斑马鱼相关实验操作
实验斑马鱼的急性毒性实验
数据记录
实验结果与数据分析
03
斑马鱼行为异常
斑马鱼死亡数量增加
组织病理学变化
实验结果
采用剂量-反应曲线拟合程序，计算斑马鱼对药物的半数抑制浓度（IC50值）。
数据分析方法
IC50值计算
应用方差分析、卡方检验等方法，比较不同浓度药物处理组与对照组之间的差异。
统计检验
对多变量数据进行降维分析，找出影响实验结果的主要因素。
xx年xx月xx日
实验斑马鱼的急性毒性实验
目录
contents
实验目的和原理实验材料与方法实验结果与数据分析结论与讨论参考文献与资料引用
实验目的和原理
01
评估受试化合物对斑马鱼生物的毒性影响
了解斑马鱼生物对受试化合物的敏感程度
分析受试化合物对斑马鱼生物的致毒机制
实验目的
实验原理
斑马鱼作为实验生物，具有繁殖能力强、生命周期短、易于观察等特点，适合进行急性毒性实验
主成分分析
数据分析结果
要点三
IC50值明显小于预期
实验结果显示，斑马鱼对药物的敏感性较强，IC50值明显小于预期。
要点一
要点二
差异具有统计学意义
在较高浓度药物处理组，斑马鱼死亡率、行为异常率和组织损伤率均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。
主成分分析结果
主成分分析表明，药物对斑马鱼行为和组织病理学的影响最为显著，其次是死亡率。
准备实验所需试剂和斑马鱼生物
设计不同浓度的受试化合物溶液
实验材料与方法
02
斑马鱼
选取健康、同一批次、具有相似生长状况的斑马鱼。
供试化学品
选择具有不同化学结构和性质的不同浓度的化学品。
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。
固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。
实验步骤：1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。
固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。
可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。
使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。
2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。
丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。
4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。
6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。
7. 用封闭液清洗胚胎2次。
8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。
加入合适浓度的一抗。
一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。
9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。
根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。
10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。
11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。
12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。
