斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育
一、实验目的
了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性
斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：
1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本
结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料
斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。曝气水10L。性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序
实验前一天的准备：
1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水
将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产
雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。一般按2 : 1的比例选择健康的性成熟雄鱼和雌鱼用于交配。选择好的雌、雄鱼放到同一个水槽箱或水盆中，用隔板或者筛网栏隔离。
在养鱼房之外，可用黑布将整个塑料盆或者水槽箱盖住，使光线不能透过而进行黑暗处理。黑暗处理开始的时间根据第二天准备开始进行试验的时间和产卵的光周期而定，保证黑暗处理时间为10小时即可。例如22:00开始，第二天早上约8:00揭开黑布。
4、交配产卵
黑暗处理10小时后进行光照，撤去隔离筛使雌雄鱼混合，并加入金鱼藻作为产卵的鱼巢。雌、雄鱼在光照后很快出现交配追逐并开始产卵，发现产卵后，用胶头滴管将胚胎吸出放入有曝气水的培养皿中进行快速漂洗后，在曝气水中于28℃进行胚胎培养。随后立即观察和记录受精卵的变化和胚胎发育的变化过程和时序。
五、斑马鱼胚胎发育的观察的基本内容和作业
鱼类的卵是端黄卵，进行盘状卵裂，通过观察斑马鱼从受精卵发育成具有自主生活能力的个体的过程了解端黄卵受精后的变化过程和盘状卵裂类型胚胎卵裂和形态模式形成的特点和过程。具体内容包括观察、作图并记录下述发育过程和时序：
1、受精卵的变化和胚盘形成的过程；
2、卵裂的方式和多细胞胚胎——囊胚的形成；
3、原肠形态发生运动——囊胚细胞经过广泛的、全局性的定向细胞运动形成原肠胚和胚胎的基本形体模式的方式、特点和过程；
4、器官发生——脑、眼睛，循环系统，消化系统，骨骼，肌肉等主要器官和系统形成的过程和时序。
附录：斑马鱼胚胎发育图谱和时序（引自Kimmel等，1995）
参考文献：
Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 1995; 203:253-310.
基因表达研究的显微操作技术
一、实验目的
通过显微操作将目标基因的DNA或者RNA分子注射到受精卵中，以观察其对胚胎发育的影响。这种显微操作技术是研究基因在胚胎发育中功能的重要手段。本实验的目的是了解和掌握显微操作的基本技术。
二、实验器材和材料
显微注射仪，体视镜，200ul移液器，100ul移液器，2.5ul移液器，注射试剂，封口膜，注射专用器皿，注射针，拉针仪。
三、实验内容和程序
1、体视镜操作：体视镜操作主要是通过调整焦距以及两个目镜之间的距离来保证视野内出现清晰且立体的景象。
2、注射仪的操作：注射仪是由定量控制器，显微注射器，手动操作仪以及固定支架等部分组成的精密仪器（图3-1）。控制器参数设置界面如图3-2。定量控制器与电源、显微注射器等的接口如图3-3。
图3-1：显微操作系统
图3-2：定量控制器面板
Output 1-4对应的信号输出端口，绿灯亮表示相应端口有信号输出；
I/W 注射/吸样；
VOLUME SET预设的注射或者吸入注射针的样品体积；
VOLUME COUNTER 实际注射进胚胎或者吸入注射针的样品体积；RATE设置的吸入或者注射速率；
DEVICE TYPE连接的仪器类型（本实验中设置为”K”）；
G/N/D 端口同时输出信号/不同时输出信号/禁用端口；
RUN/STOP 开始或者暂停工作。
图3-3定量控制器背面接口
POWER ON/OFF 开关；
RS232/FOOT SWITCH 外接控制器端口；
OUTPUT 信号输出端口，对应图2的OUTPUT 1-4。
手动操作仪主要用于控制注射针的移动和角度，操作方式如图3-4所示。
图3-4 手动操作仪操作示意图
注射针通过垫圈和电极保护套连接和固定到注射器上。
图3-5 电极保护套及将注射针固定到注射器上的垫圈
3、实验步骤
（1）通过斑马鱼人工催产准备胚胎（可以直接用受精卵，也可以用脱膜的受精卵）。
（2）注射针的准备：在斑马鱼产卵的同时组装注射针。注射针是用特制的电极毛细管用电热拉针器拉制而成，其尖细的前端是封闭的，在使用前需要截掉针尖前端的封闭部分；然后在显微镜下观察截断后针头的大小，选择有斜面（参考普通医用针头），大小合适实验需要的注射针。针头粗对受精卵的损害相对较大，但过细则容易造成堵塞。然后使用特制的移液器枪头向注射针内灌满石蜡。（3）注射针的安装：卸下操作仪的电极保护套及三个垫圈后，将保护套及较大的黑色垫圈套按大头在上，小头在下的方向依次套在注射针上。其他两个垫圈按
照黑在上，白在下的顺序套在注射器的推杆上。将注射针套入到注射器的推杆上（此步要小心操作，电极很脆弱，不能用力过度），然后将固定的电极保护套旋紧即完成注射针的安装。组装完成后，调整控制仪参数，先排出一定体积的石蜡（一般排2500nl）确保注射针的前端没有气泡。
