美兰染色法检测酵母活性的优化试验
实训五 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
实训五酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定一、实验目的1、观察酵母细胞的形态结构及出芽繁殖；2、掌握鉴别死活酵母细胞的染色技术；3、学会水浸制片观察酵母菌。
二、实验原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞一般呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状或分枝状的假菌丝。
其细胞核与细胞质有明显分化，菌体较细菌大几倍甚至十几倍，在高倍显微镜下即可观察到胞内有明显的细胞核和内含物。
酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种。
无性繁殖大多是以出芽的方式进行，也有分裂繁殖；有性繁殖则是通过接合产生子囊孢子。
酵母菌的母细胞经过一系列的芽殖后，如长大的子细胞不与母细胞分离，就会形成藕节状的假菌丝，成为假丝酵母。
用生理盐水（或水-碘液染色液）制作水浸片可以观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。
用美蓝染色液制水浸片可鉴别酵母细胞的死活状态。
美蓝是一种弱氧化剂，氧化时呈蓝色，还原后呈无色。
用美蓝对酵母菌进行染色时，活酵母细胞因新陈代谢不断进行，胞内具有很强的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，使得细胞呈无色。
因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而老化细胞还原能力弱，染色后呈淡蓝色，死细胞则失去还原能力，被染料染成蓝色。
三、实验材料1、菌种：啤酒酵母或葡萄汁酵母（制成斜面培养物或液体培养物）2、试剂：0.1%吕氏美蓝染色液、0.05%吕氏美蓝染色液、水-碘液染色液（革兰氏染液用碘液：水=1：3）、0.85%生理盐水3、仪器及其他：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、蒸馏水、吸水纸等四、实验时间2课时五、实验步骤（一）生理盐水浸（封）片（酵母菌的形态观察）1、在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片，否则细胞易破裂），然后以无菌操作从斜面培养基上用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层。
2、用镊子取洁净盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，避免产生气泡影响观察。
3、在显微镜下，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、大小及出芽情况。
试验3- 酵母活体染色观察及死亡率的测定
试验酵母形态的观察及细胞总数、出芽率和死亡率一、目的要求1、明确血球计数板计数的原理2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术二、实验原理镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。
菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫〃霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。
两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。
每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。
计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。
使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。
血球计数扳的构造血球计数板计数网的分区和分格三、实验器材啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，电吹风，盖玻片，接种环，0.1%吕氏美蓝染色液。
四、方法步骤1、菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5-10个酵母宜，可采用10倍系列稀释法。
2、镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。
如有污物，则需清洗，用点吹风吹干后才能进行计数。
3、加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。
美兰染色法检测酵母活性的优化试验----啤酒酵母死亡率--次甲基蓝染色
美兰染色法检测酵母活性的优化试验----啤酒酵母死亡率--次甲基蓝染色美兰染色法检测酵母活性的优化试验广州珠江啤酒集团有限公司技术中心（510308）孔祥诚陈江李晓聪吴小映啤酒酵母质量的检测方法主要分为两类：一是检测酵母活性，二是检测酵母活力。
酵母活性是指酵母能否成活的能力，而酵母活力是衡量活细胞活动能力或发酵性能的指标。
当然酵母活性比酵母活力对酵母状态的判断要弱，只限于鉴别酵母的死活,不能明确地分辨活体酵母细胞的质量，但酵母活性的检测方法比酵母活力的检测相对要简单，检测时间短，在日常的生产检验中应用更强。