13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。
14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。
斑马鱼的繁殖与胚胎观察
斑马鱼的繁殖与胚胎观察一、实验目的学会根据实验目的查阅相关文献和资料，独立设计实验方案并完成实验操作、数据记录和结果总结全过程。
二、实验原理斑马鱼为小型热带鱼，成鱼体长4公分左右，鱼体分布有头尾方向的蓝色条纹。
斑马鱼的饲养对水质要求不高，孵出后约3天达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。
卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。
发育温度要求在25-31℃之间。
斑马鱼的繁殖周期约7天左右，受精卵经2-3天可孵出仔鱼，一年可连续繁殖6-7次，而且产卵量高。
三、实验内容1、斑马鱼的人工繁殖观察2、斑马鱼胚胎发育观察四、器材材料饲养箱鱼箱恒温培养箱电子显微镜饲料细网五、实验步骤1、亲鱼的选取与喂养从水产基地里挑选15到20尾亲鱼，并根据皮肤、外形等使选出的雌雄比例接近1.5:1，并分开放入饲养箱中，饲喂3～4天。
饲喂饲料为活性饲料与配合饲料结合，每天饲喂2～3次。
2 、亲鱼的受精与孵化4天后，将所选出的雌雄亲鱼一并放入同一鱼箱中，控制水温25～28℃。
为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔2～3mm的网将亲鱼限制在产卵池的上半部活动。
将受精结束后获得的受精卵捞出，剔除异物，将眼观有白色小斑点、畸形异常卵去除。
然后将受精卵移入培养箱中进行孵化，温度为25～28℃，温差不能够超过0.5℃。
3、胚胎发育的观察斑马鱼的胚胎发育分为7个阶段：合子期、分裂期、囊胚期、原肠胚期、体节期、咽囊期、孵化期。
合子期：合子是一个包括卵黄和细胞质的半透明混合物，在动物极存在一个小的清晰的细胞质断层，即细胞泡的残余。
卵裂期:该时期的特点是细胞分裂间期短；细胞变小；不等裂。
斑马鱼的受精卵为端黄卵，卵裂局限于胚盘部分，为不完全卵裂。
斑马鱼受精后40分左右卵裂开始，平均约每隔15分卵裂一次。
囊胚期：从第八次卵裂开始，就进入囊胚期，与其他真骨鱼不同的是，斑马鱼的囊胚期不形成囊胚期腔，只在胚盘的下层细胞的一些小的细胞形成一些细胞外间隙；同时细胞分裂周期开始延长，标志着中胚囊转换开始。
实验斑马鱼的急性毒性实验
实验斑马鱼的急性毒性实验xx年xx月xx日•实验准备•实验方法•实验结果•实验结论目录01实验准备1实验设备23用于养殖斑马鱼的实验器皿，应选择适合斑马鱼体型大小的器皿。
实验室器皿为了保持实验环境中的温度稳定，需要使用恒温设备，如恒温水浴或恒温箱。
恒温设备显微镜或放大镜等观察设备，用于观察斑马鱼的生长状况和行为变化。
观察设备选择健康、无损伤的斑马鱼鱼种，年龄和体重均应符合实验要求。
实验鱼种使用清洁、无污染的养殖用水，并经过充分曝气和过滤，以保证水质良好。
养殖用水实验动物受试物质对照物质饲料和水质改良剂用于比较实验结果的空白对照或标准对照。
用于维持斑马鱼生命活动的必要物质。
03实验材料02 01待测试的化学物质或药物。
02实验方法评估目标化合物对斑马鱼的急性毒性作用，了解其安全浓度范围。
实验设计实验目的健康成年斑马鱼，体重相近，年龄相同。
实验动物设置多个浓度组，如0（对照组）、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L等。
实验分组实验过程准备实验所需器材和试剂，设置不同浓度的目标化合物。
实验准备受试动物观察指标实验时间将斑马鱼暴露在不同浓度的目标化合物中。
观察并记录每组斑马鱼的死亡率、行为变化、呼吸频率等指标。
设定实验时间为24小时，根据需要可适当延长。
