原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型
CpG ODN协同小鼠肝癌细胞裂解物对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用研究
doi：10.3969/j.issn.l000484X.2020.23.006CpG ODN协同小鼠肝癌细胞裂解物对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用研究①孙鹏②李欢欢王卫芳窦瑶周晓晶(长春中医药大学临床医学院，长春130117)中图分类号R730.51文献标志码A文章编号1000-484X（2020）23-28424）4[摘要]目的:研究CpG ODN与小鼠肝癌细胞（H22）裂解物（TCL）联用对小鼠原位移植性肝癌的抑制作用及机制初探。
方法:制备H22细胞裂解物和建立BALB/c小鼠原位移植性肝癌模型。
将模型鼠随机分为四组PBS、TCL、CpG ODN和CpG ODN+TCL,观察各组小鼠肿瘤生长情况及小鼠的生存期。
采用细胞毒性淋巴细胞（CTL）杀伤实验观察各组小鼠淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤情况。
用ELISA方法检测CpG ODN协助TCL诱导Th1型细胞因子分泌水平。
结果:与其他组相比CpG ODN+TCL明显抑制了肿瘤生长、延长了荷瘤鼠的生存期（P<0.05）o体内外实验显示，CpG ODN能协同TCL刺激小鼠产生Th1型细胞因子和诱导CTL反应。
结论：以CpG ODN为佐剂的TCL具有抑制小鼠原位移植性肝癌的作用，且这种作用可能由于CpG ODN协同TCL诱导小鼠产生的Th1型细胞因子和CTL反应实现的。
[关键词]肿瘤细胞裂解物;免疫刺激性寡聚脱氧核苷酸;肝癌;Thl型免疫反应Effect of CpG ODN on assisting TCL from liver cancer cells to induce immune response against orthotopic-transplantated liver cancer in miceSUN Peng,LI Huan-Huan,WANG Wei-Fang,DOU Yao,ZHOU Xiao-Jing.Clinical Medical College,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun130117,China[Abstract]Objective:To study the effect of CpG ODN on assisting TCL from H22cells to induce immune response against or-thotopic-transplantated liver cancer in mice and to explore the mechanism.Methods:We prepared TCL from H22cells and built BALB/c mice with orthotopic-transplantated liver cancer.The model mice were injected divided into PBS group,TCL group,CpG ODN group and CpG ODN+TCL group randomly.The mice were monitored for tumor growth and recoding the survival.CTL killing experiment was used to observe the killing of liver cancer cells by lymphocytes in each group.ELISA was used to detect CpG ODN assisting TCL to induce Th1cytokine secretion level.Results:Compared with other groups,CpG ODN+TCL significantly inhibited the growth of orthotopic transplantation liver cancer cells and prolong survival in mice（P<0.05）.In vivo and vitro experiments,CTL response and Th1-biased cytokine also induced by CpG ODN adjuvanted TCL.Conclusion:TCL with CpG ODN as an adjuvant has the effect of inhibiting orthotopic liver cancer in mice,and this effect may be realized by CpG ODN and TCL-induced Th1cytokine and CTL response in mice.[Key words]TCL；CpG ODN;Liver cancer；Th1immune response肝癌是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，其致死率极高［1］。
