PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构
PCRDGGE技术解析生物制氢反应器微生物多样性
PCR -DGGE 技术解析生物制氢反应器微生物多样性邢德峰，任南琪!，宫曼丽（哈尔滨工业大学市政环境工程学院，哈尔滨150090）摘要：为了揭示发酵法生物制氢反应器厌氧活性污泥的微生物种群多样性，从运行不同时期取厌氧活性污泥，通过细胞裂解直接提取活性污泥的基因组DNA.以细菌16Sr RNA 基因通用引物F 338GC ／R534进行V 3高变异区域PCR 扩增，长约200b p 的PCR 产物经变性梯度凝胶电泳（DGGE ）分离后，获得微生物群落的特征DNA 指纹图谱.研究表明，不同时期的厌氧活性污泥中存在共同种属和各自的特异种属，群落结构和优势种群数量具有时序动态性，微生物多样性呈现出协同变化的特征.微生物多样性由强化到减弱，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替速度由快速到缓慢.优势种群经历了动态演替过程，最终形成特定种群构成的顶级群落.关键词：变性梯度凝胶电泳；生物制氢；16Sr RNA ；微生物多样性中图分类号：X 172文献标识码：A文章编号：0250-3301（2005）02-0172-05收稿日期：2004-05-11；修订日期：2004-07-04基金项目：国家高技术研究发展计划（863）项目（2003AA 515030）；国家重点基础研究发展规划（973计划）项目（G 2000026402）；国家杰出青年科学基金项目（50125823）；黑龙江省自然基金项目（G Z03C 314）作者简介：邢德峰（1977!），男，博士研究生，主要从事环境生物技术，微生物分子生态学和废水生物处理等领域的研究.!通讯联系人A pp lication of PCR -DGGE t o Reso lve m icrobial D iversit y i n b io -H y dro g en Pro-duci n g React orX I NG D e-f en g ，REN N an-C i ，GONG M an-li（S choo l o f M un ici p al and Environ m ental En g i neeri n g ，~arb i n I nstitute o f T echno lo gy ，~arb i n 150090，Ch i na ）Abstract ：T o reveal m icrob ial d ivers it y o f anaerob ic activated s lud g e i n b io -h y dro g en p roduci n g reactor ，s lud g e i n d iff erent p eriod w ere sa m p led and t he ir g enom ic DNA o f m icrob ial comm un it y w as extracted d irectl y .A fter p urification o f t he g enom ic DNA us i n g DNAg e l recover y kit ，t he 16Sr RNA g enes （V 3re g ion ）w ere a m p lified b y us i n g t he un iversal p ri m ers （F 338GC and R534）.T he result o f a g arose g e l （2%）e lectro p hores is showt hat t he PCR p roducts w ere about 200b p .T hese a m p lified DNAfra g m ents w ere se p arated b y denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is （DGGE ）w it h t he denaturant （urea and f or m a m i de ）from30%to 60%.T he p ro file o f DGGEshow t hat d iff erent s lud g e had t he d iff erent bands ’p atterns.I n t he p ro files o f DGGE ，t here ex ist som e comm on bands i n all s lud g e sa m p les ，wh ich i nd icate t hat som e ki nds o f microor g an is m s ex ist i n each p eriod.O n t he o t her hand ，t he s p ecific bands i n som e s lud g e show t hat d iff erent p eriod had t he ir ow n s p ecific m icroor g an is m s.D y na m ics o f comm un it y structure and a m ount o f dom i nant p o p ula-tions w ere res p ons i b le to d iff erent p eriod.S h ift o f m icrob ial d ivers it y corres p ond to p eriod o f runn i n g reactor ，m icrob ial d ivers it y i n-creased bef ore it decreased.S i m ilarit y bet w een comm un ities g raduall y i ncreased ，s p eed o f sh ift g raduall y decreased i n success ion.F i-nall y ，m icrob ial cli m ax comm un it y m ade u p o f s p ecific p o p ulations w as f or m ed.K e y words ：denaturi n g g rad ient g e l e lectro p hores is （DGGE ）；b io -h y dro g en p roduction ；16Sri bosom al RNA ；m icrob ial d ivers it y发酵法生物制氢技术是实现生物制氢工业化生产最有前景的研究方向，由于采用的是厌氧活性污泥为菌种，因此，其反应器的运行状态和产氢效能直接取决于反应系统的微生物群落［1］.活性污泥微生物种类极其丰富，优势种群及其微生物多样性在活性污泥生态系统中发挥着重要的作用.目前在环境科学和污染防治研究领域，关于活性污泥中微生物多样性的研究越来越受到重视；而传统的纯培养分离技术研究活性污泥微生物多样性有很大的缺陷，不能获得未被培养的微生物的信息，只能分离出占活性污泥总数0.1%!1%的微生物种类［2］.而分子生物学技术如PCR -DGGE ［3］，PCR -SSCP ［4］和T -RFLP ［5］能够在分子水平上对活性污泥微生物多样性进行快速和精确的分子诊断，并可以监测未被培养的微生物种类.变性梯度凝胶电泳（DGGE ）是目前研究微生物遗传多样性和种群动态性最有力的分子生物学技术.1993年M u y Zer ［6］首次将该技术应用于微生物生态的研究.在近10年的时间里已被广泛应用于各种环境微生物生态的研究，如高温热泉［7］、湖泊［8］、海洋［9］、土壤［10］、沙丘［11］根际［12］、活性污泥［13］和生物膜［14］等.变性梯度凝胶电泳（DGGE ）主要原理是基于在含有线形浓度递增的变性剂（尿素和甲酰胺的混合物）的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，部分解链的双链DNA 分子的电泳迁移率降低；而序列不同的第26卷第2期2005年3月环境科学ENV I RONM ENTAL SC I ENCEV o l .26，N o.2M ar .，"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""2005DNA分子有着不同的解链行为，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使长度相同而序列不同的DNA 片段分离［15］.由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16S r RNA基因序列中可变区的碱基顺序有很大的差异，所以活性污泥中不同微生物的16S r RNA基因的V3区的扩增DNA片断在DGGE中能够得到分离，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以辨别出样品中微生物的种类多少，分析活性污泥中微生物的多样性.