整理实验数据，包括各浓度组死亡数、行为变化等指标。
数据整理计算半数致死浓度（LC50）等毒性指标，评估目标化合物的毒性作用。
数据分析绘制浓度-效应曲线，直观展示化合物对斑马鱼的毒性作用。
结果呈现数据分析03实验结果实验数据记录•实验日期：2023年3月1日•实验地点：实验室1号水族箱•实验温度：25±1℃•实验时间：24小时•实验动物：成年斑马鱼（50±5g）•实验溶液浓度：0（对照组），0.1，0.5，1.0，2.0mg/L •实验记录员：张三数据分析结果•死亡率统计•对照组：0%•0.1mg/L组：10%•0.5mg/L组：30%• 1.0mg/L组：60%• 2.0mg/L组：100%•中毒症状观察•对照组：无异常•0.1mg/L组：鱼体活动稍显迟缓，呼吸频率增加•0.5mg/L组：鱼体活动明显迟缓，呼吸急促，部分鱼体出现失衡• 1.0mg/L组：鱼体活动严重受限，呼吸急促，部分鱼体出现侧翻和抽搐现象• 2.0mg/L组：鱼体全部死亡，未观察到呼吸和活动现象//example/file/acute_toxicity_table.xlsx)（请点击链接查看）[急性毒性实验结果统计表.xlsx](https//example/file/acute_toxicity_chart.png)（请点击链接查看）[急性毒性实验结果柱状图.png](https 结果图表展示04实验结论实验目的本实验旨在研究不同浓度梯度的重金属对斑马鱼急性毒性的影响，以评估重金属的毒性作用和安全阈值。
斑马鱼胚胎整体原位免疫荧光实验
斑马鱼胚胎整体原位免疫荧光实验第一天：
固定：收集斑马鱼胚胎于解剖显微镜下去除绒毛膜，加入4％多聚甲醛（溶于无RNA酶的PBS），4℃固定8h。
然后加入更换新鲜纯甲醇后于－20℃长期保存。
第二天：
洗涤和通透：在室温下，以25％PBST/75％甲醇、50％PBST/50％甲醇、75％PBST/25％甲醇逐级复水，每步3 min，100％PBST洗涤三次，各5 min。
用H2O洗涤1次，5 min
用丙酮通透胚胎1次，7 min（-200C）
用H2O洗涤1次，5 min
用PBST洗涤1次， 5 min
封闭：加入适量封闭液，于室温下放置1.5 h以上。
抗体孵育：更换新鲜封闭液，加入一抗（10μg/ml），置于4℃过夜。
第三天：
清洗：用洗涤液（1% BSA，1% DMSO的PBST溶液）清洗抗体8次，前7次每次15min，第8次2h。
封闭：加入适量封闭液，于室温下放置1.5 h。
抗体孵育：更换新鲜封闭液，加入二抗，置于4℃过夜。
第四天：
清洗：用洗涤液（1% BSA，1% DMSO的PBST溶液）清洗抗体8次，每次15min。
用PBST溶液洗涤胚胎2次，每次5min。
斑马鱼代谢组学操作步骤
斑马鱼代谢组学操作步骤简介代谢组学是研究生物体内代谢产物的全套分析方法，通过对代谢物的检测和定量，可以得到生物体代谢状态的信息。
斑马鱼作为一种常用的实验动物模型，具有较高的遗传相似性和生理相似性，因此在代谢组学研究中被广泛应用。
本文将介绍斑马鱼代谢组学研究的操作步骤。
采集样本代谢组学需要对斑马鱼进行样本采集，以获得代谢物的信息。
一般来说，可以采集不同组织的样本，如肝脏、肌肉、鳃组织等。
样本的采集需要遵循动物实验伦理和规范操作的原则。
步骤1.准备实验动物：选择健康的斑马鱼作为实验对象。
2.麻醉：使用合适的麻醉剂将斑马鱼麻醉，使其处于无痛苦的状态。
常用的麻醉剂包括MS222等。
3.选择采样部位：根据研究的需要，选择合适的部位进行采样。
常见的部位有肝脏、肌肉和鳃组织。
4.采集样本：用无菌手术器械进行样本采集，避免污染。
5.存储样本：采集后，将样本存储到适当的容器中，并冷冻保存，避免样本代谢物的降解。
样品制备样品制备是代谢组学研究中重要的环节，质量好的样品可以获得准确可靠的结果。
样品制备的主要目的是提取和纯化代谢物，以便后续的检测和分析。
步骤1.样品破碎：将采集到的样本进行破碎，以释放细胞内代谢产物。
