特异性抗原诱导的细胞毒性T细胞功能测定
免疫细胞功能的测定(精)
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
应用实践
1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以 及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。 2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可 以用于检测T细胞的辅助功能。 3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B 细胞分化异常的机制。
B细胞产生抗体能力的测定
丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定
基础理论
人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激 时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞 产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗 体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗 体的B细胞数量估计。
B细胞产生抗体能力的测定
B细胞产生抗体能力的测定
基础理论
B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后， 活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。 抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是 测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、 接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以， B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源 于T细胞缺陷。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
基础理论
B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然 后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转 类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗， 结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类 别。
B细胞产生抗体能力的测定
ELISA测定各类免疫球蛋白
T细胞增殖功能测定
抗原诱导的特异性增殖反应
应用实践
1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖 能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体 的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常 用于测试小鼠T细胞增殖能力。
T细胞检测技术
贯穿全篇，却有两个句子别出深意，不单单是在写乐，而是另有所指，表达出另外一种情绪，请你找出这两个句子，说说这种情绪是什么。明确：醉翁之意不在酒，在乎山水之间也。醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。这种情绪是作者遭贬谪后的抑郁，作者并未在文中袒露胸怀，只含蓄地说：“醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。”此句与醉翁亭的名称、“醉翁之
2、分子生物学检测
（1）Realtime-PCR （2）分子杂交
三、T细胞介导的细胞毒实验
特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别靶细 胞表面特异性抗原，通过Fas途径及颗粒酶途径， 介导靶细胞溶解。
1、51Cr释放实验
铬酸钠（Na251CrO4）中的六价铬能被活 细胞摄取，并在细胞溶解后以三价铬的形 式被释放。
化，使文章越发显得音调铿锵，形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形成回环往复的韵律，使读者在诵读中获得美的享受。(3)文章写景优美，又多韵律，使人读来不仅能感受到绘画美，也能感受到韵律美。
1.朝而往，暮而归；2.杂然而前陈者表转折
1.而不知人之乐；2.而不知太守之乐其乐也虚词“之”的用法用法