本文从生物制氢反应器中获取厌氧活性污泥，然后直接提取出活性污泥混合菌群的基因组DNA，以PCR扩增16S r RNA基因V3区域，用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术进行分离和鉴定PCR扩增产物，从而得出生物制氢反应器厌氧活性污泥微生物种群多样性的信息.l材料和方法l.l材料（1）厌氧活性污泥样品试验采用有机玻璃连续流搅拌槽式反应器（CSTR）［16］，发酵生物制氢反应器启动所使用的污泥来源于生活污水排放沟底泥.实验废水采用废糖蜜加水稀释而成，配制时投加一定比例的农用复合肥，使废水中CODI NI P保持在1000I5I1左右.初始COD容积负荷为7.0 k g／（m3・d），~RT为6h.间隔7d从反应器取厌氧活性污泥.（2）仪器及设备低温冷冻离心机（BECKM AN A e g ra21R）；紫外分光光度仪（UN I CAM ~E!I O S）；PCR扩增仪（PE9700）；凝胶成像分析系统（B io-Rad Am p G ene）；D code TM的基因突变检测系统（B io-Rad）；电泳仪（B io-Rad Pow er Pac B asic）；透射扫描仪（UM AX A stra4000U）.l.2方法l.2.l基因组DNA的提取采用改进的化学裂解法直接从厌氧活性污泥中提取基因组DNA.（1）提取缓冲液CTAB／N aC溶液（10% CTAB，0.7m o／L N aC），在80mL~2O中溶解4.1g N aC，缓慢加入CTAB（十六烷基三乙酸溴化铵），同时加热并搅拌，定容终体积至100mL.（2）活性污泥样品处理将1g活性污泥用无菌水洗3次后，用液氮将污泥沉淀研成粉末，取100m g 污泥粉末，加入567"L的TE缓冲液重悬，加30"L 质量浓度10%SD S和3"L20m g／mL的蛋白酶K，混匀，于37C温育1h.（3）基因组DNA的抽提加入100"L5m o／L N aC，充分混匀，再加入80"L CTAB／N aC溶液，混匀，于65C温育10m i n.加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀，12000r／m i n离心4#5m i n.将上清液转入一只新离心管中，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，混匀，离心5m i n，将上清液转入一只离心管中.加入0.6倍体积异丙醇，醇沉30m i n.12000r／m i n离心5m i n，弃上清，抽真空干燥后，重溶于50"L TE缓冲液.（4）DNA粗提液的测定使用紫外分光光度计对提取的DNA粗提液样品进行测定（OD260／OD280和OD260／OD230），计算所得样品DNA产量和纯度. l.2.2基因组DNA的纯化提取活性污泥DNA［13］，采用上海华舜DNA柱式胶回收试剂盒纯化DNA粗提液，将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应（PCR）的模板.l.2.3基因组DNA的PCR扩增使用A pp ied B ios y ste m的G eneAm p PCR s y s-te m9700型基因扩增仪.（1）以大多数细菌和古细菌的16S r RNA基因V3区通用引物扩增引物BSF338（5/-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3/）和BSR534（5/-ATT ACC GCG GCT GCT GGC-3/）（GC夹序列为：5/-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3/）.（2）PCR反应体系100"L的PCR反应体系组成如下：100n g模板、40p m o正反引物、200"m o／L d NTP s（每种10mm o／L）、10"L的10X PCR buff er（M g C2）、2.5U的!"#DNA聚合酶，无菌纯水补齐到100"L.（3）PCR反应条件采用降落PCR策略扩增，95C预变性5m i n，94C变性1m i n，65C退火1m i n，72C延伸30s，每个循环退火温度降低0.5C直至55C，30个循环，72C最终延伸8m i n.PCR反应的产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测.l.2.4变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析采用B io-Rad公司D code TM的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离.（1）变性梯度胶的制备使用梯度混合装置，制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从30%到60%（100%的变性剂为7m o／L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），其中变性剂的浓度从胶的上方向下方依次递增.（2）PCR样品的加样待变性梯度胶完全凝固3712期环境科学后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5!L和10倍加样缓冲液混合后加入上样孔.（3）电泳及染色在150V的电压下，60C电泳4h.电泳结束后，将凝胶进行银染.（4）胶图扫描将染色后的凝胶用UM AX透射扫描仪扫描后获取胶图，在凝胶两面覆上干胶膜（P rom e g a），用干胶夹定型，自然干燥后长期保存. 1.2.5DGGE的指纹图谱分析利用G el D ocu m ent3000分析软件（B io-Rad）分析DGGE的指纹图谱，通过分析样品电泳条带的数目和亮度来评估微生物多样性和种群相对数量.2结果与分析2.1厌氧活性污泥的基因组DNA提取采用冻融法和化学裂解法相结合提取厌氧活性污泥的基因组DNA.通过无菌水洗厌氧活性污泥沉淀，可以降低样品中的腐殖质等杂质的含量.通过液氮冷冻和温浴，以及溶菌酶和表面活性剂等手段尽可能使全部菌体破胞，使DNA最大限度地释放出来，从而保证获得全部细菌基因组DNA，并增加DNA提取收率.提取厌氧活性污泥基因组DNA后，经过RN ase去除RNA，然后测定其含量和纯度.提取的DNA用1%的琼脂糖，在100V电压下进行电泳.由图1所示，各时期厌氧活性污泥的细菌基因组DNA大于15kb，从不同厌氧活性污泥样品提取出的基因组DNA含量不同.由表1可知，从反应器不同运行时期获取的厌氧活性污泥，提取的DNA产量不同，从1d到29d，产量逐渐递增.1d的DNA产量最低为4.51!g／g污泥，29d最高为15.55!g／g污泥，这是由于反应器运行后生物量的增长所导致的结果.另外，从不同时期厌氧活性污泥提取的DNA 的纯度也不同，从A260／A280（核酸与蛋白质之比）和A260／A230（核酸与腐殖质等物质之比）的比值来看，22d和29d活性污泥的A260／A280的比值相对较小，这是由于微生物代谢旺盛产生了大量胞外聚合物，使DNA抽提过程不彻底所引起的.虽然DNA含量提高但是A260／A230的比值相对1d变化不大，这是由于微生物物质代谢过程中产生大量的腐殖质等物质导致.综上可见，1d的产量低纯度高，而29d虽然产量高但是纯度降低.所以，要解决产量高而带来的纯度低的问题，仍然需要改进厌氧活性污泥的DNA提取方案，在提高污泥DNA产量的同时还要达到高纯度提取.M aker：DL15000图1厌氧活性污泥基因组D N A琼脂糖凝胶电泳图谱F i g.1A g aro se g e l e lectro p ho res is o f g enom ic DNAo f d ifferen t sam p les表1污泥样品D N A的产量和纯度比较T ab le1C om p arison o f t he y ie ld and p urit y o f DNA o fd iff erent s lud ge sa m p les污泥样品／d污泥的DNA含量／!g・g-1A260／A280A260／A23014.511.3040.53487.901.3210.4831510.831.1890.6202214.631.2080.5262915.551.1120.501 2.2厌氧活性污泥的基因组DNA纯化产氢产酸的厌氧活性污泥中含有大量的腐殖质等杂质，并且在DNA提取过程中还有一些试剂是PCR扩增反应的抑制剂，直接进行PCR反应往往不能获得扩增产物.因此，在PCR反应之前，必须对厌氧活性污泥的基因组DNA粗提液进行纯化.