肝癌小鼠造模实验方法
肝癌小鼠造模实验方法(1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。
具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c（昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。
若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。
(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。
)(2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。
并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。
7mL，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝(3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*106个瘤细胞)（5*106）？。
全程严格无菌操作，皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL／只(含2*1040min内完成。
(4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg／kg、300mg／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip组(60mg／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组(1000mg／kg、4000mg／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO只小鼠。
造模24h后，阳性对照组(CTX)20mg／kg和青蒿琥酯ip组(60mg／kg)，腹腔注射0．2mL／只，每天1次，连续lOd：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL／只，每天1次，连续lOd。
模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd。
平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。
记录各小鼠死亡的时间。
其他问题：检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？1、造模后第二天给药2、肿瘤长出一定体积后在给药。
迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制
迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制曹雯;莫凯;潘金凤;韦斯军;王振宁;尹园【期刊名称】《临床合理用药杂志》【年(卷),期】2024(17)11【摘要】目的观察迷迭香酸抑制荷瘤小鼠H22肝癌移植瘤生长的作用机制。
方法建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,根据随机数字表法分为模型组、迷迭香酸组、环磷酰胺(CTX)组,每组5只。
迷迭香酸组灌胃给予迷迭香酸,CTX组腹腔注射CTX,模型组灌胃给予等体积0.9%氯化钠注射液,3组均连续给药14 d。
比较3组肿瘤生长情况、免疫器官指数、肿瘤组织病理变化、T淋巴细胞(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))、CD3^(+)、CD4^(+)凋亡率、肿瘤组织中免疫细胞因子[干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)]水平。
结果给药14 d后,CTX组和迷迭香酸组的肿瘤重量和体积低于模型组(P均<0.01);迷迭香酸组小鼠体质量、胸腺指数和脾脏指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);CTX组小鼠体质量和胸腺指数低于模型组(P均<0.01),脾脏指数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