• 方法学评价 优点：灵敏、特异，是CTL活性测定的经典方法； 缺点：操作繁琐；放射性；靶细胞51Cr自发释放；
2、IC Assay（In vivo cytotoxicity Assay）
表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后， 皮下注射入小鼠，被小鼠体内抗原特异性CTL作用 24小时后，取出肿瘤细胞，检测其CFSE含量。
西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“唐宋八大家”。后人又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。
新概念疫苗考试重点
新概念疫苗一、名词解释1.新概念疫苗：与传统疫苗成分,机制,作用不同,且能激发机体特异性免疫应答的新型疫苗。
(1.成分不同：传统疫苗多为死疫苗/减毒活疫苗或重组亚单位疫苗,新概念疫苗则为编码无毒力抗原蛋白的病毒核酸或能激发特异性机体免疫应答的细胞疫苗2.机制不同：传统疫苗主要靠病毒的抗原蛋白刺激机体产生中和性保护抗体,新型疫苗不仅刺激机体产生中和性保护抗体,而且能激发特异性细胞免疫应答 3.作用不同：传统疫苗只能起一定预防作用,新型疫苗不仅能预防疾病,且更能起到特异性治疗作用)2.核酸疫苗：把编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入到动物体内, 使外源基因在活体内表达,3.T细胞疫苗：将引起自身免疫性疾病的自身反应性T细胞或导致同种移植排斥反应的同种反应性T细胞活化并灭活后作为疫苗,可诱导机体产生针对致病性T细胞或同种反应性T细胞的免疫应答,从而消除或减轻这些细胞的致病作用.称为T细胞疫苗4.T细胞表位：抗原经过抗原递呈细胞(APC)加工后,由MHC分子递呈给T细胞受体(TCR)的短肽。
5.树突状细胞（DC）疫苗：荷载抗原的DC具有疫苗的功能，故称~6.抗原提呈细胞(APC)：能摄取、加工处理抗原，并将抗原递呈给T淋巴细胞的一类免疫细胞，在机体免疫应答中发挥重要作用，也称辅佐细胞7.专职APC：能组成性表达MHC-II类分子和T细胞活化的共刺激分子，抗原递呈能力强，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等8.内源性抗原：APC内合成的，如被病毒感染细胞合成的病毒蛋白9.外源性抗原：来源于细胞外的抗原,如被吞噬的细胞或细菌等10.交叉递呈：有些APC的MHC-I类分子具有提呈外源性抗原给CD8+细胞的能力。
11.Th1：特征性分泌IL-2、IFN-γ、LT等细胞因子，主要介导迟发型超敏反应（DTH）和巨噬细胞活化等细胞免疫反应。
12.Th2：特征分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等细胞因子，主要促成B细胞增殖并分化成浆细胞，分泌特异性抗体，介导体液免疫和过敏反应。
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。
近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。
目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。
1 单个细胞水平测定CTL活性目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。
活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。
目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。
1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。
LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。
但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。
(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。
医学免疫实验(T细胞增殖实验、核素法、MTT法)
3H胸腺嘧啶核 苷掺入检查法
3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法
原理：当淋巴细胞受分裂原(PHA等)或特异性抗原刺激发生转化时， 必然伴有DNA的大量合成，若将具有放射性的3H-TdR加到培养液内， 则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放 射性物质的相对数量(以脉冲数cpm表示)，就能客观地反映淋巴细 胞对刺激物的应答水平。
MTT法