本实验采用上海华舜DNA柱式胶回收试剂盒对厌氧活性污泥的基因组DNA粗提液进行了纯化，虽然纯化后每种厌氧活性污泥的基因组DNA产量有所损失，但纯化后的基因组DNA样品中PCR反应抑制剂的含量大大降低，从而为后续的PCR反应提供了纯度较高的DNA模板.2.3基因组DNA的PCR扩增以等量的污泥基因组DNA为模板，采用对大多数细菌和古细菌的16s r RNA基因V3区通用引物（F338GC／R534）对每个厌氧活性污泥样品的基因组DNA进行扩增，在引物F338的5 端添加GC 夹以提高扩增片断的分离效果.反应器运行不同时期的厌氧活性污泥PCR扩增结果如图2所示，经PCR反应后获得了各个时期污泥微生物的16s r RNA基因V3区的目的片断，琼脂糖凝胶电泳显示片断大小约200b p左右.采用降落PCR扩增，提高了样品的扩增特异性，降低了DGGE分析的误差.各个样品的扩增产物可以作为DGGE的样品，能够471环境科学26卷达到分离和鉴别各个厌氧活性污泥样品中微生物种类的目的.M aker：DL2000图2厌氧活性污泥样品的l6s r RNA基因V3区PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱F i g.2A g arose g e l e lectro p hores is of PCRa m p lified16s r RNA（V3）g ene o f d iff erent sa m p les2.4变性梯度凝胶电泳不同厌氧活性污泥样品的DGGE图谱如图3所示，不同厌氧活性污泥样品经过变性梯度凝胶电泳（DGGE）都可以分离出数目不等的电泳条带，且各个条带的信号强度和迁移位置不同.根据变性梯度凝胶电泳（DGGE）对具有相同大小而不同DNA 序列的片断分离原理，可以得知5个时期厌氧活性污泥的PCR产物中含有十几种不同序列的DNA片断，它们是一些特异微生物种类的16s r RNA基因V3区的DNA片断，每个独立分离的DNA片断原理上可以代表一个微生物种属.电泳条带越多说明生物多样性丰富，条带信号越强，表示该种属的数量越多，从而确定不同活性污泥中所含有的微生物的种类和数量关系，得出其中微生物多样性的信息.反应器运行初期1d时，微生物多样性较低，随着时间的推移，8d时生物多样性达到最大，15d后生物多样性开始降低，到29d时生物多样性基本保持不变.在反应器运行过程中，厌氧活性污泥微生物群落结构和种群数量存在明显的演替过程，优势种群的功能地位处于动态变化中，直到形成了顶级优势群落.“!”和“"”标记位置的条带分别为不同时期微生物群落中的优势种群，这些种群在群落演替过程中发挥着重要的作用.其中“"”标记条带为某一群落的特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征种属.在微生物群落结构的演替过程中，DGGE指纹图谱显示存在许多共同的种属，如图中“#”标记条带为共同带，在反应器运行过程中一直存在.这些现象可以说明反应器从接种污泥到稳定运行过程中，一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥着作用，是一些生态幅比较广泛的种属.不同时期的厌氧活性污泥中既存在着共同的微生物种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间通过协同和竞争作用，形成了特定生态位的群落结构.#标记条带为共同带；!和"标记条带为特征带图3不同厌氧活性污泥样品的DGGE分离图谱F i g.3DGGE p ro file o f d iff erent sa m p les2.5DNA指纹图谱分析由于影响DGGE分辨率的因素很多，所以实际上每个条带也可能是多个微生物的DNA片断.可见通过指纹分析可能由于分辨率的问题降低了群落多样性，但是仍然能够很好的分析群落多样性.通过软件对DGGE指纹图谱进行UPGM A聚类分析，图4结果显示，1d的微生物群落优势种属为14种，其群落结构与其它时期群落结构的相似性最低，由此可见反应器在运行时初期群落演替迅速.8d时微生物群落多样性达到最大，优势种群比较多，微生物优势种属达到20种.22d和29d时微生物群落结构相似程度较高为88.2%，群落演替进程缓慢，结构组成逐渐趋于稳定.厌氧活性污泥经过驯化过程，微生物数量和优势种群增加，29d时微生物多样性显著要高于1d，微生物优势种属达到17种，既存在原有种属消亡，也有新种属的增长.在演替过程中，微生5712期环境科学物多样性增加后又逐渐降低，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替过程由迅速到缓慢，形成了稳定的群落类型.3结论（1）在生物制氢反应器运行中，厌氧活性污泥微生物群落经历了明显的演替过程，群落结构和优势种群数量具有时序动态性，微生物多样性呈现出协同变化的特征.（2）DGGE的DNA指纹图谱显示，在微生物群落结构的演替过程中，各个群落都存在特征带，其代表的优势种群是特定生态条件下微生物群落的特征图4DGGE图谱UPGM A聚类分析F i g.4C luster anal y s is of DGGE b y UPGM A种属.同时，从接种污泥到反应器稳定运行过程中，也存在共同带，一些种属的微生物一直存在，并且在微生物群落的物质和能量代谢中发挥着作用，是一些生态幅比较广泛的种属.不同时期的厌氧活性污泥中既存在着共同的微生物种属，同时也存在着各自独特的微生物种属，微生物种属之间通过协同和竞争作用，形成了特定生态位的群落结构.（3）在演替过程中，微生物多样性增加后又逐渐降低，群落结构之间的相似性逐渐升高，演替速度加快后减慢，直到形成稳定的群落类型.参考文献：［1］D ebabrata D，V eZiro lu T N.~y dro g en p roduction b y b io lo g ical p rocesses：a surve y o f literature［J］.int.J.~y dro g en Ener gy，2001，26：13!28.［2］Am ann R i，LudW i g W，S ch le if er K~.Ph y lo g enetic i dentifica-tion and i n s itu detection of i nd ivi dual m 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应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析
。应用 “ G1 夹板” 技术可使检出率
应用 !""# 研究微生物群落时的常见问题分析
邢德峰， 任南琪"
（哈尔滨工业大学市政环境工程学院 哈尔滨 &($$.$）
摘
要： 变性梯度凝胶电泳 （G008） 是通过核酸片段对微生物群落进行研究， 可以监测未培养细菌及其功能基因，
被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析， 并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了 并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和 HIJ 扩增效果对 G008 操作过程中遇到的常见问题， 探讨了 G008 图谱的优化过程和图谱分析方法， 并对 G008 的应用前景进行了综述。 G008 分析的影响， 关键词：G008；微生物群落；微生物分子生态学；图谱分析；排序 中图分类号：K.%1L& 文献标识码： ) 文章编号： $$$&4"#$.（#$$"）$#4$%%&4$( 的操作过程， 对一些常见问题进行了整理和分析， 并提出了 相关的解决办法。
" 通讯作者。 23-： 1"4!(&41"#1#&&$； 567： 1"4!(&41"#1#$$1； 8496,-：+:;< =,> ? 3@A ? B:，,7@C< D6=EE? BE9? B:
作者简介： 邢德峰 （&.// F ） ， 男， 黑龙江人， 博士研究生， 研究方向为环境生物技术。 8496,-：,7@C< D6=EE? BE9? B: 收稿日期： 接受日期： 修回日期： #$$(4&$4#(； #$$(4$(； #$$(4&%
PCR_DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究