（4）注射样品的吸取：用干净的滤纸除去针头的石蜡，剪取合适大小的封口膜，将注射用的试剂吸取数微升至封口膜上，在体视镜下开始吸样（吸取样品体积，速率要先设置好）。吸样结束后，先排除50-100nl的样品，再设置需要注射的参数。
（5）注射操作：将胚胎放置在注射专用器皿，并将待注射胚胎移动到视野内。调节手动操作仪的旋钮，将注射针头插入到胚胎的胚胎中后（插入角度以45-60°未佳），按定量控制器的注射按钮或者脚踏板将样品注入到胚胎中；约以秒钟后，调节手动操作仪的旋钮将注射针头从胚胎中拉出完成注射。然后移动注射器皿将第二个胚胎移植到注射针头下，进行下一次注射。（注射在没有脚踏板的情况下需要两个，一个人注射，另一个负责按定量控制仪以完成注射，期间可以交换操作，保证每个人都熟悉基本操作技术）。完成注射后，调整参数将电极收回，卸下注射针，关闭仪器并用玻璃保护罩罩住。
四、注意事项：
1、实验前需要先熟悉仪器，在老师指导下进行操作练习。只有经过长期练习才能熟练使用显微注射仪。刚开始做尽力做到能将样品送到胚胎内部，可以通过共注射有颜色的试剂（如酚红之类）来第一时间观察样品是否进入胚胎。之后再尽量尝试把样品注入胚盘，再然后就是同时提高注射的速度和精度。
2、针头的大小应根据实验需要进行选择。
3、尽量能在1-2细胞期将样品注入到胚盘。由于鱼类的胚胎在16细胞以前，细胞与细胞之间的细胞质是连通的，只要将样品送入胚盘都是有效果。但是实际注射时，时期越早越好，最晚在分裂到8细胞就停止注射。
基因表达与形体模式形成
一、实验目的：基因表达的严格时空控制是发育机制的核心。本次实验人工通过显微注射使斑马鱼β-catenin-2基因在胚胎发育早期过表达，干扰该基因表达的时空模式，然后观察和比较β-catenin-2基因过表达胚胎与野生型胚胎发育的差异，了解基因表达的时空控制在斑马鱼形体模式形成中的重要性。
二、实验器材和材料：
1、实验器材：
体视镜，显微注射仪，28.5℃恒温水浴设备，37℃恒温水浴锅，PH值测定仪，水平拉针仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备）等。培养皿（中号，大号），胶头滴管若干，移液枪。
2、溶液及配制：
（1）1×PBS: 将20×PBS用双蒸水稀释20倍，高温高压灭菌，室温放置备用。使用前调节至28.5℃。
（2）0.25%胰蛋白酶：准确称取0.5g胰蛋白酶，0.02g EDTA溶于200ml的1×PBS，37℃水浴充分溶解1h,4℃放置备用。使用前加热至28.5℃。
（3）1×Hank’s液: 称取0.4gKCl, 8.0gNaCl, 0.67g Na
2HPO
4
·7H
2
O, 0.6g KH
2
PO4,
1.44gCaCl
2, 1.23g MgSO
4
·7H
2
O, 溶于800ml蒸馏水中，充分溶解。使用前加入
0.35g NaHCO
3
，加水定容至1L，用HCl调至pH 7.2，4℃保存。用于斑马鱼胚胎培养时加热至28.5℃，并加入抗生素（10万单位/升的氨苄青霉素，5万单位/升的氯霉素）。
3、注射样品准备：
以BstXI单酶切后的pcs107+zfβ-catenin-2 ORF 线性质粒为模板，用Ambion 的体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit 转录全长的β-catenin-2 capped mRNA。随后使用Roche公司的Mini Quick RNA Columns 纯化 capped mRNA。检测合成的RNA的质量和浓度后，-80℃保存，备用。使用DEPC水前将β-catenin-2 capped mRNA 稀释至所需浓度（400-600ng/μl），冰上放置。
三、实验步骤：
1、斑马鱼胚胎的获得
斑马鱼在实验室条件下至于28.5℃恒温水浴养殖，以高蛋白冰血赤虫和固体
饲料作饵食，设置光照周期为10h黑暗/14h光照，性成熟后按雌雄分开养殖。催产前一天晚上，挑选2：1比例的雄鱼和预产卵雌鱼分开养殖，按照光照周期次日开始光照后雌雄混合，光照刺激15分钟左右即可开始收集受精卵。
2、斑马鱼胚胎受精膜的去除
斑马鱼卵子受精后几分钟，受精卵外围会举起一层受精膜保护胚胎，受精膜的存在不影响观察胚胎发育和模式形成，但不利于显微注射及其它后续实验，所以部分胚胎可以先利用胰蛋白酶脱膜。
在开始光照刺激产卵前1小时前，将4℃中的0.1x Hank’s液，0.25%的胰蛋白酶以及1xPBS溶液取出，将其加热至28.5℃。将收集的斑马鱼受精卵立即放入1×PBS溶液中漂洗一次后，吸尽PBS溶液后加入 0.25%胰蛋白酶溶液，于28.5℃消化处理并在显微镜下实时观察脱膜情况。一般处理大约10 min后，大部分受精卵的卵膜被消化，立即将脱膜后的胚胎小心转移到新鲜的曝气水中漂洗4次以去除残留酶液。最后将胚胎放入盛有0.1×Hank’s液的培养皿中，28.5℃培养，用于注射或观察。
3、显微注射
使用日本Narishige公司的PN－30水平拉针器将毛细管拉成显微注射用针（拉针参数为heater:80，sub:50，main:56）。注射前将针尖在滤纸上轻轻划一下，形成一个断面以适合注射。用移液器将针内注满液体石蜡并将针安装显微注射仪上，排出一定体积的石蜡后将配制好的样品吸入到毛细管里，准备注射。胚胎脱膜后在1-2细胞期进行注射，注射体积设定为1.15nl/每胚胎。野生型对照组中每个胚胎注入同样体积的无菌水。
4、胚胎培养
注射完成后将胚胎转入已加抗生素的0.1×Hank’s液中于28.5℃培养，去除未受精的胚胎，每隔2-3h换液一次。