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活 性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞 毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它 的特点是灵敏度高、经济。
淋巴细胞的功能测定技术
T细胞+PHA
培养，淋巴母细胞转化
染色 +3H-TdR
计数转化细胞百分率 测定cpm值
测定OD值
谢谢！
医学免疫实验
作业
市场上有一广告产品，据说有免疫 增强作用，请设计一个方案证实之 （从影响淋巴细胞功能、T淋巴细 胞增殖的角度考虑）。
T细胞增殖实验 3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法（核素法） MTT法
T细胞增殖实验
原理：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺 激，细胞代谢和形态相继变化，在24~48h细胞内蛋白质 和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变 化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松 等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细 胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有 关刺激的反应性与功能状态。 (1) 非抗原性刺激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝分 裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和 ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物:如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风 类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。
t细胞耗竭的金标准
t细胞耗竭的金标准
T细胞耗竭是免疫系统中一种状态，通常指长时间受到慢性抗原刺激后，T细胞失去活力和功能的状态。
关于T细胞耗竭的金标准主要通过一系列细胞表面标记物、功能性测定和基因表达等方面进行评估。
以下是一些用于评估T细胞耗竭的常见标准：
1.PD-1（程序性死亡蛋白1）和CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞
抗原4）表达：T细胞耗竭的一个标志性特征是PD-1和CTLA-
4的过度表达。
这两个蛋白负责负调控T细胞的活性，过度表
达可能导致T细胞功能抑制。
2.细胞功能测定：耗竭的T细胞通常表现出减弱的细胞功能，如
细胞增殖和细胞毒性。
通过测定T细胞对抗原的反应性、细胞
因子产生等功能来评估其功能状态。
3.表面标记物：T细胞耗竭通常伴随着一系列表面标记物的改变，
例如CD27、CD28、CD127、CD62L等。
这些标记物的表达水
平可以用于评估T细胞的功能状态。
4.细胞因子表达：耗竭的T细胞通常表现出特定的细胞因子表达
模式，例如过度表达抑制性细胞因子（如IL-10、TGF-β），同时
减少分泌激活性细胞因子（如IFN-γ、IL-2）。
5.基因表达分析：利用基因组学和转录组学技术，通过分析T细
胞的基因表达谱，可以识别与耗竭状态相关的基因表达模式。
6.功能性体外实验：使用体外实验系统，通过模拟T细胞与抗原
的相互作用，评估T细胞的反应性、增殖能力和效应分子的表
达。
综合上述标准，没有一个单一的金标准来评估T细胞耗竭，而是需要多方面的综合考虑。
这样的综合评估有助于更全面地了解T细胞的功能状态和其在免疫调控中的角色。
特异性抗原识别和抗原呈递与T细胞反应机制
特异性抗原识别和抗原呈递与T细胞反应机制在我们的免疫系统中，T细胞是非常重要的一部分。
T细胞由脾和淋巴组织产生，是免疫系统中的重要组成部分，其主要作用是寻找并杀死体内的病原体，以保持我们的身体健康。
在T细胞反应中，特异性抗原识别和抗原呈递是非常重要的一个过程。
本文将讨论T细胞的几种类型，它们如何识别和响应不同的抗原，以及如何把这些不同的抗原展示给T细胞。
T细胞的类型T细胞有多种不同的类型，包括诱导性T细胞、外周T细胞和细胞毒性T细胞。
每种类型的T细胞都有其特定的功能。
诱导性T细胞可以为外周T细胞和细胞毒性T细胞提供信号，以便它们能够响应来自病原体的抗原。
外周T细胞的主要功能是识别和响应病原体的抗原，从而激活其他免疫细胞，并开始产生抗体。
细胞毒性T细胞则能够直接杀死感染细胞或肿瘤细胞。
抗原识别T细胞能够识别不同类型的抗原，包括蛋白质、多肽片段和糖脂。
一旦病原体进入身体，它会被消化并分解为许多小片段。
这些小片段被称为抗原肽。
许多不同类型的细胞可以产生抗原肽，包括巨噬细胞和B细胞。