第26卷第11期2006年11月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC AV ol.26,N o.11N ov.,2006PCR 2D GGE 技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究赵兴青,杨柳燕3,陈 灿,肖 琳,蒋丽娟,马 ,朱昊巍,于振洋,尹大强(污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京 210093)基金项目:国家“973”资助项目(2002C B412307);国家重大水环境专项资助项目(2002AA601011);国家自然科学基金资助项目(40371102)收稿日期:2006204212;修订日期:2006207212作者简介:赵兴青(1974～),女,江苏高邮人,博士生,主要从事环境微生物生态学.3通讯作者C orresponding author.E -mail :yangly @Found ation item :The project was financially supported by National “973”Project ,China (N o.2002C B412307);National “863”Project ,China (N o.2002AA601011);The National Natural Science F oundation of China (N o.40371102)R eceived d ate :2006204212;Accepted d ate :2006207212Biography :ZHAO X ing 2Qing ,Ph.D.candidate ,mainly engaged in environmental m icrobial ecology.摘要:采用PCR 2DGGE 分子指纹图谱技术比较南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构,研究结果表明,三湖泊沉积物微生物的16S rDNA 的PCR 扩增结果约为626bp ,为16S rDNA V3～V5区特异性片段。
PCR-DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｎ ｏ ｄｅ ｏ ｓ ｕｄｙ ｔ ｉｒ ｂｅ ｃ ｍ ｍｕｎｉｙ ａ ｈｅ ｍｉｒ ｂ ａ ｖｅ ｓｔ ｆｔ ｏ ｅ ｄ ａ ｉ ｓ ｒ ｃ ：Ｉ ｒ ｒｔ ｔ ｈｅｍ ｃ ｏ ｏ ｔ ｎｄ ｔ ｃ ｏ ｉ ｌｄｉ ｒ ｉｙ ｏ ｈｅｂｉ ｒ ｍｅ ｉ ｔｏｎ ｓ ｉ ｒ ｏ ｌｆ ｏｍ ｏ ｅｏｉｆｅ ｄ，ｔ ｌ ｃ ｌ ｒｂｉ ｌ ｇｉａ ｅ ｈ ｌ ｙ ｃ ｍｂｉ ｄ ｗｉｈ ｔ ａ ｔｏ ｌｃ ｌｕｒ ｄ ｂａ ｅ ｓｍ ｌ ｌ ｉ ｈｅ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｏ ｏ ｃ ｌｔ ｃ ｎｏ ｏｇ ｏ ｎｅ ｔ ｒ ｄｉｉｎａ ｕ ｔ ｅ — ｓ ｄ ｏ ｉｒ ｂｉ ｌ ｇｉａ ｔ ｏｄ ｗａ ｅ ｏ ｄｉｅ ｔｙ ｅ ｔ ａ ｔ ｔ ａ ｎ ｍ ｃ ｏ ｏ ｏ ｃ ｌｍｅ ｈ ｓ ｕｓ ｄ ｔ ｒ ｃ ｌ ｘ ｒ ｃ ｏｔ ｌＤＮＡ ｒ ｆｏｍ ｌｐ ｌ ｅ ｏｉ ａ ｄ ｅ ｔ ａ ｔ ｏｉ ｏｌｕｔ ｄ ｓ ｌ ｎ ｘ ｒ ｃ
ｓ ｗｅ ｈａ ｈｅ ｍｉ ｒ ｂｉｌｃ ｈｏ ｄ ｔ ｔｔ ｃ ｏ ａ ｏｍｍ ｕ ｔ ａ ｔｔ ｆｔ ａ ｉｙ ｏ ｌｐ ｌ ｅ ｏｉ ｗａ ｅ ｓ ｔ ａ ｈａ ｆ ｎｉｙ ｑｕ ｎ ｉｙ ｏ ｈｅ ｈｅ ｖ ｌ ｉ ｏｌｕｔ ｄ ｓ ｌ ｓ ｌ ｓ ｈ ｎ ｔ ｔｏ ｌ ｗ— ｒ ｄ ｏｉ ｏ ｇａ ｅ ｌ ｐｏ ｌ ｅ ｓ ｉ， ａ ｄ ｈｅ ｌｕｔ ｄ ｏ ｌ ｎ ｔ ｍｉ ｒ ｂｉｌ ｉ ｅ ｓｔ ｏ ｔ ｂ ｏ ｅ ｄ ａ ｉ ｎ ｏｉ ｃ ｏ ａ ｄ ｖ ｒ ｉｙ ｆ ｈｅ ｉ ｒ ｍｅ ｉ ｔｏ ｓ ｌ ｗａ ｍｏ ｅ ｓ ｒ ｓｇｎ ｆｃ ｎ ｈａ ｈ ｔ ｏ ｈｅ ｕ ｂ ｏ ｅ ｄｉｔｏ ｏ ｌ Ｔｈｅ ｍ ｉｒ ｉ ｌｄ ｖ ｒ ｉｙ ｗａ ｉｆ ｒ ｎ ｌ ｎｇ ｔ ｉ ｉｉａ ｔ ｔ ｎ ｔ ａ ｆ ｔ ｎ— ｉ ｒ ｍｅ ａ ｉ ｎ ｓ ｉ． ｃ ｏｂ ａ ｉ ｅ ｓ ｔ ｓ ｄ ｆｅ ｅ ｔ ａ ｏ ｈｅ ｖ ｒ ｉａ ｒ ｃ ｉ ｆ ｔ ｏｒ ｍｅ ｉ ｔｏｎ ｓ １ ｈａ Ｓ ｈｅ ｍ ｉｒ ｂｉ ｉ ｅ ｓ ｔ ｆｍｉ ｌ ｏｉ ｗａ ｏ ｔ ｅ ｔｃ ｌｄｉｅ ｔｏｎ ｏ ｈｅ ｂｉ ｅ ｄ ａ ｉ ｏｉ，ｔ ｔｉ ，ｔ ｃ ｏ ａｌｄ ｖ ｒ ｉｙ ｏ ｄｄ ｅ ｓ １ ｓｍ ｓ ｓｇｎ ｆｃ ｎｔａ ｄ ｔ ｃ ｏ ａ ｖ ｒ ｉｙ ｏ ｈｅ ｕｒａ ｅ ｏ ｌｗａ ｈｅ ｌａ ｔ ｉ ｎｉｉａ ｍ ｏ ｇ ｔ ｈｒ ｅ ｉ ｉｉａ ｎ ｈｅ ｍｉ ｒ ｂｉｌｄｉ ｅ ｓｔ ｆ ｔ ｓ ｆ ｃ ｓ ｉ ｓ ｔ ｅ ｓ ｓｇ ｆｃ ｎｔ ａ ｎ ｈｅ ｔ ｅ ｌ ｙ ｒ ｆ ｔ ｅ ｏ ｌ Ｔｈ ｒ ｒ ｏ ｉｒ ｅ ｏ ｍｕｎ ｔ ｔ ｓ ｍｅ ｑｕ ｎｔｔ ｎ ｄ ｆｅ ｅ ｐ ｌ ｔ ｄ ａ ｅ ｓ ｏ ｈ ｓ ｉ． ｅ ｅ ｗｅ ｅ ｓ ｍｅ ｍ ｃ ｏｂ ｃ ｍ ｉｙ ｗｉｈ ａ ａ ｉｙ ｉ ｉｆ ｒ ｎｔ ｏｌｕ ｅ ｓ ｉｓ ａ ｌｏ ｓ ｏｗｅ ｏ ｅ ｄ ｆｅ ｅ ｃ ． Ｔｈｅ ｍｉ ｒ ｂｅ ｃ ｍｍ ｕ ｔ ｏ ｏ ｌ ｎｄ ａ ｓ ｈ ｄ ｓ ｍ ｉｆ ｒ ｎ ｅ ｃｏ ｏ ｎｉｙ ｃ ｍｐｏ ｉｉ ｎｓ ｗｅ ｅ ｄ ｆｅ ｅ ｔ ａ ｏ ｓｔｏ ｒ ｉｆ ｒ ｎ ｌ ｎｇ
PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用
PCR-DGGE技术在环境微生物研究中的应用发表时间：2018-06-27T09:26:47.157Z 来源：《基层建设》2018年第12期作者：陈佩佩[导读] 摘要：PCR-DGGE技术目前已被广泛应用于环境微生物领域。
温州市环境发展有限公司浙江温州 325000摘要：PCR-DGGE技术目前已被广泛应用于环境微生物领域。
介绍了PCR-DGGE技术的原理及其优点，概述了PCR-DGGE技术在环境工程废水微生物处理中的应用，分析了PCR-DGGE技术用于生物处理系统中微生物群落多样性和动态性研究的现状，并展望了其应用前景。
关键词：PCR-DGGE技术；微生物；应用变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是目前研究微生物群落结构主要分子生物学方法之一[1]。
该技术系由Fischer和Lerman于1979年最先提出一种用于检测DNA突变电泳技术，该技术使传统琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分辨精确度提高至一个核苷酸残基差异水平。
Muyzer等在1993年首次将DGGE电泳检测技术应用于微生物群落结构研究，并指出该技术在揭示自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优势。
DGGE技术能快速、准确鉴定自然环境或人工环境中微生物种群，并能揭示复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位和表达调控的评价分析，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域。
1 PCR-DGGE技术原理DGGE技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶对DNA进行电泳，该凝胶电泳时能够有区别地解链PCR扩增产物。
在进行变性梯度凝胶电泳时，长度相同而在碱基序列上存在差异的DNA双链的解链需要不同的变性剂浓度。
序列不同的DNA片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化。
起初双链DNA以现状向正极移动，随着变性剂浓度的增加，DNA中具有低G+C含量的序列的部分被打开，而高G+C含量的部分仍保持双链。
PCR_DGGE技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施
理论上，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电 泳时间、电压等适当，ＤＧＧＥ 技术便可区分一个碱基差 异的 Ｄ Ｎ Ａ 片段［１５］。但是在 ＤＧＧＥ 实际操作中通常包括： 样品的预处理、样品总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取、样品靶基因（ 如 １６Ｓ ｒ ＤＮＡ 基因片段）的 ＰＣＲ 扩增、扩增产物的 ＤＧＧＥ 分 析等步骤，每一环节的操作均有可能造成分析结果的偏 差，以致最终导致分析结果的不准确。造成结果偏差 的因素可以归纳为以下几个方面。 ３．１ 环境样品中总 Ｄ Ｎ Ａ 提取
Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ
ＭＡ Ｊｕｎ－ｘｉａｏ，ＪＩ Ｍｉｎｇ－ｊｉｅ，ＫＯＮＧ Ｊｉａｎ＊ （Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎａｎ ２５０１００， Ｃｈｉｎａ）
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ 技术是建立在环境样品的总遗传信息分 析的基础上，因此 Ｄ Ｎ Ａ 提取质量的好坏，直接影响着 后续分子实验操作。然而对于复杂环境样品 Ｄ Ｎ Ａ 提取 通常需要经过样品预处理、细胞裂解、Ｄ Ｎ Ａ 沉淀等环 节，以上过程易造成菌种数量的改变和 Ｄ Ｎ Ａ 含量的变 化，由此引起分析偏差［ １ ６ ］ 。
变性梯度凝胶电泳（ ｄ ｅ ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｇ ｒ ａ ｄ ｉ ｅ ｎ ｔ ｇ ｅ ｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术已经发展成为研究微生物群 落组成及亲缘关系的主要分子工具之一［３－４］，它不依赖于 培养过程，大大缩短了样品的分析时间，而且还能显 示环境样品中不可培养的微生物的遗传信息，因此， Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技术在微生物多样性研究中发挥了重要作用。但 是 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 技术的应用存在一定的局限性，有时造成检测 结果的偏差。本文简述 ＰＣＲ－ＤＧＧＥ 技术的原理及其在微 生物生态学中的应用，重点对 ＰＣＲ－ＤＧＧＥ 技术在复杂样 品的微生物群落分析中造成结果偏差的原因进行归纳和 讨论，并提出相应的解决方法，以便对以后的 Ｄ Ｇ Ｇ Ｅ 结
PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构
Ｏ ５后 由于 葡萄 糖 的加入 增加 到 １ ７二 级滤 池 出水 中葡 萄糖 的加 入， 强了 系统 内微 生物 的活 性， 而三 级滤池 砂 石和 青石 层细 菌条 带变 ．， ２ ．． ２ 加 从 亮变 多 ． 克 隆测序 和 系统 发 育树 分 析， 式蚯 蚓生 态 滤池 内的微 生物 多为 单细 胞 菌属 、假 单细 胞 菌属 、革 兰 氏 阴性菌 属和 不可 培 养杆 经过 塔 菌属 ， 同细菌 条 带在 不 同级滤 池 内差异 变化 明显． 不 关键 词 ：Ｐ Ｒ Ｄ Ｅ Ｃ － ＧＧ ；蚯 蚓 生态 滤池 ；微 生物 群落 ；指 数 ；菌属
中 图分 类号 ：Ｘ ０ ７５ 文 献标 识码 ：Ａ 文 章编 号 ：１０— ９ ３２ １）４ ０ ９— ６ ０ ０ ６２ （０ １０－ ５７ ０
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｃ ｏ ｅ ｃ ｍ ｍｕ ｉｙ ｉ ｏ ｒ ｅ ｒ ｈ ｒ ｅ ｏ ｏ ｙ ｆｌ ｒ ｂ ＣＲ・ ｓ ａ ｃ ｎ ｍｉ ｒ ｂ ｏ ｎ ｔ ｎ ｔ ｗｅ ａ ｔ ｗｏ ｍ ｃ ｌ ｇ ・ ｔ ｙ Ｐ ｉ ｅ ＤＧＧＥ．ＧＵＯ ｅ — ｏ ｇ ．ＺＨＥＮＧ Ｆ ｉｈ ｎ
中国环境科学
２ １，１４ ：５ ７ ６ ２ ０ １ （） ９ ～ ０ ３
Ｃ ｉａ ｎ ｉ ｎ ｎａ Ｓ ｉｎｅ ｈｎ Ｅ ｖｒ ｍｅ ｔｌ ｃ ｃ ｏ ｅ
ＰＲＤ Ｇ Ｃ — Ｇ Ｅ技术分析塔 式蚯蚓 生态滤池微生物群 落结构
郭 飞宏 ‘ ， 郑 正 ， 张继 彪 （． １ 南京大学环境学院， 污染控制与资源化研究国家重点实验室， 江苏 南京 ２０９ ； １０３
PCR-DGGE法分析细菌群落结构及多样性
PCR-DGGE法分析细菌群落结构及多样性汤玲娟;石健;范素素【摘要】采用PCR-DGGE方法研究活性污泥和土壤中微生物种群结构的变化.提取样品总DNA作为模板,采用细菌通用引物GC-338F和518R进行PCR扩增.最后对DGGE图谱中优势条带进行回收、测序.结果显示,变形菌门和拟杆菌门是构成土壤和污泥微生物群落的主要种群,且变形菌门所占比例最大,在各样品中均占40％以上,是该研究样品中的优势细菌类群;土壤的细菌群落中检测到放线菌门,而活性污泥中未检出.【期刊名称】《南通大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(016)001【总页数】4页(P35-38)【关键词】PCR-DGGE技术;16S rDNA;微生物群落;土壤;污泥【作者】汤玲娟;石健;范素素【作者单位】南通大学分析测试中心,江苏南通226019;南通大学分析测试中心,江苏南通226019;南通大学分析测试中心,江苏南通226019【正文语种】中文【中图分类】X172近年来，越来越多的学者对土壤微生物的多样性及其作用进行了研究，特别是在生态学和环境科学领域[1]，另外污泥里的微生物种群结构可以影响到污泥某些特定的处理性能[2]，因此研究污泥微生物群落结构对改进生物处理工艺及提高废水处理效率具有重要意义.变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel elec-trophoresis，DGGE）技术[3]是目前研究微生物群落结构的分子生物学主要方法之一[4-5].1993年，Muyzer团队[6]运用DGGE电泳检测技术对微生物群落结构进行了研究，发现在自然界中微生物群落无论是在多样性还是群落差异性方面都具有明显的优势.本实验中运用的PCR-DGGE技术[7]可以同时分析多份样品并对微生物的动态变化进行监测、研究.1.1 样品土壤的培养：取2份质量相同的土壤，其中一份灭菌处理.取一定量的联苯菊酯溶液分别对2份土壤进行喷洒作业，并在第1天、第7天、第20天和第44天进行取样.污泥的培养：污泥样品取自南通市第二污水处理厂，用桶装回后放在常温下静置一段时间，使得养分耗尽.以质量比为100∶5∶1的比例配置尿素、淀粉、磷酸二氢钾的混合物作为养分加入污泥里.然后加入联苯菊酯溶液并慢慢增加用药量，最终使得污泥里的微生物适应联苯菊酯溶液且以其为养料.分别在第4，8，12，16，20，24，28天进行采样.1.2 DNA提取用提取试剂盒（Mobil DNA Isolation Kit）对样品总DNA进行提取.1.3 细菌16S rDNA片段的PCR扩增样品的菌群分析以基因组DNA作为模板[4]，将样品16S rDNA高变区序列作为靶标，采用细菌通用引物GC-338F和518R进行PCR扩增.16S rDNA高变区引物序列为：518R（ATTACCGCGGCTG CTGG），GC-338F （CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGG CGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCTACGGGAGGCA GCAG）.PCR扩增体系（50μL）：50 ng DNA模板，10× PCR buffer（5μL），2.5mmol/L的高纯dNTP（3.2μL），5 U/μL的 rTaq酶（0.4μL），20μmol/L的 GC-338F和518R引物（各1μL），加入去水离子至总体积为50μL.PCR扩增反应步骤：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃维持10min.1.4 DGGE电泳及染色分析PCR产物的变性梯度凝胶电泳分析条件为：采用变形梯度为35%～55%、质量分数为8%的聚丙烯酰胺凝胶（7mol/L纯度为100%的尿素、体积分数为40%的丙烯酰胺）作为变性剂，电泳缓冲液为1× TAE，150 V电泳5 h（60℃）.电泳结束后采用银染法染色[8-9].1.5 DGGE图谱中优势条带的回收与测序将DGGE条带用灭菌手术刀切割下来并回收目的条带.将切割下来的胶放入盛有缓冲液的离心管中4℃过夜.然后，以2μL回收产物为模板，采用引物338F （CCTACGGGAGGCAGCAG）和518R（ATTACCGCG GCTGCTGG）进行PCR 扩增.将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，与Pmd18-T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，克隆培养.最后筛选阳性克隆，进行序列测定.2.1 DNA提取结果将从下列几份样品中提取的DNA片段通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，结果如图1、图2所示.由于环境样品组成复杂，因此，目标DNA片段能否顺利提取成为是否能采用PCRDGGE技术进行分析的重要前提[10].电泳结果显示，本实验可以顺利提取出样品中的DNA片段.2.2 PCR反复循环扩增后的DGGE分析图3泳道中的亮杆表示为条带，一般情况下，每一条条带代表了一种微生物[11].