四、胚胎发育观察和作业
1、从原肠期至器官发生期，在体视镜下进行观察野生型对照组和β-catenin-2 capped mRNA注射组胚胎发育和形体模式形成的差异。
2、在受精24h后统计二者中畸形胚胎和正常胚胎的比例，并在体视镜下拍照。
3、根据野生型对照组和实验组中胚胎形体的差异分析β-catenin-2过表达对胚胎形体模式形成的影响。
五、注意事项：
1、体外合成的capped mRNA容易降解，相关的离心管、吸头等需DPEC处理去除RNA酶后方可使用。吸样前后均需将RNA置于冰盒上。
2、脱膜处理不当及容造成卵损伤。因卵膜内的压力比膜外大，脱膜不充分时移动卵子会导致细胞质从破损处强行挤出而使卵子损坏。时间过长则胰蛋白酶会对胚胎的细胞膜造成损伤。因此必须在显微镜下实时监控脱膜的过程。待大部分胚胎的卵膜基本上被溶解的时候才开始进行漂洗。漂洗时操作要轻而快，脱膜后的胚胎必需保持在水中，一旦离开水或者在水的表面都会使受精卵立即崩解。
基因表达的整胚原位杂交分析
一、实验目的：在胚胎发育过程中基因都是按严格的时空模式进行表达。本次实验以斑马鱼脊索中胚层标记基因ntl为例，进行整胚原位杂交分析其在斑马鱼胚胎原肠期的空间表达模式。
二、mRNA原位杂交的原理：RNA原位杂交是运用cDNA或寡核苷酸等探针检测细胞、组织和胚胎内目标基因mRNA表达的一种原位杂交技术，它能够将目标基因在胚胎上表达的部位直观而明确的展现出来。其基本原理是：在胚胎细胞和组织结构保持不变的条件下，用与目标基因mRNA互补并连接了地高辛等标记物的反义序列作为探针，在胚胎上与待测目标基因的mRNA结合而形成杂交体（Hybrids）；然后再用标记物的识别抗体，通过组织化学或免疫组织化学方法在形成杂交体的位置形成可在显微镜下观察到的杂交信号，从而确定目标基因的空间表达模式。
三、实验器材和材料：
1、实验器材：体视显微镜，28.5℃恒温水浴设备，恒温水浴锅，PH值测定仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备），分子杂交炉，真空泵，水平摇床等。培养皿（中号，大号各5组），胶头滴管若干，移液枪，2ml 离心管（无DNase/RNase）,锡箔纸等。
2、溶液配制：
（1）1×PBS；
（2）0.25%胰蛋白酶:准确称取0.5g胰蛋白酶，0.02g EDTA溶于200ml的1×PBS，37℃水浴充分溶解1h,4℃放置备用。使用前加热至28.5℃。
（3）1×Hanks液:称取0.4gKCl, 8.0gNaCl, 0.67g Na
2HPO
4
·7H
2
O, 0.6g KH
2
PO4,
1.44gCaCl
2, 1.23g MgSO
4
·7H
2
O, 溶于800ml蒸馏水中，充分溶解。使用前加入
0.35g NaHCO
3
，加水定容至1L，用HCl调至pH 7.2，4℃保存。用于斑马鱼胚胎培养时加热至28.5℃，并加入抗生素（10万单位/升的氨苄青霉素，5万单位/升的氯霉素）。
（4）4%PFA(wt/vol):称取20g多聚甲醛(paraformaldehyde PFA)溶于经DEPC 处理的500ml 1×PBS溶液，65℃水浴加热，持续搅拌至溶液澄清，冷却至室温，冰上过滤、分装，-20℃放置。
（5）PTW: 1×PBS,0.1%Tween-20(vol/vol)。
（6）20×SSC:购自上海生工，4℃放置备用
（7）10%CHAPS: 5g CHAPS粉末（上海生工）溶于50ml RNase-free 双蒸水中，分装，-20℃放置。
（8） 100mg/ml Heparin: 称取100mg Heparin（上海生工）溶解于1ml RNase-free 双蒸水中。
（9）10mg/ml Yeast tRNA : 称取2 mg Yeast tRNA(Roche)溶于2 ml RNase-free 双蒸水，分装，-20℃放置。
（10） 10% Tween-20（vol/vol）：5ml Tween-20中加入45ml RNase-free 双蒸水。
（11） 5M NaCl:称取146.1gNaCl（上海生工），加水定容至1L，充分溶解，灭菌后室温保存。
（12） 1M Tris-HCl：称取121.1gTris置于1L烧杯，加入800ml双蒸水搅拌溶解，用HCl调至pH9.5,定容至1L，灭菌后室温保存。
（13） 1M MgCl
2：95g MgCl
2
粉末溶于1L双蒸水中，灭菌后室温保存。
（14）杂交液（Hybridization mix, HYM）：50%去离子甲酰胺，1.3×SSC,5 mM EDTA, 0.2% Tween-20，100μg/ml Heparin, 50μg/ml Yeast tRNA。
（15） Blocking Buffer：1×PBS，2% Sheep Serum，2 mg/ml BSA，0.8% GoatSerum，0.1% Tween-20(vol/vol)。
（16） Staining Buffer：100 mM Tris-HCl(pH 9.5),50 mM MgCl
2,
100 mM NaCl,0.1% Tween-20(vol/vol)。
3、杂交用RNA探针的制备：
用位于插入片段5’端的限制性内切酶对已构建好的重组载体pB-zf ntl ORF进行单酶切，轻轻混匀后置于37℃水浴酶切4h后，取1μl点样，检测是否酶切完全，然后使用PCR纯化试剂盒(Axygen)回收线性质粒。