HE切片染色结果显示,模型组小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞分布密集且数目丰富,坏死细胞较少;CTX组肿瘤细胞数明显减少,细胞排列稀疏,肿瘤细胞坏死较多;迷迭香酸组出现肿瘤细胞凋亡和坏死,肿瘤细胞数目减少。
CTX组脾脏组织中CD3^(+)、CD4^(+)水平高于模型组(P均<0.05),CD8^(+)水平、CD4^(+)/CD8^(+)与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);迷迭香酸组CD4^(+)水平、CD4^(+)/CD8^(+)高于模型组,CD8^(+)水平低于模型组(P<0.05或P<0.01),CD3^(+)水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);CTX 组荷瘤小鼠脾脏组织中CD4^(+)、CD8^(+)凋亡率高于模型组,迷迭香酸组CD4^(+)凋亡率低于模型组,CD8^(+)凋亡率高于模型组(P<0.05或P<0.01);CTX 组与迷迭香酸组肿瘤组织中IFN-γ水平高于模型组,TNF-α、IL-10水平低于模型组(P<0.05或P<0.01)。
疾病小鼠模型系列之肝癌篇
疾病小鼠模型系列之肝癌篇前面疾病模型专题已经为大家介绍了肺癌及胃癌小鼠模型，今天是疾病模型专题第三讲，小编将为大家介绍肝癌相关的小鼠模型。
近年来，肝癌的发病率在全球呈上升趋势。
根据美国癌症学会官方期刊发表的《2018年全球癌症统计数据》报告显示[1]，肝癌发生率高居恶性肿瘤第六位，是导致癌症相关死亡的第四大疾病(Fig.1)。
其中，中国的肝癌病例数占全世界总数的55%，肝癌已经成为我们的国家病。
Fig.1 排名前10的癌症在全球范围内的发病和死亡占比诱导肝癌发生的相关因素特别多，诸如：病毒，化学致癌物，酒精等，但其确切的发病机制目前尚不清楚。
因此，建立与人类肝癌生物学特性相近的动物模型，对于肝癌发病机制的研究以及药物开发具有重要的现实意义。
首先我们一起来了解肝癌基本知识！肝癌的分类肝癌主要分为原发性及继发性两种。
●原发性肝癌：肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，为我国常见恶性肿瘤之一。
原发性肝癌根据不同的组织类型分为：肝细胞肝癌(HCC)和肝内胆管细胞癌(ICC)，其中HCC最为常见，约占70-85%。
●继发性肝癌：又称为转移性肝癌，其他脏器的肿瘤细胞经过血液、淋巴或直接侵入肝脏引发的肿瘤。
肝癌的发展进程肝癌的发生是一个多阶段逐渐演变恶化的过程，从最初的肝炎到肝硬化，再到最后的肝癌，是一个多步骤的发展过程[2]。
Fig.2 肝损伤不同阶段(图片来自于网络)由于不同病因会引发不同基因的改变，导致肝癌具有异质性(Fig.3)[3]，因此肝癌模型不具有普遍性。
接下来，小编就目前常用的肝癌模型进行综述，供广大研究者进行参考。
Fig.3 常见的肝癌模型病理图（a.DEN诱发的肝癌; b. DEN+CCl4诱发的肝癌；c.Mdr2肝特异性敲除引发的肝癌；d.Tak1肝特异性敲除引发的肝癌; e.Pten肝特异性敲除引发的肝癌;f.原位注射肿瘤细胞引发的肝癌）常见的肝癌动物模型01 01诱发性肝癌模型许多化学致癌剂达到足够的剂量及时间可诱发动物形成肿瘤。
BALB／c小鼠原位移植肝癌模型的建立及鉴定
ｑ Ａｃ ｔ ａ Ａｃ ａ ｄ Ｍｅ ｄ Ｗｅ ｉ ｆ ａ ｎ ｇ Ｖ ｏ １ ． ３ ７ Ｎｏ ． １ ２ ０ １ ５
肝癌模 型是 目前肝 癌实 验研 究最理 想 的动物 模 型 。但 原位 移植 手术 操作 难度 大 ， 有 很 多技术 难题 需要 攻克 ， 因此 本课 题组 经 反复 实 验 和 改进 ， 建 立 了一 种 简 单有 效 的小 鼠原位 移植 肝 癌 模 型 ， 为 肝 癌 的研 究 提 供 了有
术后 １只小 鼠麻醉 未苏 醒死亡 ， 其 他均 于 当天苏 醒 ， 第
２天 活动正 常 。２周 后 ， 人 道 主义 处 死 小 鼠 ， 解 剖 取 出
肝脏 ， 肉眼可见 有乳 白色瘤 结节 形成 （ 图３ ） ， 除 １只未
见 明显 肿瘤 外 ， 其它 小 鼠均有肿 瘤 发生 ， 小 鼠存 活 率和
常肝 组 织标本 用 １ ０ ％ 中性 甲醛 固定 ２ ｄ后做 病 理 学 检 色， 光 学显微 镜下 观察 。
２ 实 验 结 果
１ ． １ 材料
Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ小 鼠 ， 雄性 ， ４～６周 龄 ， 体重 ２ ０ ｇ