条带的粗细代表不同大小的密度，条带越粗表示密度越大，说明其代表的种群生物量越大，这种条带代表的微生物一般多数属于优势菌群.污泥中一共有45条条带，土壤中一共有40条条带，说明活性污泥和土壤中微生物种群丰富.2.3 菌种数的分析图4中从左到右分别为喷有联苯菊酯的土壤中微生物的种群数目、空白土壤中微生物的种群数目、经联苯菊酯驯化过的活性污泥中微生物的种群数目和未经驯化的原始污泥中微生物的种群数目.由图4可以看出，活性污泥中微生物的种群数目比土壤中微生物种群数目多，但是活性污泥中菌群类型少于土壤中菌种类型.因为污泥本身就是一个复杂的微生物生态系统，通过不断的驯化，使得污泥里的微生物不断进行调整，不断提升对环境的适应能力，提高了微生物种群的稳定性.处理土壤中变形菌门占总种群数目的50%，放线菌门占25%，拟杆菌门占 13%，厚壁菌门占12%；原始土壤中变形菌门占44%，放线菌门占11%，拟杆菌门占28%，酸杆菌门占17%；处理污泥中变形菌门占50%，拟杆菌门占42%，酸杆菌门占8%；原始污泥中变形菌门占48%，拟杆菌门占42%，酸杆菌门占10%.以上数据表明:土壤中变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是微生物群落的主要种群；活性污泥中变形菌门和拟杆菌门是构成微生物群落的主要种群.但是无论是在土壤还是污泥中，变形菌门所占比例最大，是该研究样品中的优势细菌类群.变形菌门在生态系统中分布广泛，Wagner等[12]人研究发现活性污泥中的细菌有60%属于变形菌门，其中α亚类数量非常庞大，对污染物的降解起着重要的作用.陈香碧等[13]人对喀斯特原生林土壤细菌的群落结构进行研究，发现变形菌门是该研究区土壤中的优势细菌类群.本实验的研究结果与上述文献一致.放线菌是原核生物的一个类群，最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中.图4显示土壤中有放线菌门，活性污泥里没有.造成这种情况的原因可能与活性污泥在实验前经过数日静置所引起的营养物质比例失调、pH值、溶氧量等因素发生变化有关，还需要进一步深入探索.1）通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳可成功提取样品中的DNA.2）通过DGGE分析发现，污泥和土壤中微生物种类丰富.污泥里的菌群类型要少于土壤里的菌群类型，但是在群落的种群数量上面，污泥要大于土壤.3）变形菌门和拟杆菌门是构成土壤和污泥微生物群落的主要种群，而变形菌门所占比例最大，是该研究样品中的优势细菌类群.4）受试土壤中的细菌种群比驯化后活性污泥中的细菌种群多了放线菌门.【相关文献】[1]葛斌，刘丽丽，李俊峰.土壤中农药的生物降解和生物修复综述［J］.环境保护与循环经济，2009，29（9）：71-73.[2]王峰，徐灿华，刘易，等.启动条件对活性污泥变形菌群落的影响［J］.同济大学学报（自然科学版），2007，35（7）：949-953.[3]FISCHER SG，LERMAN L S.Length-independent separa-tion of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis［J］.Cell，1979，16（1）：191-200. [4]GONGM L，REN N Q，XING D F.Application of denatur-ing gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis in microbialmolecular ecology［J］.Acta Mi-crobiologica Sinica，2004，44（6）：845-848.[5]MUYZER G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems ［J］.Current Opinion in Microbiol-ogy，1999，2（3）：317-322.[6]MUYZERG，deWAAL EC，UITTERLINDEN A G.Profil-ing of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA［J］.Applied and En-vironmentalMicrobiology，1993，59（3）：695-700.[7]刘飞.PCR-DGGE技术分析多菌态混合样品中微生物群落结构［D］.广州：华南理工大学，2012.[8]向少能，陈琳，何晓丽，等.水体微生物多样性PCRDGGE分析方法的比较研究［J］.重庆工学院学报（自然科学版），2007，21（7）：74-78.[9]陈章宝，向少能，江震献，等.PCR-DGGE研究微生物种群中多条带产生原因分析［J］.微生物学通报，2010，37（1）：147-154.[10]王峰，傅以钢，夏四清，等.PCR-DGGE技术在城市污水化学生物絮凝处理中的特点［J］.环境科学，2004，25（6）：74-79.[11]路莹.浅层地下水系统石油类污染物的生物降解机制研究［D］.长春：吉林大学，2013.[12]WAGNER M，AMANN R，LEMMER H，et al.Probing activated sludge with oligonucleotides spe cific for pro-teobacteria:inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure［J］.Applied and EnvironmentalMicrobiology，1993，59（5）：1520-1525.[13]陈香碧，苏以荣，何寻阳，等.不同干扰方式对喀斯特生态系统土壤细菌优势类群—变形菌群落的影响［J］.土壤学报，2012，49（2）：354-363.。
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中国环境科学 2011,31(4)：597~602 China Environmental Science PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构郭飞宏1,郑正2*,张继彪2(1.南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室,江苏南京 210093；2.复旦大学环境科学与工程系,上海 200433)摘要：利用PCR-DGGE技术研究塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构变化,结果表明,微生物的变化与滤池体积大小、水力停留时间和污染物负荷有关,微生物群落结构在不同滤池层中变化较大.12个样品泳道中的总细菌的Shannon-Wiener多样性指数从0.25变化到1.27,一级滤池微生物多样性指数从0.29变化到1.05,二级滤池微生物多样性指数从0.75变化到0.97,三级滤池微生物多样性指数先从0.87减少到0.25,后由于葡萄糖的加入增加到1.27.二级滤池出水中葡萄糖的加入,加强了系统内微生物的活性,从而三级滤池砂石和青石层细菌条带变亮变多.经过克隆测序和系统发育树分析,塔式蚯蚓生态滤池内的微生物多为单细胞菌属、假单细胞菌属、革兰氏阴性菌属和不可培养杆菌属,不同细菌条带在不同级滤池内差异变化明显.关键词：PCR-DGGE；蚯蚓生态滤池；微生物群落；指数；菌属中图分类号：X705 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2011)04-0597-06Research on microbe community in tower earthworm ecology-filter by PCR-DGGE. GUO Fei-hong1, ZHENG Zheng2*, ZHANG Ji-biao2 (1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210093, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China). China Environmental Science, 2011,31(4)：597~602Abstract：Change of microbe community in tower earthworm ecology-filter was studied in this research with PCR-DGGE technology (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis). These results showed that: the change of microbe community was