这些细胞将抗原肽“附着”在它们的表面上，以便能够经过呈递给T细胞。
抗原呈递抗原呈递是T细胞激活所必需的过程之一。
它涉及将抗原肽呈递给T细胞，以便T细胞能够对其做出反应。
这个过程是由一种叫做MHC分子的蛋白质来完成的。
MHC分子位于细胞表面，能够结合抗原肽并“展示”给T细胞。
MHC分子分为两种类型：类I和类II。
类I MHC分子位于所有核糖体制造的细胞表面，包括体细胞和免疫细胞。
它们能够结合由体细胞产生的抗原肽，并展示给CD8+ T细胞。
类II MHC分子则位于抗原呈递细胞（如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的表面，并能够结合由这些细胞产生的抗原肽，并展示给CD4+ T细胞。
T细胞反应一旦T细胞识别了MHC分子呈递的抗原肽，它们就会被激活并开始产生一系列细胞信号和细胞因子。
这将导致T细胞分化成各种不同类型的效应T细胞，包括细胞毒性T细胞和外周T细胞，以及产生抗体的B细胞。
TDAR在药物临床前毒理学研究中的应用
TDAR在药物临床前毒理学研究中的应用中国药事2011年第25卷第7期705综述TDAR在药物临床前毒理学研究中的应用霍艳,艾文超,闻镍,沈连忠,王军志,李波(中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心,北京100176)摘要:目的TDAR试验被认为是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验,本文综述总结TDAR检测方法在药物临床前毒理学研究中应用的一般原则,以便同行参考.方法通过综合分析,对比,总结国内外文献资料中关于TDAR的实验方法和评价,得出在药物临床前毒理学研究中应用的一般原则.结果T细胞依赖性抗体反应(TDAR)是检测免疫功能的主要试验.TDAR通过人为引入外来抗原,反映药物或化学物质对免疫系统整体的影响,目前在药物免疫毒理学研究中逐渐得到广泛应用.结论TDAR试验是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验,该试验可以用来在临床前的反复给药毒性试验或者临床试验中检测免疫功能的改变,可以对候选药物的免疫调节和免疫毒性特点进行早期预测.关键词:T细胞依赖性抗体反应(TDAR);钥孔戚血蓝素(KLH);绵羊红细胞(SRBC);免疫毒性中图分类号:R994.2文献标识码:A文章编号:1002—7777(2011)07—0705—05 TheApplicationofTDARinthePreclinicalToxicologicalStudyofDrugsHuoY an,AiWenchao,WenNie,ShenLianzhong,WangJunzhiandLiBo(NationalCenterfor SafetyEvaluationofDrugs,NationalInstitutesforFoodandDrugContro1,Beijing,100176)ABSTRACT:ObjectiveTcelldependentantibodyresponse(TDAR)isoneofthemaintestsfo rtheevaluationofimmunefunction.Inthisarticle,generalprincipleofTDARassayinthepreclinic al toxicologicalstudyofdrugswillbesummarizedusingsomecasestudies.MethodsThrougha nalyzingand comparisonofthemethodsofconductingTDARandthedescriptionofTDAR,generalprinci pleofapplyingTDARwasconcluded.ResultsTheeffectonthewholeimmunesystemofdrugsorch emicals couldbestudiedthroughtheapplicationofanexogenousantigeninTDARassay.Conclusion TADRhas relativelygoodpredictabilityandcouldbecombinedintobothpreclinicalandclinicalstudies .Italsocouldbeusedtoscreencandidatedrugs.KEYWORDS:TCellDependentAntibodyResponse(TDAR);KeyholeLimpetHemocyan in(KLH);SheepRedBloodCell(SRBC):ImmunotoxicityT细胞依赖性抗体反应(Tcelldependentantibodyresponse,TDAR),指B细胞针对T细胞依赖性抗原(Tcelldepedentantigen,TD抗原)产生的抗体应答,需要Th2细胞的协助才能产生特异性抗体.T细胞依赖性抗体反应(TDAR)通过人为引入外来抗原,反映药物或化学物质对免疫系统整体的影响.TDAR试验被认为是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验,该试验可以用来在临床前的反复给药毒性试验或者临床试验中检测免疫功能的改变,可以对候选药物的免疫调节和免疫毒性特点进行早期预测,目前该方法在药物免疫毒理学研究中逐渐得到广泛应用.