美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，应用广泛，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性。
活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。
文献中查找美兰染色法时，发现有多种美兰染色液的配制方法。
我们选择了三种差异较大配制方法进行比较试验，找出一种染色易于判断，结果准确的酵母活性检测方法。
还对美兰染色方法进行优化，分析操作中易引起误差，以提高检测方法的准确性。
1材料与方法1.1 L1100系列生物显微镜1.2 试剂及配制方法：1.2.1 方法1 ：FINK和KUHLES甲基蓝缓冲液：溶液A：次甲基蓝蒸馏水溶液0.1g/500ml，溶液B：磷酸二氢钾蒸馏水溶液13.6g/500ml，溶液C：磷酸氢二钠（12H2O）蒸馏水溶液 2.4g/100ml，溶液D：498.75ML溶液B+1.25ML溶液C，溶液E：混合500ML溶液D和500ML溶液A，配制的次甲基蓝缓冲液PH为4.6。
1.2.2 方法2：2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%次甲基蓝溶液）：次甲基蓝0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml。
1.2.3 方法3：吕氏碱性美兰染色液：次甲基蓝0.3g，95%乙醇30ml，0.01%氢氧化钾溶液100ml，将次甲基蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。
实验八 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别
实验八酵母菌得形态观察及死活细胞鉴别一、实验目得1、观察酵母菌得形态及出芽生殖方式;2、学习区分酵母菌死活细胞得实验方法;3、掌握酵母子囊孢子得观察方法。
二、实验原理1、酵母菌酵母菌就是不运动得单细胞真核微生物,其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍,不必染色即可用显微镜观察其形态。
但由于细胞个体大,采用涂片得方法制片有可能损伤细胞,一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。
大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖,也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。
本实验通过美蓝染液水浸片法来观察酵母得形态与出芽生殖方式,并对酵母细胞进行死活染色鉴别。
2、美蓝染液美蓝就是一种无毒性得染料,它得氧化型呈蓝色,还原型无色。
用美蓝溶液对酵母活细胞染色时,由于细胞得新陈代谢作用,细胞内具有较强得还原能力,能使美蓝由蓝色得氧化型变为无色得还原型,而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此,不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌得死细胞与活细胞。
三、实验材料1、菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)培养1天得麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。
2、溶液或试剂0、1%吕氏碱性美蓝溶液、5%孔雀绿水溶液、0、5%番红水溶液、95%乙醇,等。
3.器材显微镜,擦镜纸,吸水纸,载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、镊子等等。
四、实验步骤1、酵母菌出出芽方式得观察及死活鉴定(1)在载玻片中央加一滴0、1%吕氏碱性美蓝染色液,然后按无菌操作接种蘸取取少量液体酵母放在染液中,混合均匀,染液不宜过多。
注:染液不宜过多或过少,否则,在盖上盖玻片时,菌液会溢出或出现大量气泡。
用接种环将菌体与染液混合时,不要剧烈涂抹,以免破坏细胞。
(2)用镊子取一块盖玻片,先将一边与菌液接触,然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。
注:盖玻片不宜平放,以免产生气泡。
(3)将制片立即放在显微镜下镜检,先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母得形态与出芽情况,并根据颜色来区别死活细胞。
美兰染色法检测酵母活性的优化试验
活动能 力或发酵 性能 的指标 当然酵母 活性 比 酵母活力对酵母状 态的判断要弱 ， 只限于鉴别 酵 母 的死 活 ， 能明 确地 分辨 活体 酵母 细 胞的 质 不 量， 但酵母活性的检测方法 比酵母 活力 的检测 相 对要简单 ， 日常的生产检验中应用性更强 。 在 美兰（ 甲基蓝 ） 色法对 啤酒 酵母活性 检 次 染 测 简单 易行， 应用广 泛 ， 染色 法主要 是利用 细 该 胞膜的完整性 与新 陈代谢 的能力来表 现细胞 活 性。活酵母细胞 内具有 还原 次甲基 蓝呈无 色的 种还原酶 ， 当酵母 细胞 浸于美 兰溶液 时 ， 色素
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啤酒酵母质量 的检 测主要分为两类 ： 一是 检
测酵母活性 ； 二是检测酵母 活力。酵母活性是 指 酵母能 否成活的能力 ， 而酵母 活力 是衡量活细胞