obvious and linked with hydraulic resident time、pollutation burden and the volume of filters. Meanwhile, Shannon-Wiener Index of biodiversity increased from 0.25 to 1.27 in an all-round way, including 0.29～1.05 in the first filter, 0.75~0.97 in the second filter and 0.87~0.25~1.27 caused by some glucose added into influent in the last filter. Under the same reason, the activity and light of denitrifying bacteria were intensified on bluestone and gravel layers. After analysis of cloning sequencing and phylogenetic tree, most of the inferred bacteria were Sphingomonas, Pseudomonas, Gram-negative bacteria and uncultured Bacillus and changed evidently in different filters.Key words：PCR-DGGE；earthworm ecology-filter；microbe community；index；bacteria塔式蚯蚓生态滤池是利用蚯蚓能够提高土壤通气性能和促进有机物分解而设计的一种新型污水处理工艺,它充分利用了植物、动物和微生物的协同作用,相比传统污水处理工艺具有投资省、处理效率高、无污泥产生等优点[1].“蚯蚓”在该系统对污染物降解中的作用:一是去除污水中的有机物,二是提高土壤通气性活化土壤,从而加大土壤富氧程度,间接促进系统内的耗氧微生物的活性.但是塔式蚯蚓滤池内部结构复杂,以往的研究主要集中在进水、出水等外部影响因素上,没有对塔式蚯蚓生态滤池内部微生物群落结构[1]进行研究,使得对污水处理过程中微生物与处理效果关系性的研究仍处于“黑盒子”状态.传统的微生物生态学研究是基于微生物的直接培养来分析环境中微生物的种群结构及其生态关系的,由于自然界中可培养微生物数量占实际微生物数量不足10%,传统方法显然不适合微生物群体结构研究.PCR-DGGE技术不经过分离培养技术而直接对环境微生物进行分析,克服了传统微生物分类鉴定法的不足,可以直接可靠收稿日期：2010-07-10基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07101-004)* 责任作者, 教授, zzhenghj@598 中 国 环 境 科 学 31卷的反映出微生物的多样性[2].本研究利用PCR -DGGE 技术,以实验平台上运行1年的塔式蚯蚓生态滤池为研究对象,考察了三级塔式蚯蚓生态滤池中的微生物群落的演变.旨在为工艺运行和滤池内微生物的动态变化之间架起一座沟通桥梁,根据测得的滤池内微生物群落结构确定优势菌群进而调节工艺参数提高污水处理效率.1 材料与方法1.1 塔式蚯蚓生态滤池 塔式蚯蚓生态滤池构建于2009年2月中旬,共有三级:一级、二级的尺寸(长×宽×高)0.5m× 0.5m×0.6m,三级的尺寸1.1m×0.65m×1.2m.每级滤池填料包括土壤、细砂、碎青石和鹅卵石,土壤表面均栽种吊钟柳起到二次布水作用.实验使用的大平2号蚯蚓属于赤子爱胜蚯蚓,主要分布在土壤表层土和中层土中,蚯蚓在土壤中的接种密度为4.63g/L.进水为南京大学学生宿舍化粪池出水,采用蠕动泵控制进行间歇进水.水力负荷0.25m 3/(m 2⋅d),每天进水6h 进水与落干的时间(即湿干比)为1:3.生活污水首先进入厌氧池,经过一段时间的厌氧硝化作用,部分污染物质得到降解.厌氧池中的出水通过水泵的作用,分别进入到一级滤池、二级滤池和三级滤池.污染物在多级滤料、蚯蚓和植物的共同作用下得到去除,三级滤池的出水达到国家污水排放的一级A 标准.一级二级三级葡萄糖卵石层土壤层砂石层青石层厌氧池水泵集水区图1 塔式蚯蚓生态滤池的结构Fig.1 Structure diagram of tower earthworm ecology-filter1.2 样品采集分别于2009年11月和2010年6月从塔式蚯蚓生态滤池土壤层和砂石层取样.其中一级、二级滤池取样3份,分别是土壤表层土、中层土和砂石层,三级滤池取样6份分别是:土壤表层土、表层下5cm 土、中层土、下层土、砂石层和青石层.所有样品经冷冻干燥仪-80℃冻干后,研磨后过100目塞,样品分装放在-20℃保存待分析[3].1.3 主要试剂TE 缓冲液、二溴乙锭染色剂、1×TAE 均为自制,TaqDNA 聚合酶和10×Buffer 购自宝生物工程(大连)有限公司,扩增引物由上海生工生物工程技术有限公司合成,超纯水用Millipore 公司的Simpicity 型超纯水机制成,琼脂糖购自上海生工有限公司,dNTPs 和PCR 产物DN A Maker 购自宝生物工程(大连)有限公司. 1.4 实验方法1.4.1 基因组DNA 的提取, DN A 的提取采用MOBIO 公司的Ultra Clean Soil DN A isolation KIT 试剂盒,包括Bead Solution Tubes 、2ml Collection Tubes 、Spin Filter Units in 2ml Tubes 、4期 郭飞宏等：PCR -DGGE 技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构 599IRS solution 、Solution S1、Solution S2、Solution S3、Solution S4、Solution S5[4].1.4.2 巢式PCR 扩增,利用16SrDNA V3区引物对样品DNA 进行巢式PCR 扩增,设计的引物为63F 和1387R(一次PCR),338F -GC 和518R(二次PCR).一次PCR 扩增条件为94℃预变性5min,然后94℃变性45s,55℃退火1min,72℃延伸45s 共30个循环,最后在72℃下延伸10min.二次PCR 扩增条件为95℃预变性10min,然后95℃变性1min, 63℃退火2min,72℃延伸1min 共30个循环,最后在72℃下延伸10min.采用50μL 的反应体系,组成为:1μL 的DNA 模板,4μL 的MgCl 2,5μL 的10×PCR buffer(Mg 2+Free),4μL 的dNTPs,1μL 每种引物, 0.25μL 的Taq 酶,其余用无菌超纯水补足至50μL.扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测[5]. 1.4.3 PCR 产物的DGGE 分析,制备变性剂尿素浓度梯度50%～80%,丙烯酰胺凝胶浓度为10%的变性梯度凝胶电泳(DGGE),电泳电压100V ,电泳时间14h,二溴乙锭染色15min,脱色25min,图像在观测仪中拍照存档[6].1.4.4 Shannon -Wiener 指数分析,应用凝胶分析软件Quantity One 对扫描所得的DGGE 图谱进行分析,并利用Shannon 多样性指数来评价样品的微生物多样性.多样性指数经过长期试验和推导,得出公式:()()11log /log /ssi i i i i i H P P n N n N ===−=−∑∑式中: P i =n i /N ; n i 为峰面积; N 为所有峰的总面积. 2 结果2.1 总细菌的DGGE 图谱总细菌的DGGE 图谱如图2所示总共12个样品泳道,对2009年11月和2010年6月2次取样样品DGGE 图谱进行了比较对比,图2是图谱效果较好的一组(2009年11月) .从右往左依次为一级滤池表层土B1、中层土B2、砂石B3,二级滤池表层土B4、中层土B5、砂石B6,三级滤池表层土B7、表层5cm 下土B8、中层土B9、下层土B10、砂石B11和碎青石B12.12条样品泳道均有丰富的条带,且差异性显著,其中既有一直保持数量稳定的优势菌种,又有经过一、二级滤池逐渐培养起来的优势菌种,还有经过多层滤池数量变化较大的菌种.