本文综述该方法在药物临床前毒理学研究中应用的一般原则.基金项目:国家"重大新药创制"科技重大专项(编号2oo8zxo9305—002)作者简介:霍艳,博士,副研究员;主要从事临床前药物安全性评价研究;Tel:(010)67876252;E-mail:*****************.cn通讯作者:李波,博士,研究员,博士生导师,主要从事临床前药物安全性评价及药理毒理研究;Tel:(010)67095790;E-mail:libo@706中国药事2011年第25卷第7期lTDAR的应用机理及检测意义外来抗原(绵羊红细胞或者钥孔戚血兰素)进入未经免疫的机体后,诱发初次免疫应答,其抗原呈递多由巨噬细胞完成,经巨噬细胞活化Th细胞后再由活化的Th细胞辅助B细胞产生抗体.上述过程包括抗原处理和提呈,细胞增殖,分化,B和T细胞相互作用,细胞因子分泌,抗体产生和细胞凶子依赖性表型转换等一系列复杂的反应.免疫系统处于细胞增殖,分化,活化和成熟等一系列动态变化中,对上述任何过程的干扰都会导致免疫系统的损伤,产生免疫毒性.在对化学物质或药物免疫毒性评价试验中,强免疫毒性可通过标准毒理学研究(StandardToxicologyStudy,STS)中的血液学和淋巴组织病理学来评价,而中度免疫毒性只能在外来抗原(例如外来抗原,病原体或毒素)攻击后的免疫功能水平上进行研究.也就是说,射免疫系统功能的评价需要对被激活的免疫细胞,免疫器官或宿主整体对外来"敌人"的反应进行研究.通过检测抗原特异性抗体水平的变化,可以获得药物对上述抗体产生过程影响的信息,从而预测其免疫毒性.2TDAR方法的历史发展T细胞依赖性抗原钥孔戚血蓝素(keyhole limpethemocyanin,KLH)和绵羊红细胞(Sheep RedBloodCell,SRBC)均可诱导明显的初级抗体反应,l大j此被推荐用于TDAR研究的免疫原(或称为抗原).对于抗原特异性抗体检测,过去多采用空斑形成细胞(PlagueFormingCells,PFC)反应检测脾脏细胞中对SRBC特异性的抗体,近年来则采用ElISA方法检测血清中特异性抗体的水平.目前TDAR试验主要有3种形式:以SRBC为免疫原,以PFC方法检测SRBC特异性抗体反应的FDAR(SRBC-PFCTDAR);以SRBC为免疫原,以E1ISA方法检测SRBC特异性抗体反应的TDAR(SRBC-EIISATDAR);以KIH为免疫原,以ElISA方法检测循环血液中KIH特异性抗体反应的TDAR(SRBGEIISATDAR).最早的TDAR均采用PFC方法检测SRBC特异性抗体,PFC法存在一定的局限性,例如,试验周期长,干扰素多,结果变异较大,抗原的标准化较困难等,且该方法需要在样本采集当天进行试验,不能保存样本待后续测定,另外,该方法仅存小鼠巾得到充分验证,存大鼠和非啮齿类动物中还未得到广泛的证实J.ElISA方法与PFC方法比较的优势在于,可以在研究过程中连续采集样本,将血清冻存待检,操作的灵活性较强,可以检测体内总抗体(血清)或者脾脏特异性的抗体反应,检测方法相对简单,比PFC方法工作量小. ELISA方法包括检测SRBC特异性抗体的方法和检测KIH特异性抗体的方法,KIH作为捕获抗原与SRBC法相比变异性小.因此在药物临床前毒理学研究中广泛使用的是KIH免疫后检测KLH特异性抗体的EIISA方法J.3TDAR在药物研发进程中的实施时机检测化合物潜在免疫毒性时需要采用证据重要性的原则.如果在STS研究中未见免疫毒性的迹象,且药理学分类,期望的患者群和临床数据表明与免疫毒性无关,那么就不需要TDAR这样的免疫功能性试验,STS中的血液学和淋巴器官病理学就可以预测免疫毒性的风险.如果STS研究发现免疫毒性迹象,就可以采用TDAR等试验来研究功能性损伤的结果,特别是在未确定何种免疫细胞受到损伤时,TDAR试验更为有效.该试验可以提供受试物对免疫功能影响以及其是否具有免疫毒性潜能的信息.此时,TDAR需要在临床应用于大批人群之前采用相关物种进行试验,也就是在Ⅲ期临床前进行.作为一个在药物研发后期进行的深入研究试验,临床前和已经有的临床数据可以有助于剂量的选择.但是有时可能需要在较早时期进行TDAR试验,这需要根据免疫毒性的严重程度决定,特别是要考虑化合物是否会应用于免疫缺陷的人群.如果发现化合物对TDAR有影响,就需要进行深入研究试验以探讨免疫抑制的机制j. TDAR也可以在药物研发早期进行应用,在STS研究进行之前进行TDAR以评价药物的免疫调节作用,或者发现可能会终止药物开发的免疫毒性迹象.例如,在抗炎药物或者免疫调节药物开发中帮助减少不期望免疫抑制副作用的风险,此时, TDAR就可以用来评价免疫抑制潜能并以此筛选最佳的候选药物.