左右 ， Ｓ Ｐ Ｆ级 ， 购 自山 东 大学 动 物 中心 ， 动 物 合格 证 号 为０ ０ １ ４ ６ ５ ４， 实验 和饲 养 条 件 严 格 按 照 Ｓ Ｐ Ｆ动 物 的规 范要 求 ； Ｈ ２ ２细 胞 ， 本 室 常规 保 存 ， 传 代 培 养 。Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养基 及 １ ６ ４ ０培 养 基 购 自 Ｇ Ｉ Ｂ Ｃ Ｏ公 司 ， 胎 牛 血 清 购 自杭州 四季青 生 物制 品研 究 所 。 １ ０ ％水 合 氯 醛 、 注 射 器、 剪刀、 镊子 、 美翼牌 可 吸收 Ｐ Ｇ Ａ无 菌 缝合 线 及爱 惜 康 的慕 丝 非 吸 收性 缝 线 购 自潍 坊 市 人 民医 院。 １ ０ １ ￣ １
小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究
小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意义的研究项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【摘要】目的:探讨用肝癌H22细胞建立小鼠肝癌原位移植模型.方法:将肝癌H22细胞注入小鼠腹腔内,建立异位移植模型;抽取腹水中癌细胞接种于小鼠肝实质内,建立原位移植模型.结果:移植后10d可扪及肿瘤生长,模型成功率94.4％;晚期自发转移率79.4％,腹水产生率35.3％,无自发消退;移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰转氨酶(γ～GT)同工酶阳性的特点;模型平均自然生存期28d.结论:小鼠肝癌原位模型成功率高,易于制作,生物学特征符合模拟人类肝癌在体内发生发展的全过程,可成为今后人类研究肝癌的重要动物模型.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2015(038)006【总页数】2页(P48-49)【关键词】肝癌;H22细胞;原位移植模型;小鼠【作者】项亮亮;侯杰;王婕;焦成斌【作者单位】佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学附属第一医院普外二科,黑龙江佳木斯154003【正文语种】中文【中图分类】R735.7肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，因其发病率高、恶性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的称号[1]。
目前已有大量研究为肝癌临床的治疗提供基础依据，而肝癌动物模型一直是肝癌临床与基础研究工作的重要工具。
目前有关人肿瘤转移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,动物肿瘤则多数是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位肿瘤移植模型国内外报道较少。
小鼠作为一种更经济，易饲养，易获得的实验研究载体，在发挥其普遍应用性方面有着重大的作用。
小鼠肝癌原位移植模型作为一种新型的动物模型是否能更好地模拟人肝癌在体内发生、发展、侵袭及转移的过程，本实验将研究报道如下。
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法先用组织学完整的新鲜人肝癌组织接种于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型），并将其与直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型作比较。
一、间接肝原位移植瘤模型的制备1. 用新鲜的肝癌外科手术切除标本（来自长海医院，患者为1名47岁男性，病理诊断：肝左叶肝细胞癌，粗梁型，Ⅱ级），在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1～2 mm3小块。
2. 取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1 cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成1～2 mm3小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。
3. 取上述2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。
二、直接肝原位移植瘤模型的制备1. 同一例新鲜肝癌手术切除标本，处理方法同皮下移植，裸鼠处理同间接肝原位移植，取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头直接植入裸鼠肝右叶深部实质内。
2. 皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型的制备。