可以使用机械方法（如研钵、超声波破碎器）或化学方法（如溶解）进行破碎。
2.提取代谢物：使用适当的提取溶剂提取代谢物。
常用的提取溶剂包括甲醇、乙酸乙酯等。
提取溶剂的选择应根据代谢物的特性进行。
3.过滤和干燥：将提取的溶液通过滤膜进行过滤，去除固体颗粒。
然后使用旋转蒸发仪或氮气吹扫干燥，得到干燥的样品。
4.重溶解：将干燥的样品用适当的溶剂重溶解，以获得适宜浓度的样品溶液，便于后续的检测和分析。
代谢物检测和分析代谢物的检测和分析是代谢组学研究中最关键的环节，不同的检测方法可以获得不同的代谢物信息。
常用的代谢物检测方法包括质谱分析、核磁共振等。
质谱分析质谱分析是代谢组学中最常用的检测方法之一，可以同时测定多种代谢物。
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
1-2组实验干扰因素斑马鱼实验设计方案
1-2组实验干扰因素斑马鱼实验设计方案一、实验目的及原理1.通过斑马鱼早期发育过程的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识。
2.通过设置环境因子(蔗糖)来研究其对斑马鱼胚胎发育的程度。
3.通过对比对照组和实验组，进一步巩固对硬骨鱼胚胎发育模式的认识。
4.锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力。
5.加深环境对动物受精及早期发育影响的理解。
6.蔗糖作为植物光合作用的主要产物,是动物生存所需能量的重要供能物质，是生物生长发育所必须的成分。
在动物的胚胎发育过程也是重要的影响因素。
蔗糖水解后生成的葡萄糖是能量循环的重要组成部分和供能物质。
研究表明，低浓度的蔗糖对斑马鱼的胚胎成长有明显的促进作用，高浓度的蔗糖与高浓度葡萄糖对斑马鱼的胚胎发育有差异巨大的影响，高浓度蔗糖对斑马鱼胚胎发育无明显抑制作用,而高浓度的葡萄糖对斑马鱼胚胎发育有较为明显的抑制作用。
本实验的目的也在探究和验证蔗糖对斑马鱼胚胎发育的影响,学术界对这项研究也处于较为空白的状态。
二、材料与方法1.实验材料:①所需胚胎:发育良好的、健康的斑马鱼胚胎(原肠胚早期 )60枚。
②试剂:蔗糖( 分析纯)。
③器材:培养容器12孔板、恒温培养箱、显微镜、解剖镜、载玻片、塑料滴管、手表、100uL移液枪、1000uL移液枪、量筒100mL*2。
2.实验方法:①在本实验中，使用蔗糖作为实验用环境因子,共设四个梯度，分别为:0, 2%，5%，8%。
每个梯度设3个平行组，每个平行5 组个胚胎,共需60个胚胎。
②实验处理起始时间:卵裂期(受精后两小时以内)实验处理终止时间:孵化期。
③实验操作:A.挑选胚胎由于斑马鱼卵受精及发育的不均匀性，要对斑马鱼卵进行挑选。
挑选时要挑透明、无白色斑点、卵膜完整的。
之后的实验中还要不断将败育卵挑出。
用滴管(塑料滴管口部要剪短且一定要圆滑,并且直径要大于卵径)将选择好.的卵依次吸出,然后放入12孔板中进行孵化。
注意剔除异物眼观有白色小斑点、畸形异常卵。
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斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
一般按2 : 1的比例选择健康的性成熟雄鱼和雌鱼用于交配。
选择好的雌、雄鱼放到同一个水槽箱或水盆中，用隔板或者筛网栏隔离。
在养鱼房之外，可用黑布将整个塑料盆或者水槽箱盖住，使光线不能透过而进行黑暗处理。
黑暗处理开始的时间根据第二天准备开始进行试验的时间和产卵的光周期而定，保证黑暗处理时间为10小时即可。
例如22:00开始，第二天早上约8:00揭开黑布。
4、交配产卵黑暗处理10小时后进行光照，撤去隔离筛使雌雄鱼混合，并加入金鱼藻作为产卵的鱼巢。
雌、雄鱼在光照后很快出现交配追逐并开始产卵，发现产卵后，用胶头滴管将胚胎吸出放入有曝气水的培养皿中进行快速漂洗后，在曝气水中于28℃进行胚胎培养。