配制 的次 甲基蓝缓冲液 ｐ Ｈ为 ４ ６ ． １２ ２ 方法 ２ ２ ．． ： ％二水合柠檬 酸钠次 甲基蓝溶
一
次 甲基蓝 ００ ｇ二水合柠檬酸 三钠 ２ ．１ ， 用蒸
馏水定容至 １ ｒ 。 ０ａ Ｏｌ １２ ３ 方法 ３ 吕氏碱性美兰染色液： ．． ：
次甲基蓝 ０ ３ ，５ 乙醇 ３ｍ ． ．１ ．ｇ ９％ ０ Ｌ ０ ０ ％氢 氧 化钾溶液 １０ Ｌ 将次 甲基蓝溶解 于乙醇中 ， ０ｍ ， 然后 与氢氧化钾溶液混合 。 １３ 美兰染色法 比较试验 ． 配制 不同状态的酵母 样品（ ： 培酵母液 ， 如 扩 发酵液， 回收酵母 ， 可对酵母进行老 化处理等 ） 还 分别用三种美兰染色液对其活性检测。 染色液 与 酵母 样 品液 等 量混 合 ， 色 ３～ 染 ５ ｉ， ｍｎ 用血球计数板计 数， 细胞 总数在 （０ ６ ） ３— ０ｘ ｌ 个 ｔＬ Ｏ ６ ｍ 。每一 种方法 对同一 酵母样 品进行 检 测时 ， 同时由三个人来 计数 ， 录结 果 ， 明细胞 记 注 染色判断 的难易。通过 对三个 人检 测结果 的分 析， 染色判断的 难易来找 出较优 的美 兰染色法 ， 结果见（ １ 。 表 ）
美兰染色法检测酵母活性的优化试验----啤酒酵母死亡率--次甲基蓝染色
美兰染色法检测酵母活性的优化试验广州珠江啤酒集团有限公司技术中心（510308）孔祥诚陈江李晓聪吴小映啤酒酵母质量的检测方法主要分为两类：一是检测酵母活性，二是检测酵母活力。
酵母活性是指酵母能否成活的能力，而酵母活力是衡量活细胞活动能力或发酵性能的指标。
当然酵母活性比酵母活力对酵母状态的判断要弱，只限于鉴别酵母的死活,不能明确地分辨活体酵母细胞的质量，但酵母活性的检测方法比酵母活力的检测相对要简单，检测时间短，在日常的生产检验中应用更强。
美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，应用广泛，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性。
活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。
文献中查找美兰染色法时，发现有多种美兰染色液的配制方法。
我们选择了三种差异较大配制方法进行比较试验，找出一种染色易于判断，结果准确的酵母活性检测方法。
还对美兰染色方法进行优化，分析操作中易引起误差，以提高检测方法的准确性。
1材料与方法1.1 L1100系列生物显微镜1.2 试剂及配制方法：1.2.1 方法1 ：FINK和KUHLES甲基蓝缓冲液：溶液A：次甲基蓝蒸馏水溶液0.1g/500ml，溶液B：磷酸二氢钾蒸馏水溶液13.6g/500ml，溶液C：磷酸氢二钠（12H2O）蒸馏水溶液 2.4g/100ml，溶液D：498.75ML溶液B+1.25ML溶液C，溶液E：混合500ML溶液D和500ML溶液A，配制的次甲基蓝缓冲液PH为4.6。
1.2.2 方法2：2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%次甲基蓝溶液）：次甲基蓝0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml。
1.2.3 方法3：吕氏碱性美兰染色液：次甲基蓝0.3g，95%乙醇30ml，0.01%氢氧化钾溶液100ml，将次甲基蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。
实验八 酵母活性的检测及线粒体活性观察
实验八酵母活性的检测及线粒体活性观察【实验材料】1 材料：液体振荡培养的酵母。
试验前48小时取部分振荡培养酵母静置培养作为对照。
2 仪器：倒置显微镜（生物显微镜），低速离心机，血球计数板，15mL离心管，试管，移液管，盖玻片，滴管，香柏油等。
3 试剂及配制方法：1）2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%的次甲基蓝）：次甲基蓝 0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml。
2）0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)：0.2mol/L NaH2P04 39mL与0.2mol/LNa2HPO4 61mL 混合再稀释至200mL。
3）0.2%的TTC溶液：称取0.2gTTC，先用少量乙醇溶解，再加2%二水合柠檬酸钠溶液至100mL。
现用现配，避光冷藏保存备用。
4）0.1%台盼兰溶液：0.1g台盼兰溶于100 mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，过滤或离心除去杂质。
冷藏备用。
5）詹纳斯绿B溶液：1%詹纳斯绿B 溶液（原液）：称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
詹纳斯绿B 溶液（应用液）：取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。
现用现配。
Ringer 溶液：氯化钠 0.85g；氯化钾 0.25g；氯化钙 0.03g；蒸馏水 100ml。
【实验方法】1）美兰染色法步骤配制不同生长状态的酵母样品（如：振荡有氧培养酵母，静置发酵培养酵母，老化发酵液等），用蒸馏水调整细胞总数在(30-60)×106个/ml。
染色液与酵母样品液等量混合，染色5min。
用血球计数板做水封片，显微镜下计数染色细胞与总细胞数。
重复3次。
细胞活性=活细胞数/总细胞数*100%2）台盼兰染色步骤：晃动悬浮培养物，稍静置，吸取上层悬浮液，在倒置显微镜下观察细胞，用缓冲液调到合适观察的细胞密度，加入几滴0.1％台盼兰溶液，用滴管混合均匀，5分钟后显微镜下观察，计数100个细胞的染色情况，重复3次，计算存活率。