以线性化的重组载体为模板，采用Roche公司的体外转录试剂盒转录得到地高辛（DIG）标记的反义RNA探针。37℃水浴反应2h，加入DNase I消化质粒模板，37℃孵育15-20分钟。将上述反应体系用Roche公司的Mini Quick Spin RNA Columns进行纯化。最后将得到的ntl探针进行电泳检测，加入等体积的去离子甲酰胺，测定浓度，-80℃保存。
四、实验步骤：
1.斑马鱼胚胎的获得：参照实验六
2.斑马鱼胚胎受精膜的去除：斑马鱼卵子受精后几分钟，受精卵外围会举起一
层受精膜保护胚胎，受精膜的存在不影响观察胚胎发育和模式形成，但不利于显微注射及其它后续实验，所以部分胚胎可以先利用胰蛋白酶脱膜。
在开始光照刺激产卵前1小时前，将4℃中的0.1x Hank’s液，0.25%的胰蛋白酶以及1xPBS溶液取出，将其加热至28.5℃。将收集的斑马鱼受精卵立即放入1×PBS溶液中漂洗一次后，吸尽PBS溶液后加入 0.25%胰蛋白酶溶液，于28.5℃消化处理并在显微镜下实时观察脱膜情况。一般处理大约10 min后，大部分受精卵的卵膜被消化，立即将脱膜后的胚胎小心转移到新鲜的曝气水中漂洗4次以去除残留酶液。最后将胚胎放入盛有0.1×Hank’s液的培养皿中，28.5℃培养，用于注射或观察。
3.胚胎材料的收集：
体视镜下观察斑马鱼胚胎发育情况，发育时期的确定参照Kimmel[1]的划分标准，取原肠中晚期（70-90%下包）胚胎进行实验。用大口径吸管选取30颗左右的胚胎置于装有4%PFA的EP管中，4℃固定过夜。
4.斑马鱼胚胎整胚原位杂交
整胚原位杂交按照Thiss的方法[2]进行。具体步骤包括胚胎固定和预处理、复水和杂交、洗脱和孵育抗体以及显色等。
（1）胚胎的预处理
(a) PFA固定后的胚胎，用PTW溶液漂洗2次，5min/次。
(b) 脱水。使胚胎依次经过25%，50%，75%，100%的甲醇/PTW溶液，5min/次。然后100%甲醇洗3次，10min/次。
(c) 将胚胎置于新鲜的100%甲醇，-20℃保存。可放置数个月。
(2) 复水和杂交（以下溶液若无确切说明，每次用量为1ml）
(a)复水，即将100%甲醇依次置换成75%，50%，25%的甲醇/PTW溶液，5min/次，然后用PTW溶液洗2次，5min/次,室温进行。
（b）用10μg/ml的蛋白酶K/PTW对胚胎进行消化。处理的时间依胚胎发育时期而异，但体节期之前的胚胎一般不进行消化处理。
(c) 4%PFA再固定，室温30min以上。
(d) 用PTW洗3次，5min/次，然后将胚胎转移至一个装有新鲜的PTW溶液的2ml 离心管中。
(e) 用400μl PTW/HYM（1：1）混合液洗涤胚胎，使之沉在管底。然后再用400μl 100%杂交液洗一次。
(f) 将胚胎转移至含有400μl新鲜杂交液的EP管中，65-70℃预杂交1-4 h。
(g) 吸出预杂交的HYM（可回收），加入已经预热并含有终浓度为0.1-1 μg/ml RNA探针的杂交液，分子杂交炉中65℃杂交过夜。
(3) 洗脱并孵育抗体
准备70℃水浴、干浴，将杂交炉设置为70℃。（以下溶液每次用量为1ml）
(a) 吸出含有探针的杂交液后，用新鲜的杂交液快速洗涤胚胎一次。
(b) 依次将溶液置换成66% HYM/33% 2×SSC，33% HYM/66% 2×SSC， 2×SSC 溶液，70℃，放置15 分钟
(c) 置换成0.2×SSC溶液，70℃，放置30 分钟
(d) 置换成0.1×SSC溶液，70℃，放置30 分钟
(e) 置换成66% 0.05×SSC/33%PTW，室温，放置10 min。
(f) 置换成33% 0.05×SSC/66%PTW，室温，放置10 min。
(g) 室温用PTW润洗胚胎2次，每次5分钟
(h) 将胚胎置于Blocking Buffer中，于室温孵育胚胎3小时以上。
(i) 按1：5000的比例在blocking buffer中加入地高辛抗体，4℃冰箱过夜。
(4) 洗脱、显色（以下溶液每次用量为1ml）
(a) 室温，用PTW洗脱6次，15 min/次。
(b) 将胚胎转移至新的2 ml EP管中，用Staining Buffer漂洗2次，5 min/次。
(c) 按1 ml Staining Buffer加入20μl NBT/BCIP（Roche）的比例配制染色液。将胚胎转移至染色液中。
(e) 锡箔纸包住EP管，每隔10分钟在体式显微镜下观察胚胎显色情况。
(f) 待显色完成，吸去染色液，用PTW漂洗2次。
(g) 4% PFA室温固定30 min。
(h) 吸去PFA，用PTW漂洗2次。
(i) 将胚胎依次转移至50%,100%甲醇/PTW混合液，脱去背景颜色。
(j) 置换成PTW润洗两次，4℃保存或立即拍照。
五、作业：
根据原位杂交结果，分析在胚胎发育过程中ntl表达的时空模式和预定中胚层细胞在鱼类胚胎上的位置。
六、注意事项：
1、PFA具有强烈刺激味，最好在通风橱操作。
2、RNA探针合成、胚胎的固定和预处理、复水和杂交等过程中所有的实验耗材、试剂均需用DEPC处理。
3、用蛋白酶K处理可以增加细胞的通透性，探针及抗体分子更容易进入细胞。但是消化时间需严格控制，时间过长会引起胚胎形态的损伤。在本实验中，由于ntl基因的表达丰度较高，蛋白酶K消化与否不影响实验结果。
4、杂交液中的RNA探针的浓度范围为0.1-1 μg/ml，并根据所检测基因表达丰度的差异进行调节，探针浓度过高将导致背景色加深。
5、75℃洗脱过程需谨慎操作，避免对胚胎形态的损伤。
6、由于ntl的表达丰度相对较高，注意控制显色时间，显色过久过造成背景加深。
参考文献：
1. Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 1995; 203:253-310.