通常在药物研发的早期阶段,化合物的量很小,因此可以考虑采用小鼠TDAR试验或者体外TDAR试验,并可以用TDAR检测一系列的化合物,这些化合物可能具有新的作用靶点,具有影响免疫细胞的潜能但却不改变免疫功能,例如,影响淋巴细胞上的受体或者靶点J.4TDAR在药物毒理学中应用的一般原则4.1物种的选择物种的选择通常根据毒理学研究中的免疫毒性中国药事2011年第25卷第7期707的证据进行,例如,在重复给药毒性研究中如发现免疫抑制的证据,则需要进行其潜在免疫毒性的检测.推荐采用毒性研究相关物种进行TDAR试验. 如果一种药物在非人哺乳类上表现药效活性或者毒性特征,则需要采用非人哺乳动物进行免疫毒性试验,而不是采用啮齿类动物.选择相关物种的第一个原因是在不同物种进行TDAR试验时敏感性不同.研究表明,Wistar大鼠SRBC和KLH免疫的IgM应答高于SD大鼠, 但IgG应答低于SD大鼠.选用环磷酰胺,硫唑嘌呤,环孢素A和地塞米松作为免疫抑制阳性药物, 在SD大鼠和B6C3F1小鼠(美国国家毒理学计划推荐)两种动物种属之间进行比较发现,小鼠对于KIH初级免疫应答的灵敏度稍强于大鼠,并且F344大鼠的敏感性强于SD大鼠;另外一个原因是内源性抗体的存在.例如,在狗和猴都有内源性抗KIHIgM的的存在,针对共同表位的内源抗体的产生在猴和人血清中都有存在.内源性抗KLHIgM产生的原因可能是食物或者是ELISA 检测中内源抗体和抗原的交叉反应导致..4.2抗原及其免疫方式的选择T细胞依赖性抗原KLH和SRBC,品质稳定且可以诱导明显初级抗体反应,因此被推荐用于TDAR试验的免疫原j.非临床毒理学研究中最经常使用的动物是大鼠,犬和猴,在非啮齿类动物(例如犬)中,SRBC通常会导致补体的激活而引起类过敏反应,会影响动物的状态并干扰试验结果.因此,非啮齿类动物中常采用KLH作为TDAR试验的免疫原_1.进行TDAR试验前应该确定抗原的剂量和免疫途径等免疫方式.目前,KLHEIISA检测方法的免疫方法仍未标准化,不同实验室大多采用各自不同的免疫途径及方法进行免疫接种.Gore等比较了足跖注射(300~g/只),静脉注射(300~g?kg)和皮下注射(300~g?kg)3种免疫途径对IgM,IgG抗体产生的影响.发现足跖免疫和静脉注射免疫大鼠表现出强烈的IgM和IgG应答,但静脉注射免疫引起的IgM应答更敏感.而皮下给药KIH产生的免疫应答较弱_3J.Merk免疫学实验室的研究结果表明_1,在SD大鼠和Wistar大鼠,KIH腹腔注射给药不如静脉注射给药结果稳定.另外,KIH剂量越大,结果越稳定(剂量高达2000ug/动物).在WH(Wistar—Hannover)大鼠中进行的研究表明,不同给药途径和不同给药剂量均可以显着增加抗KIHIgM和IgG水平.但是,在考察组问,性别和整体反应的差异时发现,KLH以lO00/,g/动物腹腔给药时能够获得最佳的抗体反应.KIH对于SD大鼠和wH大鼠的最佳给药方式为腹腔注射1000/xg/动物.加入佐剂也可以使结果稳定,但对KIH的反应强度影响不大.有研究表明,加佐剂后检测KIH反应的敏感性有波动,因此有人认为在啮齿类动物的TDAR试验中不适合加入佐剂.在人和非人哺乳动物上可以使用铝佐剂,Stephanie Grote—Wessels等人提出KLH与弗氏佐剂同时使用时,KLH剂量在食蟹猴中可以低至lOO>g/动物,而在绒猴中可以低至5o>g/动物_】引.但有研究表明,食蟹猴上不使用佐剂也可以诱导高水平的IgM和IgG抗体.4.3TDAR试验的验证在将TDAR试验应用于免疫毒性研究之前,应该确定抗原的剂量,给药途径以及在相关毒理学物种上抗体产生的时间(啮齿类和非啮齿类).抗原的剂量和给药途径会影响抗体产生的动力学和强度.检测待测样本抗体水平的方法需要事先验证,包括检测抗体滴度(又将待测样本梯度稀释得到) 和抗体浓度(用已知的纯化的对照抗体做标准曲线).ICH不推荐不推荐采用吸光度值来表示抗体水平_5].但是在毒性实验中有溶媒对照组存在时, 可以用滴度结果表示定性的变化.在大鼠研究中,Roman等u给药第16d和第24d皮下注射KIH免疫.第31(未免疫组)和32d(免疫组)分离血清进行抗体检测.在28d的毒性研究中,为了配合给药结束时的采血操作,通常在受试物给药后第15d,对各组动物注射KIH,于给药第19,28d(即KLH免疫后第5,14d)对KLH免疫动物进行采血测定抗KLH抗体. Finco—KentD等在狗的TDAR实验模型中确定了KLH的适用剂量,KLH的抗体反应在狗体内的免疫途径和动力学,确认了方法的灵敏度. KLH免疫剂量为50rag/动物时,实验证实肌肉注射比皮下注射稍敏感.研究证明KIH特异性IgM峰值出现在第7d,IgG峰值出现在第14d_g]. PiccottiJR等研究发现对食蟹猴体内抗KIH特异性免疫球蛋白IgM峰值出现在10～14d,而IgG峰值出现在14～21d_1.Haggerty等在选择性CD80/CD86协同抑制剂CTIA4Ig(Abatacept)食蟹猴免疫毒性研究中采用KIH作为抗原进行了708中国药事2011年第25卷第7期TDAR试验.Abatacept以10mg?kg剂量静脉注射给药,KLH以10mg/动物肌肉注射,在KLH免疫后第8,15,22和29d采血检测KLH特异性抗体,以抗体滴度表示结果l_1.4.4受试物剂量及组别设计通常受试物的高剂量要高于NOAEL剂量,但是也要避免因高剂量本身引起的免疫系统的应激反应.