三、病理检查和相关指标检测1. 解剖和组织学检查（1）所有裸鼠接种后，分组分笼饲养，自由进食，每天观察1～2次。
（2）当裸鼠处于全身衰竭状态时处死并作大体解剖，对接种瘤和转移瘤分别进行观察、测量，记录肿瘤侵袭和转移情况，重要器官（主要为肝和肺）经10%中性甲醛固定后，常规石蜡制片，光学显微镜检查。
2. 周围血甲胎蛋白(AFP)检测处死前，均采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。
3. 瘤细胞DNA含量分析留取部分移植瘤标本采用流式细胞术进行DNA含量分析。
注意事项目前，肝癌的复发和转移仍然是其术后长期存活的主要障碍。
为了研究肿瘤的转移机制，建立接近于人体的肿瘤动物模型显得尤为重要。
H22昆明鼠肝癌原位模型的建立
鼠 中有 ９ ５只造模成功 ， ２ ２只小鼠 出现肝癌右叶转移。结论 ： Ｈ ２ ２昆明 鼠肝癌原住模 型成功率 高， 成本低 ， 值得推 广 ， 是非 常理
想 的研 究 肝 癌 的 实验 动 物 模 型 。
关 键 词 ：Ｈ ２ ２ ； 肝癌 ； 原位模型 ； 动 物 实验
中图分类号 ： Ｒ ７ ３ ５ ． ７ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ８— ０ １ ０ ４ （ ２ ０ １ ５ ） ０ １— ０ ０ ７ ８— ０ ２
肝膈 面实 质 内 ， 退 出针 头 ， 轻压针眼， 取 灼 红 的铁 丝
展、 侵袭 及转 移 的过程 ， 具有 极 高 的基 础及 临 床应用 价值 ， 尤其值 得 提 出的是在 本实 验造 模过 程 中 ， 笔者 充 分发 挥 了肿瘤 外科 的优 势 ， 采 用无 瘤操 作原 则 ， 有 效 的避 免肿 瘤 细胞 逃 逸及 种植 ， 与 以往 的各 种 造模
方法 比较 ， 有效 的避 免 了肿 瘤 细 道 ， 以 防止 肿 瘤 细胞 逃 逸 ， 发 生 腹 腔种 植 ， 将肝 左 叶轻 轻 送 回腹 腔 ， 查 无 活 动 性 出血 ， 取 １号丝 线 分 别 缝 合 腹 白线 及 皮 肤 ， 再 次消毒 ， 术 毕。
・
７ ８・
黑龙江医药科学 ２ ０ １ ５年 ２月第 ３ ８卷第 １期
Ｈ ２ ２昆 明 鼠肝 癌 原位 模 型 的建 立①
侯 杰， 罗 兰， 焦成 斌 ， 杨彦 民 ， 何其 勇 ， 张 晓丽 ， 刘伟 新
（ 佳 木斯 大学附属 第一 医院普外二科 ， 黑龙江 佳 木斯 １ ５ ４ ０ ０ ３ ）
白色 ， 质硬 ， 造模 成功 ， 成瘤率为 ９ ５ ％ 。病 理 学 观察
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World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20Published Online January 2015 in Hans. /journal/wjcr/10.12677/wjcr.2015.51003Orthotropic Transplantation to EstablishH22 Hepatocellular Carcinoma Model in MiceChen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang31Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nanEmail: *wanghengxiao@Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014Copyright © 2015 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/AbstractObjective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer.KeywordsHepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3*通讯作者。
原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型1山东省医学科学院基础医学研究所免疫室，济南2济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南3山东省医学科学院基础医学研究所病理室，济南Email: *wanghengxiao@收稿日期：2014年11月24日；修回日期：2014年12月22日；录用日期：2014年12月30日摘要目的：建立H22肝癌细胞小鼠肝脏原位移植瘤模型，为进一步开展相关实验研究做准备。
方法：直接注射一定数量的H22肝癌细胞于C57BL/6小鼠肝脏左叶，构建肝癌原位移植瘤模型。
结果：术后7天小鼠肝脏表面出现大小不一结节散在分布，随着时间延长结节增多增大，后期腹腔脏器出现浸润、粘连，腹水增多。