2. Thisse C, Thisse B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc 2008; 3:59-69.
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育 一、实验目的 了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。 二、斑马鱼的生活和繁殖习性 斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。 斑马鱼具有下列特点： 1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。 2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。 3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。 4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。 5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。 6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本 结构。 因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。 三、实验器材和材料 斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。曝气水10L。性成熟雌、雄性斑马鱼。 四、实验内容和程序 实验前一天的准备： 1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
生理学实验--斑马鱼视动反应讲义
斑马鱼视动眼动反应 实验目的： 观察视觉行为学的表现 掌握评判视觉功能的行为学手段 实验原理： 行为学虽是一门古老的学科，但至今仍是神经生理研究中不可或缺(indispensable)的一个活跃领域。经典行为学实验一般不依赖或很少需要精密的测量仪器，而是靠我们去观察和思考。眼动(optokinetic response, OKR)和视动(optomotor response, OMR)反应均是视觉刺激诱发的运动行为。脊椎动物从低等的鱼、蛙到高等的灵长类和人都有此行为反应。此现象无需学习训练就易诱导、较稳定、易观察，所以作为一种客观指标广泛运用于视觉功能的检测和评价。 脊椎动物为了获得对运动图像刺激在视网膜上稳定清晰的成像，通过视觉通路和相应的运动神经参与做出生理性行为的适应调整从而能够对视觉刺激做出良好反应，这些表现涉及视动、眼动或视动性头震颤(Optokinetic head nystagmus, OKHN)。如果行为学的表现不正常，可以推测它们的固有神经连接出现异常。斑马鱼具有脊椎动物类似的视觉通路，经典的视觉行为学有眼动反应和视动反应。 眼动(光动)反应：斑马鱼在光适应一段时间后会对移动的光栅进行注视，试图确保移动视觉图像能稳定地高分辨地呈现在视网膜上。如果光栅是在一个围绕幼鱼的圆筒上移动时(图1)，斑马鱼的眼睛就会一直追随光栅直到其眼睛不能再转动，然后有一个急速的眼颤动(ocular nystagmus)以回复到最初水平。之后又进行下一个追随反应，如此循环。周围视觉环境周期性运动时引起的有规律的眼或头追踪运动(慢相运动)即为眼动反应或视动性头震颤。五天龄(5dpf) 的幼鱼视觉系统就已非常成熟(viewed in Bilotta, 2001)，适合行为学检测。该行为学指标常用于筛选与视功能相关的不同遗传背景或操作的幼鱼。 视动反应：视动反应是指斑马鱼对移动的目标有一种追逐的行为。当将成年斑马鱼放在一个圆形光栅的内部时，斑马鱼对光栅的追随行为会表现为一种圆周性运动(图2)。 图1 眼动反应装置图2 成鱼视动反应装置
分子生物学实验技术斑马鱼胚胎显微注射实验步骤
斑马鱼胚胎显微注射实验步骤： 显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。斑马鱼个体小，养殖成本低，能大规模繁殖，胚胎透明，体外发育，肉眼可见，因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。 1、主要试剂的配制 （1）胚胎培养液的配制 称取0.8g NaCl、0.04g KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4?7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L。（2）显微注射指示剂的配制 称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中，配制成2％的母液。先用1mm滤膜过滤后，再用0.22mm的滤膜再次过滤，然后储存在-20℃冰箱里备用。 2、显微注射操作 （1）注射针头的拉制：装上一根直径为1mm的毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定参数为：Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。 （2）琼脂糖注射槽的制作：称取0.4g琼脂糖，溶于30ml胚胎培养液中，在微波炉中加热溶解后，先倒入约10ml琼脂糖溶液到6cm的玻璃培养皿中，然后将注射槽模型轻轻放置于胶面上，再倒入约20ml。琼脂糖凝固后，取出注射
实验室斑马鱼的繁育与养殖技术
实验室斑马鱼的繁育与养殖技术 确定文章类型本文属于科普类文章，旨在介绍实验室斑马鱼的繁育与养殖技术，帮助读者了解如何进行实验室斑马鱼的养殖。 搜索关键词在撰写文章之前，我们需要先搜索相关的关键词，例如实验室斑马鱼、繁育、养殖技术等。这些关键词将有助于我们更好地了解实验室斑马鱼的繁育与养殖技术。 引言在引言中，我们将简单介绍实验室斑马鱼的背景和重要性，包括其在科学研究和教学中的作用。 正文（1）实验室斑马鱼的繁育方式我们将详细介绍实验室斑马鱼的繁育方式，包括亲鱼培育、成鱼养殖等不同的部分。在亲鱼培育中，我们需要选择健康的亲鱼并进行特殊的养殖，以促进其繁殖。而成鱼养殖则需要控制养殖密度、水质等因素。（2）实验室斑马鱼的养殖环境要求我们将详细介绍实验室斑马鱼的养殖环境要求，包括水温、水质等因素。这些因素对斑马鱼的生长和繁殖都非常重要，需要我们进行合理的控制。（3）实验室斑马鱼的饲料选择和管理措施饲料选择和管理措施也是实验室斑马鱼养殖中的重要环节。我们将介绍不同种类的饲料以及如何合理地选择和管理饲料，以确保斑马鱼的健康生长和繁殖。