随后立即观察和记录受精卵的变化和胚胎发育的变化过程和时序。
五、斑马鱼胚胎发育的观察的基本内容和作业鱼类的卵是端黄卵，进行盘状卵裂，通过观察斑马鱼从受精卵发育成具有自主生活能力的个体的过程了解端黄卵受精后的变化过程和盘状卵裂类型胚胎卵裂和形态模式形成的特点和过程。
具体内容包括观察、作图并记录下述发育过程和时序：1、受精卵的变化和胚盘形成的过程；2、卵裂的方式和多细胞胚胎——囊胚的形成；3、原肠形态发生运动——囊胚细胞经过广泛的、全局性的定向细胞运动形成原肠胚和胚胎的基本形体模式的方式、特点和过程；4、器官发生——脑、眼睛，循环系统，消化系统，骨骼，肌肉等主要器官和系统形成的过程和时序。
附录：斑马鱼胚胎发育图谱和时序（引自Kimmel等，1995）参考文献：Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn 1995; 203:253-310.基因表达研究的显微操作技术一、实验目的通过显微操作将目标基因的DNA或者RNA分子注射到受精卵中，以观察其对胚胎发育的影响。
这种显微操作技术是研究基因在胚胎发育中功能的重要手段。
本实验的目的是了解和掌握显微操作的基本技术。
二、实验器材和材料显微注射仪，体视镜，200ul移液器，100ul移液器，2.5ul移液器，注射试剂，封口膜，注射专用器皿，注射针，拉针仪。
三、实验内容和程序1、体视镜操作：体视镜操作主要是通过调整焦距以及两个目镜之间的距离来保证视野内出现清晰且立体的景象。
2、注射仪的操作：注射仪是由定量控制器，显微注射器，手动操作仪以及固定支架等部分组成的精密仪器（图3-1）。
控制器参数设置界面如图3-2。
定量控制器与电源、显微注射器等的接口如图3-3。
图3-1：显微操作系统图3-2：定量控制器面板Output 1-4对应的信号输出端口，绿灯亮表示相应端口有信号输出；I/W 注射/吸样；VOLUME SET预设的注射或者吸入注射针的样品体积；VOLUME COUNTER 实际注射进胚胎或者吸入注射针的样品体积；RATE设置的吸入或者注射速率；DEVICE TYPE连接的仪器类型（本实验中设置为”K”）；G/N/D 端口同时输出信号/不同时输出信号/禁用端口；RUN/STOP 开始或者暂停工作。
图3-3定量控制器背面接口POWER ON/OFF 开关；RS232/FOOT SWITCH 外接控制器端口；OUTPUT 信号输出端口，对应图2的OUTPUT 1-4。
手动操作仪主要用于控制注射针的移动和角度，操作方式如图3-4所示。
图3-4 手动操作仪操作示意图注射针通过垫圈和电极保护套连接和固定到注射器上。
图3-5 电极保护套及将注射针固定到注射器上的垫圈3、实验步骤（1）通过斑马鱼人工催产准备胚胎（可以直接用受精卵，也可以用脱膜的受精卵）。
（2）注射针的准备：在斑马鱼产卵的同时组装注射针。
注射针是用特制的电极毛细管用电热拉针器拉制而成，其尖细的前端是封闭的，在使用前需要截掉针尖前端的封闭部分；然后在显微镜下观察截断后针头的大小，选择有斜面（参考普通医用针头），大小合适实验需要的注射针。
针头粗对受精卵的损害相对较大，但过细则容易造成堵塞。
然后使用特制的移液器枪头向注射针内灌满石蜡。
（3）注射针的安装：卸下操作仪的电极保护套及三个垫圈后，将保护套及较大的黑色垫圈套按大头在上，小头在下的方向依次套在注射针上。
其他两个垫圈按照黑在上，白在下的顺序套在注射器的推杆上。
将注射针套入到注射器的推杆上（此步要小心操作，电极很脆弱，不能用力过度），然后将固定的电极保护套旋紧即完成注射针的安装。
组装完成后，调整控制仪参数，先排出一定体积的石蜡（一般排2500nl）确保注射针的前端没有气泡。
（4）注射样品的吸取：用干净的滤纸除去针头的石蜡，剪取合适大小的封口膜，将注射用的试剂吸取数微升至封口膜上，在体视镜下开始吸样（吸取样品体积，速率要先设置好）。