肝脏瘤组织及癌旁组织进行组织病理学检查，肝脏原位成瘤率100%，无自发消退。
结论：原位注射H22肝癌细胞株能在肝脏局部形成原位移植瘤，且成瘤时间相对较短，成瘤过程中伴有脏器转移、腹水形成等，较好的模拟了机体原发性肝癌的病理生理学过程，能满足对肝癌相关研究的要求。
关键词肝细胞癌，原位移植，实验动物模型1. 引言建立肿瘤动物模型是研究肿瘤发病机制及开展肿瘤治疗相关研究的重要手段，动物模型应该尽可能的接近人类肿瘤的自然生物学过程，包括肿瘤的发生、发展、浸润和转移[1]。
目前在肝癌研究中多采用异体移植法将肿瘤细胞株注射到动物皮下形成局部瘤块来构建移植瘤模型，相比机体原发性肝癌的形成及病理生理学变化仍有一定不同。
本研究通过将一定数量的H22肝癌细胞直接注射入具有完全免疫能力的C57BL/6小鼠肝脏实质，观察其原位移植瘤成瘤的过程及状态，能较好的模拟人体肝癌生长过程，为进一步抗肝癌免疫研究提供实验动物模型。
2. 材料与方法2.1. 材料2.1.1. 实验动物雄性C57BL/6小鼠3 0只，6~8周龄，体重（20±2）g，购自山东大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(鲁)20090001，饲养于山东省医学科学院基础研究所实验动物房IVC(智能型独立送回风净化笼具)中，动物在室温(22±2)℃、相对湿度50%条件下自由摄取食水，两周后开始试验。
鼠源性H22腹水型肝癌细胞株由本室在液氮中长期保存。
2.1.2. 主要试剂无菌生理盐水，磷酸盐缓冲液(PBS)，水合氯醛，10%中性甲醛。
2.2. 方法2.2.1. 复苏细胞株腹腔接种自液氮罐中取出冻存管，在38℃温水中快速摇动使细胞融化，吸取细胞悬液至无菌生理盐水中混匀，原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型1000 rpm/min，离心5分钟，弃去上清，用无菌生理盐水重悬细胞，调节细胞浓度至1 × 107/mL。
碘伏消毒C57BL/6小鼠腹部皮肤，采用1 ml BD注射器抽取0.2 ml细胞悬液腹腔注射小鼠，约一周后形成腹水。
无菌抽取腹水进行传代，采用第3代传代细胞进行肝脏注射。
2.2.2. 小鼠肝癌原位移植瘤模型的建立无菌抽取腹腔接种H22肝癌细胞株的小鼠腹水，加入PBS液混匀，1000 rpm/min，离心5分钟，弃去上清，反复PBS洗涤、离心2次。
无菌生理盐水重悬细胞，显微镜下细胞计数，经台盼蓝染色法检测细胞存活率>95%，调节细胞浓度至1.2 × 107/mL，置于冰上待用。
采用5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)小鼠腹腔注射进行麻醉，取仰卧位，固定于实验板上，碘伏消毒皮肤，剑突下沿腹中线纵行切口，逐层剪开皮肤和腹膜，充分暴露肝左叶。
用50 μL微量注射器抽取50 μL H22细胞悬液(含细胞数6 × 106个)，20˚角刺入肝脏实质约0.5cm缓慢注入细胞悬液，停留片刻，注射完毕拔出针头，立即用无菌纱布轻压针孔至肝脏表面不再渗血，逐层关腹。
术后继续饲养，自由进食、进水。
2.3. 观察指标及方法2.3.1. 肿瘤移植的观察分别于术后7天、14天、21天处死7只小鼠，肉眼观察移植瘤的大体形态及与周围器官粘连、腹水形成情况。
2.3.2. 组织病理学检查肝脏肿瘤组织经10%中性甲醛固定，酒精梯度脱水，石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色，在光学显微镜下进行病理检查。
2.3.3. 荷瘤小鼠的自然生存期观察9只荷瘤小鼠未进行任何干预处理，观察自然生存期及肿瘤的自发消退率。
2.4. 统计学处理实验数据以均数±标准差表示，利用SPSS17.0统计软件进行数据处理，P < 0.05认为具有显著性差异。
3. 结果3.1. 小鼠原位移植瘤模型建立术后7天、14天、21天处死小鼠，观察均形成肝原位瘤，肝原位成瘤率为100%(30/30)，肿瘤自发消退率为0 (0/30)，无手术相关死亡。
荷瘤小鼠自然生存期为21~28天。
3.2. 组织病理分析术后7天处死7只小鼠，取出肝脏进行观察，肉眼可见7只小鼠肝左叶均出现散在0.5~2.5 mm乳白色点状结节。
术后14天处死7只小鼠，未见肿瘤自发消退，乳白色结节增多，散在分布，且体积明显增大，可见有2只出现少量淡黄色腹水，肿瘤结节部分与腹腔脏器有轻微粘连。
术后21天处死7只小鼠，肿瘤组织呈鱼肉状，连接成片，与正常肝组织分界不清，肝脏质地轻度变硬，与腹腔胃、肠管等脏器粘连严重，4只形成大量腹水，占57.1%，颜色呈乳白色或血色(图1所示)。
原位移植瘤在术后第14天左右进入快速增殖期，至21天后肿瘤体积增长速度明显加快。
光镜下观察，正常肝小叶结构消失，瘤细胞异型性明显，大小不等，形状各异，可见瘤巨细胞，染色质明显增多，细胞核深染，呈现分叶、多核等病理性核分裂，肿瘤细胞排列紧密，呈浸润性生长(图2所示)。