结论在结论中，我们将总结实验室斑马鱼的繁育与养殖技术的重要性和实用价值，并强调这些技术对于科学研究和教学的意义。 逐步展开细节在编写大纲时，我们需要将每个部分的内容进行细化和拆分，例如在繁育方式中，可以分为亲鱼培育、成鱼养殖等不同的部分。这样可以有助于读者更好地理解和掌握。 在亲鱼培育方面，我们需要选择健康的亲鱼以及特殊的养殖方式，促进其繁殖。可以介绍一下亲鱼的选择标准、如何进行配对以及如何促进产卵和受精等知识。 而成鱼养殖则需要控制养殖密度、水质等因素。可以介绍一下如何设计合理的养殖密度、如何保持水质清洁以及如何进行饲料的投喂等具体措施。 对于实验室斑马鱼的养殖环境要求，可以深入探讨水温、水质等因素对斑马鱼生长和繁殖的影响，并介绍如何进行这些因素的调节和控制。在饲料选择和管理措施方面，可以介绍不同种类的饲料以及如何根据斑马鱼的生长阶段和需求进行合理的选择，同时可以分享一些有效的管理措施，如饲料的投喂量和投喂频率的控制等。 注意语言规范文章的语言要规范，尽量使用通俗易懂的语言，避免使
斑马鱼代谢组学操作步骤
斑马鱼代谢组学操作步骤 简介 代谢组学是研究生物体内代谢产物的全套分析方法，通过对代谢物的检测和定量，可以得到生物体代谢状态的信息。斑马鱼作为一种常用的实验动物模型，具有较高的遗传相似性和生理相似性，因此在代谢组学研究中被广泛应用。本文将介绍斑马鱼代谢组学研究的操作步骤。 采集样本 代谢组学需要对斑马鱼进行样本采集，以获得代谢物的信息。一般来说，可以采集不同组织的样本，如肝脏、肌肉、鳃组织等。样本的采集需要遵循动物实验伦理和规范操作的原则。 步骤 1.准备实验动物：选择健康的斑马鱼作为实验对象。 2.麻醉：使用合适的麻醉剂将斑马鱼麻醉，使其处于无痛苦的状态。常用的麻 醉剂包括MS222等。 3.选择采样部位：根据研究的需要，选择合适的部位进行采样。常见的部位有 肝脏、肌肉和鳃组织。 4.采集样本：用无菌手术器械进行样本采集，避免污染。 5.存储样本：采集后，将样本存储到适当的容器中，并冷冻保存，避免样本代 谢物的降解。 样品制备 样品制备是代谢组学研究中重要的环节，质量好的样品可以获得准确可靠的结果。样品制备的主要目的是提取和纯化代谢物，以便后续的检测和分析。 步骤 1.样品破碎：将采集到的样本进行破碎，以释放细胞内代谢产物。可以使用机 械方法（如研钵、超声波破碎器）或化学方法（如溶解）进行破碎。
2.提取代谢物：使用适当的提取溶剂提取代谢物。常用的提取溶剂包括甲醇、 乙酸乙酯等。提取溶剂的选择应根据代谢物的特性进行。 3.过滤和干燥：将提取的溶液通过滤膜进行过滤，去除固体颗粒。然后使用旋 转蒸发仪或氮气吹扫干燥，得到干燥的样品。 4.重溶解：将干燥的样品用适当的溶剂重溶解，以获得适宜浓度的样品溶液， 便于后续的检测和分析。 代谢物检测和分析 代谢物的检测和分析是代谢组学研究中最关键的环节，不同的检测方法可以获得不同的代谢物信息。常用的代谢物检测方法包括质谱分析、核磁共振等。 质谱分析 质谱分析是代谢组学中最常用的检测方法之一，可以同时测定多种代谢物。质谱分析主要包括质谱仪的选择、样品的准备和分析方法的建立。 质谱仪的选择 根据研究的需要和实验室的条件，选择适当的质谱仪进行分析。常用的质谱仪有气相色谱质谱联用（GC-MS）、液相色谱质谱联用（LC-MS）等。 样品准备 样品准备是质谱分析中重要的步骤，可以影响到分析结果的准确性和稳定性。样品的准备包括样品前处理和样品制备。 分析方法的建立 根据研究的目标和实验的要求，建立合适的分析方法。分析方法的建立包括质谱条件的设置、质谱图谱的分析和代谢物的定量方法的建立。 核磁共振 核磁共振是一种无损检测技术，可以测定代谢物的结构和数量。核磁共振主要包括样品准备、核磁共振仪的选择和方法的建立。
利用h2cfda在斑马鱼中检测抗氧化功能的原理和过程
利用h2cfda在斑马鱼中检测抗氧化功能的原理和过程斑马鱼是一种广泛用于生物医学研究的模型动物，其具有生命周期短、繁殖力强、基因表达模式与人类相似等优点。近年来，斑马鱼在抗氧化功能研究方面得到了广泛关注。抗氧化功能是指生物体内清除自由基、减轻氧化应激的能力，对于维持生物体正常生理功能和防止疾病发生具有重要意义。本文将介绍利用h2cfda在斑马鱼中检测抗氧化功能的原理和过程。 一、原理 H2CFDA是一种荧光探针，可以用于检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。活性氧是一类具有高度反应性的化学物质，包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基等。活性氧在生物体内具有双重作用，一方面参与细胞信号传导、免疫应答等生理过程，另一方面过量的活性氧会导致氧化应激，损伤细胞膜、蛋白质、核酸等生物大分子，从而引发多种疾病。 H2CFDA在无活性氧条件下呈无荧光状态，当细胞内活性氧浓度增加时，H2CFDA会被氧化生成荧光产物DCF（2',7'-dichlorofluorescein），产生绿色荧光。因此，通过检测H2CFDA 在斑马鱼体内的荧光强度，可以间接反映斑马鱼抗氧化功能的强弱。 二、过程
1. 实验材料准备：斑马鱼种群、H2CFDA荧光探针、培养基、显微镜等。 2. 斑马鱼处理：将斑马鱼种群按照实验要求分为对照组和实验组，对照组给予正常培养基，实验组给予含有特定诱导剂的培养基，以诱导氧化应激。实验组和对照组的处理时间可以根据实验需要进行调整。 3. H2CFDA处理：将斑马鱼收集到一定数量后，用PBS清洗去除培养基残留物，然后用H2CFDA荧光探针进行处理。处理时间和浓度可以根据实验需要进行调整。 4. 荧光检测：将处理后的斑马鱼放入显微镜下观察，使用荧光通道进行拍摄。可以选择不同时间段进行拍摄，以观察抗氧化功能的变化过程。同时，可以通过统计荧光强度值，对抗氧化功能进行定量分析。 5. 数据分析：将实验结果进行统计分析，比较对照组和实验组之间的差异，评价抗氧化功能的变化。此外，还可以通过其他生物学方法（如基因表达谱分析、蛋白质组学等）对抗氧化功能进行进一步研究。 三、应用 利用h2cfda在斑马鱼中检测抗氧化功能的方法已经在多种研究领域得到应用，例如：
斑马鱼心脏发育实验报告