用美蓝溶液鉴定酵母菌的死活
酵母菌细胞较大,不必染色就能用显微镜观察其形态. 用美蓝染色液可以对酵母菌细胞进行死活染色鉴别.美蓝是一种弱氧化剂,氧化态呈蓝色,还原态呈无色.活的酵母因为新陈代谢不断进行,具有一定的还原能力,能将进入细胞的美蓝还原,而细胞不染色.因此,用美蓝对酵母细胞染色一定时间后,无色的为活细胞,蓝色的为死细胞. 需要注意的是:一个活细胞的还原能力是有限的必须严格控制染色的时间和染料的浓度. 方法:取0.1%美蓝液一滴,滴在玻片中央,加一滴酵母菌悬液,混匀.染色3~5分钟后加盖片制成水浸标本片,镜检.酵母菌细胞较大,不必染色就能用显微镜观察其形态. 用美蓝染色液可以对酵母菌细胞进行死活染色鉴别.美蓝是一种弱氧化剂,氧化态呈蓝色,还原态呈无色.活的酵母因为新陈代谢不断进行,具有一定的还原能力,能将进入细胞的美蓝还原,而细胞不染色.因此,用美蓝对酵母细胞染色一定时间后,无色的为活细胞,蓝色的为死细胞. 需要注意的是:一个活细胞的还原能力是有限的必须严格控制染色的时间和染料的浓度. 方法:取0.1%美蓝液一滴,滴在玻片中央,加一滴酵母菌悬液,混匀.染色3~5分钟后加盖片制成水浸标本片,镜检.7.1 酵母菌的形态结构观察目的要求观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。
基本原理酵母菌细胞一般成圆形、卵圆形、圆柱形或柠檬形。
每种酵母细胞有其一定的形态大小。
大多数酵母菌在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，偶有黑色）。
酵母菌细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。
繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖。
实验材料酿酒酵母（红酵母），无菌水，0.1%美蓝液，中性红染液，苏丹黑,二甲苯，0.5%蕃红，无菌水，显微镜，载玻片及盖玻片。
实验内容(一)菌落特征的观察取少量酿酒酵母、红酵母划线接种在平板培养基上，28—300C培养3d。
观察菌落表面湿润或干燥，有无光泽、隆起形状，边缘的整齐度、大小、颜色等。
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美兰染色法检测酵母活性的优化试验
啤酒酵母质量的检测方法主要分为两类：一是检测酵母活性，二是检测酵母活力。
酵母活性是指酵母能否成活的能力，而酵母活力是衡量活细胞活动能力或发酵性能的指标。
当然酵母活性比酵母活力对酵母状态的判断要弱，只限于鉴别酵母的死活,不能明确地分辨活体酵母细胞的质量，但酵母活性的检测方法比酵母活力的检测相对要简单，检测时间短，在日常的生产检验中应用更强。
美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，应用广泛，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性。
活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。
文献中查找美兰染色法时，发现有多种美兰染色液的配制方法。
我们选择了三种差异较大配制方法进行比较试验，找出一种染色易于判断，结果准确的酵母活性检测方法。
还对美兰染色方法进行优化，分析操作中易引起误差，以提高检测方法的准确性。
1材料与方法
1.1 L1100系列生物显微镜
1.2 试剂及配制方法：
1.2.1方法1 ：FINK和KUHLES甲基蓝缓冲液：
溶液A：次甲基蓝蒸馏水溶液0.1g/500ml，
溶液B：磷酸二氢钾蒸馏水溶液13.6g/500ml，
溶液C：磷酸氢二钠（12H2O）蒸馏水溶液 2.4g/100ml，
溶液D：498.75ML溶液B+1.25ML溶液C，
溶液E：混合500ML溶液D和500ML溶液A，
配制的次甲基蓝缓冲液PH为4.6。
1.2.2方法2：2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%次甲基蓝溶液）：
甲基蓝0.01g，
二水合柠檬酸三钠2g，
用蒸馏水定容至100ml。
1.2.3方法3：吕氏碱性美兰染色液：
次甲基蓝0.3g，
95%乙醇30ml，
0.01%氢氧化钾溶液100ml，
将次甲基蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。
1.3 美兰染色法比较试验
配制不同酵母状态的样品（如：扩培酵母液，发酵液，回收酵母，还可对酵母进行老化处理等）分别用三种美兰染色液对其活性检测。
染色液与酵母样品液等量混合，染色3-5min，用血球计数板计数，细胞总数在(30-60)×106个/ml。
每一种方法对同一酵母样品进行检测时，同时由三个人来计数，记录结果，注明细胞染色判断的难易。
通过对三个人检测结果分析，染色判断的难易来找出较优的美兰染色法，结果见（表1）。
表1 三种美兰染色法检测酵母活性比较结果
藏红T又叫番红O，是从藏红花柱头中提取的一种天然染色剂，为红橙色粉末，是植物组织学实验中最常用的染色剂之一。
番红可以溶解于水和乙醇，通常配成1%水溶液染植物的木质部，也可以
按照以下配方配成苯胺番红液对组织进行块染：番红5g，95%乙醇50mL，苯胺油20mL，蒸馏水450mL。
番红能够对植物的木质化、栓质化和胶质化部分进行染色，染色后的部分为红色。
染色时间一般为2~24hrs，常与固绿等进行合作染色。
番红花提取物有细胞毒性，但对肝、肾、膀胱等器官无任何毒性。