这说明不同滤池内部细菌总群数量丰富,在处理生活污水的过程中优势菌种充分发挥了作用.a b c d g h图2 塔式蚯蚓生态滤池总细菌DGGE 分离图谱Fig.2 Diagram of DGGE pattern in tower earthworm ecology-filter2.2 总细菌Shannon-Wiener 指数分析蚯蚓生态滤池总细菌的Shannon -Wiener 多样性指数分析见表1,不同级滤池的生物多样性差别比较大,这主要与样品所处的滤池级数和在同一滤池中所处的位置有关.2.3 总细菌片段克隆测序分析和菌种测定将总细菌DGGE 中的部分优势条带进行割胶、克隆、测序分析,在Gen bank 中进行比对获600 中国环境科学 31卷得各优势序列的同源性信息结果见表2,细菌系统发育树如图3.3分析与讨论3.1 总细菌DGGE图谱分析3.1.1从滤池角度分析一级、二级滤池泳道内细菌条带强弱变化小,数量保持稳定;三级滤池泳道内细菌变化幅度大、条带强弱差异显著,其中砂石层、青石层泳道内的细菌数量和条带亮度远优于其他泳道.这主要是由于污水首先进入一级和二级滤池,大部分污染物质被去除.但前两级滤池本身体积小,水力停留时间短,细菌代谢较快,差异性不是很明显.三级滤池体积比较大,水力停留时间长,进水中的污染物质含量的减少直接影响了三级滤池表层土、中层土和下层土内的细菌条带较弱.表1 总细菌Shannon-Wiener生物多样性指数分析Table 1 Shannon-Wiener index of biodiversity on variousbacteria样品编号B1 B2 B3 B4 B5 B6 多样性指数0.290.95 1.050.75 0.88 0.97 样品编号B7 B8 B9 B10 B11 B12 多样性指数0.870.660.250.68 1.17 1.27表2微生物群落16SrDNA片断测序分析结果Table 2 Result of sequence analysis from16SrDNA phrases in microbe community测序条带长度(bp) NCBI查询号 Genbank比对分析(相似菌种) 同源性(%) Band a 172 EU165532.1 Hyphomicrobium sp. MI-16.2 16S ribosomal RNA gene, 95 Band b 172 GQ329846.1 Thioclava. VS-127 16S ribosomal RNA gene 100 Band c 172 FJ193314.1 Uncultured Bradyrhizobium sp. GI6-6-D08 16S ribosomal RNA gene 100 Band d 197 FJ889289.1 Uncultured Pseudomonas bacterium. Plot18-A03 16S ribosomal RNA gene 100 Band e 172 AB552856.1 Sphingomonas sp. DC2a-27 16S ribosomal RNA gene 100 Band f 192 FJ944694.1 Flavobacterium johnsoniae strain KUDC-1076 16S ribosomal RNA gene 100 Band g 197 FJ535137.1 Uncultured Bacilli bacterium clone ATB-LH-7285 16S ribosomal RNA gene 100 Band h 172 EU431825.1 Uncultured bacterium clone Foos8B-85 16S ribosomal RNA gene 98 Band i 198 DQ767882.1 Veillonellaceae bacterium FCF9B 16S ribosomal RNA gene 97Band j 172 AM935639.1 Uncultured Pedomicrobium sp. 16S ribosomal RNA gene94图3 塔式蚯蚓生态滤池总细菌系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of various bacteria in tower earthworm ecology-filter4期郭飞宏等：PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构 601蚯蚓生态滤池对氨氮去除效果很好,氨氮得到了较好的吸附和硝化,但由于系统溶解氧较高,可利用的有机碳源较少,水流停留时间较短,反硝化受到抑制,硝态氮大量积累,总氮去除效果较差.为降低蚯蚓生态滤池出水中的总氮,必须强化滤池的反硝化功能,提高进水C/N比,增加反硝化所需的有机碳源.在二级滤池出水中添加了葡萄糖碳源,加强了系统内微生物的活性,促进了反硝化作用[7],第三级滤池的砂石层和青石层细菌条带数量多、亮度强.不同滤池内微生物的变化受滤池体积大小、污染物负荷多少和水力停留时间长短的影响.3.1.2从细菌条带特征分析 12条泳道细菌条带差异显著,条带b、e代表的菌种在一级、二级和三级滤池内一直存在,且数量变化小,强弱基本保持稳定.说明这类菌种很好的适应了滤池的环境,在滤池内部生长适宜,对污水中的污染物去除作用突出,属于优势菌种[8].条带f、g、i代表的菌种也是一直存在,但是不同滤池该类菌种变化大,规律不是很明显.说明该类菌种对污水的特定污染物质作用突出,是污水处理中不可缺少的菌种,但不是优势菌种[9].条带a、c、d、h代表的菌种刚开始并不存在后来才出现,并且在三级滤池表现明显.说明该类菌种在一级、二级滤池作用不明显,到了三级滤池随着环境的改变,外界条件适合该类菌种生存.该类菌种是三级滤池的特定菌种.条带j所代表的菌种刚开始有,后来消失了.说明该类菌种适宜的外界条件发生变化,该类菌种从必需菌种发展到非必需菌种.3.2总细菌多样性指数分析与讨论从表1可以看出,总细菌的Shannon-Wiener 多样性指数变化较大,这主要是由于滤池中滤料的变化、多级滤池大小的不同和污水水质的变化造成的,细菌多样性指数变化与理论基本符合.一级滤池B1、B2、B3和二级滤池B4、B5、B6样品泳道细菌多样性指数都有逐渐增大的趋势,这主要是由于污水刚进入滤池时对滤池内的微生物产生产生一定冲击,使得一些不适应该污水的微生物生长处于劣势,生物多样性指数下降.一段时间后随着细菌对污水的“适应”,细菌种类和数量都增加,生物多样性指数上升[10].三级滤池B7、B8、B9、B10、B11、B12中细菌多样性指数先减少后增加,这主要是因为实验过程中为了提高三级滤池的反硝化作用在二级出水中添加了碳源葡萄糖,充足的营养物为细菌生长提供了适宜的条件,随着有机物的消耗细菌生长受到抑制,多样性减少.而后,在三级滤池底部,添加的碳源加强了系统内微生物的活性,促进了反硝化作用[11].3.3 总细菌片段克隆测序分析根据表2的总细菌16SrDNA片断测序分析结果可知,条带d、e分别代表了假单胞菌和单胞菌.假单胞菌和单胞菌对有机物、氮、磷均有较强去除作用,同时假单胞菌还能通过反硝化作用强化氮的去除,条带d在三级滤池正因为反硝化作用才表现明显,这与理论相符合[12].条带f是黄杆菌,i是韦氏球菌均属于是革兰氏阴性菌,广泛存在于污水、土壤中,对有机物、氨氮有一定的去除作用,正因为革兰氏阴性菌在砂石、青石中分布较少、且对磷、硝态氮的去除能力有限,才会出现变化幅度大、无规律的现象.条带g属于芽苞杆菌,广泛存在于自然界中属于腐生或寄生菌类,是污水处理中不可缺少的菌属.条带a、c、h进行对比分析,不能确定菌属.但通过Gen bank 对比分析可知,条带a的相似菌属来源于活性污泥反应器中的底泥,条带c的相似菌属来源于固体颗粒表层,条带h的相似菌属来源于生物滤料池中[13],与塔式蚯蚓生态滤池的菌属来源环境基本吻合.4结论4.1塔式蚯蚓生态滤池中微生物群落的变化与滤池体积大小、水力停留时间和污染物负荷等因素有关,不同级的滤池和同级不同滤料层内的微生物多样性变化差异较大,一级和二级滤池生物多样性从上至下逐渐增多,三级滤池微生物多样性先减少后增多.4.2塔式蚯蚓生态滤池中细菌条带差异显著,一、二、三级滤池内既有一直保持稳定变化不大的细菌条带b、e,又有后来逐渐增加增强的细菌602 中国环境科学 31卷条带a、c、d、h,还有系统运行过程中消失的细菌条带j.二级滤池出水中葡萄糖的添加,加强了系统内微生物的活性,细菌条带普遍变多变亮.4.3细菌片段克隆测序发现,塔式蚯蚓生态滤池内的细菌多为单细胞菌属、假单细胞菌属、革兰氏阴性菌属和不可培养杆菌等,它们对污水中污染物质的去除发挥了重要作用.参考文献：[1] 方彩霞,罗兴章,郑正,等.改进型蚯蚓生态滤池处理生活污水研究 [J]. 中国给水排水, 2009,16(1):115-121.[2] 崔雨新,王小明.分子生物学技术在环境生物学中的应用 [J].自然杂志, 2001,21(5):295-301.[3] 俞毓馨,吴国庆,孟宪庭.环境工程微生物检验手册 [M]. 北京:中国环境科学出版社, 1990:63-79.[4] 边才苗,施时迪.土壤细菌DNA的抽提及分析 [J]. 浙江师范大学学报(自然科学版), 2002,25(1):56-61.[5] 佘跃惠,张凡. 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