斑马鱼心脏发育实验报告 斑马鱼是一种广泛应用于生物学研究的模式生物，其胚胎透明、发育快速且易于观察，被广泛用于研究心脏发育等领域。本次实验旨在观察斑马鱼胚胎中心脏的发育过程，探究心脏在胚胎发育中的重要作用。实验过程如下： 1. 实验材料及方法 我们使用了正常发育的斑马鱼胚胎作为实验材料。斑马鱼胚胎在孵化后的24小时内，其心脏就会开始发育。我们选取了不同孵化时间的斑马鱼胚胎，采用显微镜观察其心脏的形态和细胞结构变化。 2. 实验结果 在实验中，我们观察到斑马鱼胚胎的心脏在孵化后不同时间有着明显的发育变化。在孵化后12小时，斑马鱼的心脏仅为一个简单的心管结构；而在孵化后24小时，心脏已经分化为心房和心室，并且开始跳动。在孵化后48小时，心脏进一步发育，心房和心室之间的血液流动顺畅，心跳规律且强有力。 3. 实验分析 通过观察斑马鱼胚胎心脏的发育过程，我们可以清晰地看到心脏从简单的管状结构发育为完整的器官的过程。这一过程包括心脏细胞的增殖、分化和功能的建立。斑马鱼胚胎的透明度使得我们可以直观地观察到这一过程，为研究心脏发育机制提供了重要的实验素材。
4. 实验结论 通过本次实验，我们进一步认识到了斑马鱼这一模式生物在心脏发育研究中的重要性。斑马鱼胚胎的快速发育和透明性使得我们可以深入观察心脏发育的细节过程，为解析心脏发育的分子机制提供了重要线索。希望本次实验结果能够对相关疾病的治疗和预防研究提供一定的借鉴和启发。 5. 参考文献 [1] Staudt D, Stainier D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish[J]. Annual Review of Genetics, 2012, 46: 397-418. [2] Bakkers J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease[J]. Cardiovascular Research, 2011, 91(2): 279-288. 以上是本次斑马鱼心脏发育实验的报告，感谢各位的关注和支持。
保健食品功能评价 斑马鱼试验规程
保健食品功能评价斑马鱼试验规程 保健食品功能评价是保障消费者健康的重要环节，而斑马鱼试验作为一种生物评估方法，在保健食品功能评价中具有重要作用。本规程将介绍斑马鱼试验的基本原理、试验步骤和结果分析，以确保保健食品功能评价的准确性和可靠性。 一、试验原理 斑马鱼是一种小型淡水鱼，具有生长迅速、繁殖能力强、胚胎透明等优点。斑马鱼与人类基因组有60%以上的同源性，因此其胚胎和成鱼组织可作为人类保健食品功能评价的生物模型。通过观察斑马鱼在给定条件下对保健食品的反应，可以评估其功能和安全性。 二、试验步骤 试验材料准备 （1）斑马鱼胚胎：选择健康成熟的斑马鱼，在繁殖季节进行自然交配，收集受精卵。 （2）保健食品样品：根据待评价保健食品的特性和用途，选择合适剂型和用量的保健食品样品。 （3）试验溶液：将保健食品样品配制成试验所需的溶液，分别用于处理不同组别的斑马鱼胚胎。 试验设计
（1）对照组：将未接触保健食品样品的斑马鱼胚胎在正常条件下培养至成鱼。 （2）试验组：将不同浓度的保健食品溶液分别接触斑马鱼胚胎，观察其生长发育过程中的变化。 试验过程 （1）胚胎期：将斑马鱼胚胎分别放置在不同浓度的保健食品溶液中，在适宜的温度和光照条件下培养至成鱼。 （2）成长期：观察斑马鱼在生长过程中的形态、行为和生理指标，记录数据。 （3）数据分析：通过对试验数据的统计分析，评估保健食品样品的功能和安全性。 三、结果分析 生存率：比较各组斑马鱼胚胎的生存率，若保健食品样品对生存率有明显影响，则可认为其具有潜在的毒性作用。 生长发育：观察各组斑马鱼胚胎的生长发育情况，包括体长、体重、器官发育等指标。若保健食品样品能够促进斑马鱼的生长发育，则可认为其具有增强生长活力的功能。 行为表现：记录各组斑马鱼的行为表现，如游动速度、活动量等。若保健食品样品能够改善斑马鱼的行为表现，则可认为其具有增强活动能力的功能。
斑马鱼代谢组学操作步骤
斑马鱼代谢组学操作步骤 斑马鱼代谢组学操作步骤 概述 代谢组学是一种高通量技术，用于研究生物体内的小分子代谢产物。斑马鱼是一种常用的模式生物，在研究人类疾病和药物筛选方面具有重要意义。本文将介绍斑马鱼代谢组学的操作步骤。 实验前准备 1. 斑马鱼培养：选择健康、年龄相近的斑马鱼，进行标准化培养。 2. 样品采集：收集需要检测的样品，如整体或部位组织、血清、尿液等。 3. 样品处理：对样品进行预处理，如去除脂肪、蛋白质等干扰物质。 4. 质控：设置质控样品，保证实验结果可靠性。 实验步骤 1. 代谢产物提取：将样品加入甲醇/氯仿混合液中，震荡离心后离心上清液收集并挥干溶剂。 2. 衍生化反应：将挥干后的样品加入含N-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）和二甲基氨基丙酸（DMAPA）的反应体系中，进行衍生化反应。
3. 质量谱分析：使用质谱仪进行代谢产物的定性和定量分析。常用的 质谱仪包括气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）等。 数据处理 1. 数据预处理：对原始数据进行去噪、校正、归一化等预处理。 2. 特征选择：根据统计学方法和生物学知识选择代谢产物特征。 3. 数据分析：使用多变量统计学方法对数据进行分析，如主成分分析、偏最小二乘回归等。 4. 生物信息学分析：将代谢产物与生物通路和代谢网络相关联，探索 其生物学意义。 实验注意事项 1. 样品采集应避免受到污染或氧化损伤。 2. 样品处理过程中应注意避免蛋白质和脂肪等干扰物质的影响。 3. 实验过程中要设置空白样品和质控样品，保证实验结果的准确性和 可靠性。 4. 数据处理时要注意选择合适的统计学方法和参数，避免误差和偏差 的影响。 结论 斑马鱼代谢组学技术是一种有效的研究生物代谢产物的方法，可以为 人类疾病和药物筛选等领域提供重要参考。在实验过程中，需要注意
斑马鱼胚胎的显微注射