在免疫抑制剂研究中,推荐的高剂量水平应该是与对照组比较引起的体重降低不超过1O,低剂量应该是对TDAR不产生影响.同时,也要包含一个中剂量以反映剂量反应关系,设计一个阳性对照来验证试验的有效性(例如环磷酰胺,环孢霉素,硫唑嘌呤等),一般推荐在每一次试验都加入阳性对照,或者定期加入阳性对照组.另外还要设置KIH对照组和溶媒对照组,KLH对照组不给受试物,其KLH抗体的水平用来计算受试物引起的KIH抗体产生减少的幅度(免疫抑制作用).溶媒对照组给药方式和间隔与受试物完全相同,用来对照与受试物不相关的反应.溶媒对照组在其它组给与KLH免疫的时问点以PBS代替KIHE.4.5TDAR试验中抗原免疫和抗体检测时间点的设计在TDAR试验中,何时进行T细胞依赖性抗原的检测,何时进行抗原特异性抗体的测定,需要根据受试物的给药时长和抗原特异性抗体在相关毒理学研究物种(啮齿类和非啮齿类)出现的时间点来确定.研究表明,KLH特异性IgG抗体产生在第14d为高峰,且可持续至免疫后21d,KLH特异性的IgM在给药后第4～7d出现].因此,在28d给药毒性试验中,受试物连续给药28d,给药第ld作为Dayl,检测KLH特异性的IgM时,在Day24d进行KLH免疫,也就是在试验结束(Day29)前5d进行免疫,或者是在第15d进行KIH免疫,在第20d采血进行IgM测定,在第29d采血进行IgG测定.在由环孢霉素引起的大鼠免疫抑制检测中,KLH特异性IgG比IgM更敏感,IgG水平的降低比IgM的幅度要大,这可能是由于IgG对免疫抑制更加敏感,或者是由于在试验设计中,抗原特异性IgG的产生过程暴露于受试物的时问更长,也就是说,在大鼠中IgG和IgM产生的动力学不重合(IgM和IgG的达峰时间分别为4～7d和14～21d),凶此在同一个大鼠免疫抑制模型中对比IgG 和IgM的敏感性是不恰当的.但是,在猴子的试验中IgG和IgM的动力学特征是有交叉的,测定IgG和IgM的时间点是相同的,因此,可以对暴露于受试物相同时问的动物同时进行IgG和IgM 的测定u.常规的KLH试验是28d,在第14d进行KLH免疫,以便在试验最后一天采血测定KLH抗体.但是,上述时间点是可以改变的,因为必须根据毒理学预实验的信息确定受试物的给药周期能够保证检测到潜在的免疫抑制作用.例如,如果受试物给药4周可见感染几率的增加,那么动物在KLH免疫之前至少给药4周.4.6卫星组的设立在实施TDAR试验时,另外一个考虑的因素是对主实验的动物进行抗原的免疫是否恰当,即是否需要设立卫星组,主要考虑是出于抗原对其它毒理学指标的影响.Ladies等人报道,对大鼠进行SRBC免疫不影响其血液学或者血清生化学参数. 另外,也不改变动物的淋巴器官重量或组织学,但可能对脾脏的形态学产生影响.但是KLH免疫对毒理学指标是否有影响尚未知.因此,在得到足够的背景数据之前,推荐采用卫星组进行TDAR研究,或者进行单独的TDAR研究.由于经济原因和资源的限制,在非人哺乳动物上进行单独的TDAR研究通常是不适合的.在这种情况下,认为在非人哺乳动物进行抗原免疫是可以接受的,并且通常认为不影响毒理学结果的解释u.5结语TDAR试验被认为是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验.目前已经在大鼠,犬和猴子的毒性研究中得到广泛应用,并已经开始在发育毒理学研究中得到应用L】引.该试验可以用来在临床前的反复给药毒性试验或者临床试验中检测免疫功能的改变,可以对候选药物的免疫调节和免疫毒性特点进行早期预测.但是,由于TDAR试验存在固有的动物间的变异性,不能将TDAR作为单独的,唯一的免疫毒性试验,需要参考评价免疫毒性风险证据一重要性的原则,根据实际需要选择与其它免疫毒性评价试验共同使用.参考文献:[1]GoreER.Immunefunctiontestsforhazardidentification:a paradigmshiftindrugdevelopmentEJ].BasicClinPharmaco1Toxicol,2006,98(4):331—35.中国药事2011年第25卷第7期709eofSRBCantibodyresponseforimmunotox icitytestingLJ].Methods,2007,41(1):9-19.[3]GoreER,GowerJ,KuraliE,eta1.Primaryantibodyre—sponsetokeyholelimpethemocyanininratasamodelforim munotoxicityevaluationEJ].Toxicology,2004197(1): 23—35.