吸样结束后，先排除50-100nl的样品，再设置需要注射的参数。
（5）注射操作：将胚胎放置在注射专用器皿，并将待注射胚胎移动到视野内。
调节手动操作仪的旋钮，将注射针头插入到胚胎的胚胎中后（插入角度以45-60°未佳），按定量控制器的注射按钮或者脚踏板将样品注入到胚胎中；约以秒钟后，调节手动操作仪的旋钮将注射针头从胚胎中拉出完成注射。
然后移动注射器皿将第二个胚胎移植到注射针头下，进行下一次注射。
（注射在没有脚踏板的情况下需要两个，一个人注射，另一个负责按定量控制仪以完成注射，期间可以交换操作，保证每个人都熟悉基本操作技术）。
完成注射后，调整参数将电极收回，卸下注射针，关闭仪器并用玻璃保护罩罩住。
四、注意事项：1、实验前需要先熟悉仪器，在老师指导下进行操作练习。
只有经过长期练习才能熟练使用显微注射仪。
刚开始做尽力做到能将样品送到胚胎内部，可以通过共注射有颜色的试剂（如酚红之类）来第一时间观察样品是否进入胚胎。
之后再尽量尝试把样品注入胚盘，再然后就是同时提高注射的速度和精度。
2、针头的大小应根据实验需要进行选择。
3、尽量能在1-2细胞期将样品注入到胚盘。
由于鱼类的胚胎在16细胞以前，细胞与细胞之间的细胞质是连通的，只要将样品送入胚盘都是有效果。
但是实际注射时，时期越早越好，最晚在分裂到8细胞就停止注射。
基因表达与形体模式形成一、实验目的：基因表达的严格时空控制是发育机制的核心。
本次实验人工通过显微注射使斑马鱼β-catenin-2基因在胚胎发育早期过表达，干扰该基因表达的时空模式，然后观察和比较β-catenin-2基因过表达胚胎与野生型胚胎发育的差异，了解基因表达的时空控制在斑马鱼形体模式形成中的重要性。
二、实验器材和材料：1、实验器材：体视镜，显微注射仪，28.5℃恒温水浴设备，37℃恒温水浴锅，PH值测定仪，水平拉针仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备）等。
培养皿（中号，大号），胶头滴管若干，移液枪。
2、溶液及配制：（1）1×PBS: 将20×PBS用双蒸水稀释20倍，高温高压灭菌，室温放置备用。
使用前调节至28.5℃。
（2）0.25%胰蛋白酶：准确称取0.5g胰蛋白酶，0.02g EDTA溶于200ml的1×PBS，37℃水浴充分溶解1h,4℃放置备用。
使用前加热至28.5℃。
（3）1×Hank’s液: 称取0.4gKCl, 8.0gNaCl, 0.67g Na2HPO4·7H2O, 0.6g KH2PO4,1.44gCaCl2, 1.23g MgSO4·7H2O, 溶于800ml蒸馏水中，充分溶解。
使用前加入0.35g NaHCO3，加水定容至1L，用HCl调至pH 7.2，4℃保存。
用于斑马鱼胚胎培养时加热至28.5℃，并加入抗生素（10万单位/升的氨苄青霉素，5万单位/升的氯霉素）。
3、注射样品准备：以BstXI单酶切后的pcs107+zfβ-catenin-2 ORF 线性质粒为模板，用Ambion 的体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit 转录全长的β-catenin-2 capped mRNA。
随后使用Roche公司的Mini Quick RNA Columns 纯化 capped mRNA。
检测合成的RNA的质量和浓度后，-80℃保存，备用。
使用DEPC水前将β-catenin-2 capped mRNA 稀释至所需浓度（400-600ng/μl），冰上放置。
三、实验步骤：1、斑马鱼胚胎的获得斑马鱼在实验室条件下至于28.5℃恒温水浴养殖，以高蛋白冰血赤虫和固体饲料作饵食，设置光照周期为10h黑暗/14h光照，性成熟后按雌雄分开养殖。
催产前一天晚上，挑选2：1比例的雄鱼和预产卵雌鱼分开养殖，按照光照周期次日开始光照后雌雄混合，光照刺激15分钟左右即可开始收集受精卵。