斑马鱼胚胎的显微注射 实验四斑马鱼胚胎的显微注射 08生物科技刘佳 一、实验目的 1.练习针刺细胞（未受精卵、去核卵、早期胚胎细胞或体外培养细胞）； 2.实践微量 移液管准备； 3、掌握细胞显微移植技术（细胞核、外源基因）； 4、了解显微注射的应用及注意事项。 二、实验设备和材料 斑马鱼胚胎、酚红、显微镜；显微操作仪；拉针仪 三、实验原理和步骤 显微注射（microinjection）技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基 因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植 技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它 是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体dna片段的外源 基因进行转移；外源基因的长度不受限制,可达100kb；实验周期相对比较短。 注射过程：1。注射针中的液体：使用无菌微量取样器从微量注射针背面添加一滴要 注射的酚红。2.注射针的安装和定位：（1）将充液针的自由端安装在连接器上，然后拧 紧连接器以固定注射针，然后将其固定在微操作器的针管上；（2）将含有待注射样品的 培养皿放在显微镜台上，用低倍物镜聚焦细胞；（3）移动针头并在显微镜下调整微操作器，直到针头的阴影高于视野中心；（4）使用工作放大镜调整单元的焦距并找到针尖。3.微量注射：（1）将针尖与待注射细胞的部分对齐（细胞和针尖位于同一焦平面上）， 旋转旋钮和针头进入细胞（卵膜、细胞膜和核膜）；（2）旋转取样旋钮以添加样品并离 开试管。 四、实验结果观察 注射前、注射中和注射后 五、注意事项 在实验过程中，针头应锋利且易于折断胚胎。断针应放在有海平面或泡沫的盘子中， 以防止针滑动和断裂。在整个过程中，注射针尖应远离实验室的人员和仪器。当注射针未 牢固安装在针座上时，注射器、管和注射针中的压力可能会注射注射针。反向加注液体时，
分子生物学实验技术斑马鱼胚胎蛋白WB方案
斑马鱼胚胎蛋白定量实验方案 ㈠使用液的配置： 1.蛋白提取液（Lysis buffer）：0.6ml 1M Tris HCl PH 6.8 1.0ml 50% Glycerol（甘油） 2.0ml 10% SDS 6.4ml H2O 10 ml Lysis buffer -20℃分装保存备用 备注：Lysis buffer使用前需加入1：100的100mM PMSF。 2.上样缓冲液（1XSample buffer）：50mM Tris-HCl pH 6.8 2% SDS 10% Glycerol（甘油） 0.02% Bromophenol blue（溴酚蓝） 0.7% 2-mercaptoethanol（2-巯基乙醇） 3.电泳缓冲液（Running buffer）： 3.0g Tris-base 14.4g Glycine（氨基乙酸） 10ml 10%SDS 加双蒸水至1000ml 4.转移缓冲液（Transfer buffer）： 3.0g Tris-base 14.4g Glycine（氨基乙酸） 200ml Methanol（甲醇） 加双蒸水至1000ml 5.封闭液(Blocking solution)：称5g脱脂奶粉溶于100ml TBST中。 6.洗涤液（TBST buffer）：20mM Tris-HCl pH 7.4 0.15M NaCl 1-5 ml 0.5% TWEEN-20 加双蒸水至1000ml ㈡斑马鱼胚胎蛋白的提取： 1. 取100枚胚胎放入1.5ml EP管中，用灭菌水清洗2次，加入200μl Lysis buffer（预加1% PMSF），匀浆器匀浆，再加入300μl Lysis buffer，votex 1min；将处理后的样品放入沸水中煮8 min，12000g离心5 min，取上清，蛋白样品即位于上清中；提好后的蛋白需立即置于冰上，可以长时期存放于-80℃。（胚胎可以先冻存于-80℃，以后再提取蛋白，若胚胎数量少，而目的蛋白也少，则可以减少Lysis buffer的加入量。） 2. BCA法测定蛋白含量。见BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）说明书。 ㈢Western blotting定量分析蛋白： 1.SDS-PAGE电泳： ⑴清洗玻璃板：用洗洁精清洗，再用纯净水冲洗干净，晾干。 ⑵灌胶与上样： ①. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上。（两侧的玻璃一定要对齐，否则漏胶。） ②. 制备分离胶(pH 8.8): a.凝胶浓度的选择要依据蛋白分子量的大小而定，详细的方案见说明书； b.按说明书配置凝胶液；
斑马鱼原位杂交试验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术 Form Dr. Kevin 第一节原位杂交技术的历史 Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（力situ hybridization，ISH）。自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。 Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年，Nusslein-Volhard等将Cox 建立的RNA原位杂交技术进行了改进，用地高辛（digoxin）标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表达。2008年，Bernard Thisse等将该技术进一步优化，使之更敏感，也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 - 69）。 第二节原位杂交技术的原理 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 整胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization）不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位。整胚原位杂交指在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核昔酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体（Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。该技术不仅可以用于检测基因的时空表达，为研究该基因功能以及基因分类提供线索，还可以应用于高通量药物筛选或突变体筛选中，以特异表达的基因标记作为筛选的重要依据。（图5.1）