r u m for n o r m a l g r o w t h.H o w e v e r,d u e to the disadvantages o f s e r u m,s u c h as different sources a n d batches,difficulty in d o w n s t r e a m separation a n d purification,a n d potential risk o f m y c o p l a s m a contamination.Therefore,serum-free culture m e d i u m is required for C H O cells to produce r ecombinant protein drugs to avoid the a b o v e p r o b l e m s.In recent years,a lot o f researches h a v e b e e n per f o r m e d o n serum-free m e d i u m,a n d remarkable progress has b e e n m a d e.In this r eview,the characteristics of C H O cells,the basic c o m p o n e n t s a n d functions o f serum-free m e d i u m,a n d the functions o f s o m e special additives are r e v i e w e d.K e y w o r d s C H O cells;serum-free m e d i u m;glycosylation;k e y c o m p o n e n t收稿H期:202(M O~22 接受日期:2021 -02-04河南省高等学校重点科研项目计划(批准号:20A350007)和河南省高校重点科研项目(批准号:19A350008)资助的课题*通讯作者。
重组蛋白表达量低的原因
重组蛋白表达量低的原因重组蛋白是一种通过基因工程技术获得的蛋白质，其广泛应用于医药、农业和工业等领域。
然而，有时候在重组蛋白的表达过程中会出现表达量低的情况。
本文将探讨一些可能导致重组蛋白表达量低的原因，并提出相应的解决方法。
重组蛋白表达量低可能与宿主菌的选择有关。
不同的宿主菌具有不同的表达能力和代谢途径，因此选择合适的宿主菌对于提高重组蛋白表达量至关重要。
一些常用的宿主菌包括大肠杆菌（E. coli）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和哺乳动物细胞等。
在选择宿主菌时，需要考虑到其表达系统的稳定性、抗蛋白质降解能力以及合成成本等因素。
重组蛋白表达量低还可能与表达载体的设计有关。
表达载体是将目标基因插入宿主菌中进行表达的工具，其设计合理与否直接影响重组蛋白的表达效果。
在设计表达载体时，可以考虑使用强劲的启动子和转录终止子来提高基因的表达水平。
此外，还可以在表达载体中加入调控元件，如增加转录因子结合位点或操纵启动子的序列，以提高转录水平。
此外，还可以选择适当的信号肽序列来促进蛋白质的合成和分泌。
重组蛋白表达量低还可能与培养条件有关。
培养条件的优化可以显著提高重组蛋白的表达量。
首先，合理调节培养基的成分，如氮源、碳源和矿物质等，以满足菌体生长和蛋白质合成的需求。
其次，控制培养的温度、pH值和氧气供应等因素，以提供一个适宜的环境来促进蛋白质的表达。
此外，还可以加入一些诱导物质，如异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和甲醇等，来诱导目标基因的表达。
重组蛋白表达量低还可能与目标基因本身的特性有关。
一些基因可能具有高度的GC含量、结构复杂或毒性较强，这些特性都会影响基因的表达。
在此情况下，可以通过优化基因序列的设计来提高重组蛋白的表达量。
例如，可以通过基因合成或点突变来优化目标基因的序列，以解决结构复杂或毒性较强的问题。
除了上述因素外，重组蛋白表达量低还可能与转录和翻译后修饰等过程有关。
转录和翻译后修饰是蛋白质表达的重要环节，对于保证蛋白质的稳定性和功能性至关重要。
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哺乳动物细胞大规模生产重组蛋白的关键之处
表达载体 改进表达载体，提高表达水平和产量 分泌表达 下游纯化
宿主细胞 新型细胞株的建立
培养工艺
一、 真核表达载体
人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含： 原核DNA序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因，便于 载体在原核细胞中扩增和大量制备。 转录相关元件：哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子 元件，以及终止子和加polyA信号序列。。 翻译相关元件：有效的mRNA翻译信号 其它：视实验需要加入标志基因、内含子、内部核糖体进入 位点等。
通过将生长刺激因子、黏附因子基因导入CHO细胞中，让 CHO细胞本身提供其自身生长所需要的成分，使其能在SFM／ PFM中生长良好。
抑制细胞凋亡，延长培养周期
细胞在大规模培养初期， 目的蛋白的表达和细胞的增殖速率呈正 相关。
但当反应器中细胞的密度达到饱和后，细胞继续增殖会导致养分 和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代谢产物的大量积累，细胞逐渐 凋亡，重组蛋白表达量逐渐降低。
我国从2000年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较 晚，基础较差，但经过努力实现了该项技术的突破。
经过20多年的发展，哺乳动物细胞制备重组 蛋白技术发生了巨大的变化。主要表现在
(1) 细胞培养时间延长，由过去的7天延长至21天； (2) 细胞密度增加， 过去：1-2X106细胞／毫升， 现在：1-1.5X107细胞／毫升； (3) 产量增加， 过去：10—20pg重组蛋白／细胞／天， 50一100mg重组蛋白／升， 现在：50-90pg重组蛋白／细胞／天， 1-5g重组蛋白／升。
减少代谢产物的积累、在细胞密度达到理想值时使细胞处于增殖 遏制期以及提高细胞的抗凋亡能力是宿主细胞改造的重要方向。 通过降低产生代谢废物的基因的表达量或提高细胞的抗凋亡能力 ，都可以提高细胞的抗逆能力进而提高目的基因的表达。
人胚肾细胞（ HEK293 ）的优势 贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养 三种方式均可用于293细胞的大规模培养。 在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可 生长在血清浓度较低的培养基中。 具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因 的高稳定性
三、培养工艺
为了减少成本和节约时问，近年来发展了大规模悬浮 培பைடு நூலகம்细胞瞬时转染技术 常用的商业化的Ⅲ离了脂质转染试剂，转染效率很高， 但价格不菲 目前有两种试剂(磷酸钙和聚乙烯亚胺)可用以满足大规 模培养瞬时表达
为增加转录产物的稳定性,表达载体中一般含有天然的
或人工合成的内含子序列。
转录终止序列
真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基 因3’端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。SV40的早期 和晚期PolyA.
分泌表达载体
二、宿主细胞
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备 以下条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征， 便于大规模培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失， 易于长期保存。 合适的标记：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。
哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中， 常用的细胞系有 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 人胚肾细胞HEK293
中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本
采用无血清／无蛋白培养基(SFM／PFM)来降低细胞培养和产 品纯化的成本。双无培养基
但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其 他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中细胞常表现出活力降 低、贴壁性差等现象，进而导致分泌目的蛋白的能力下降。
哺乳动物细胞培养制备重组蛋白质药物
按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统分为:
原核表达系统 酵母表达系统 植物表达系统 昆虫表达系统
哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高， 与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物 学功能
发展历史和现状
1987年FDA批准了基因泰克公司生产的组织型纤溶酶原激活 剂（tPA） ， 世界上第一个哺乳动物细胞制备的重组蛋白质药物 标志着哺乳动物细胞制备重组蛋门时代的到来。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，
主要是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。 人巨细胞病毒的早期基因启动子和增加子( promoter ／enhancer)是最常用的启动子。 高效启动子的发现和改构
内含子
某些内含子有重要的基因功能调控序列,目的基因以基 因组形式克隆入载体能得到高表达。