[4]TempleL,KawabataTT,MunsonAE,parison ofELISAandplaque—formingcel1assaysformeasuringthe humoralimmuneresponsetoSRBCinratsandmicetreated withbenzo_J](pyreneorcyclophosphamide)FundamAppl Toxico1,1993,21:412—419.[5]IcH:S8(Step5)ImmunotoxicityStudiesForHumanPhar maceuticalsEs].2006:1—11.E6]PiccottiJR.TcelldependentantibodyresponsetestsI-M].//HerzykDJandBussiereJ.ImmunotoxicologyStrategies ForPharmaceuticalSafetyAssessment.JohnWiley&.Sons. Inc.,Hoboken,NewJersey,2008:6776.[7]FDA:GuidanceforIndustry-ImmunotoxicologyEvaluationof Investigationa1NewDrugsEs].2002:138.E8]whiteKIJr,ShethCM,parisonofpri—maryimmuneresponsestoSRBCandKIHinrodents_J].J Immunotoxicol,2007,4(2):153—8.[9]Finco—KentD,KawabataTT.Developmentandvalidationof acanineT—'cell—dependentantibodyresponsemodelforimmu—_ notoxicityevaluationlJ].JImmunotoxicol,2005,2(4): 197—201.[1O]SoosJM,PolskyRM.KeeganSP,eta1.Identificationofnat1JraIantibodiestointer】eLlkin18intheseraofnorn2a】hu—mansandthreenonhumanprimatespecies_J].ClinImmu—nol,2003,109(2):18896.HaggertyHG.Immunotoxieitytestinginnon-rodentspe—cies[J].JImmunotoxicol,2007,4(2):165—9.LisaMP,DanutaJH.TheTdependentantibodyresponse tokeyholelimpethemocyanininrodents[J].MethodsMolBiol,2010,598;159—71.Grote-WesselsS,FringsW,SmithCA,eta1.Immunotox—icitytestinginnonhumanprimatesEJ].MethodsMolBiol,2010,598:341—59.RomanD,UlrichP,PaulG,eta1.Determinationofthe effectofcalcineurininhibitorsontheratsimmunesystem afterKLHimmunisation[J].ToxicolLett,149(1—3):133—40.PiccottiJR,AlveyJD,ReindelJF,eta1.Tcell—depend—entantibodyresponse:assaydevelopmentincynomolgusmonkeysrJ].JImmunotoxicol,2005,2(4):191—6.DescotesJ.Methodsofevaluatingimmunotoxicity[J] ExpertOpinDrugMetabToxico1,2006,2(2):249—59.LadicsGS,SmithC,HeapsK,eta1.Possibleincorpora—tionofanimmunotoxicologicalfunctionalassayforassessing humoralimmunityforhazardidentificationpurposesinrats onstandardtoxicologystudy[J].Toxicology,1995,96(3):225—38.KushimaK,OdaK,SakumaS,eta1.Effectofprenata1ad—ministrationofNSAIDsontheimmuneresponseinjuvenileandadultrats[J].Toxicology,2007,232(3):257—67.国家食品药品监督管理局要求做好贯彻落实《药品不良反应报告和监测管理办法》工作新修订的《药品不良反应报告和监测管理办法》(以下简称《办法》)(卫生部令第81号)已经卫生部发布,自2011—07一o1起施行.为做好学习,贯彻和落实工作,日前,国家食品药品监督管理局就有关事宜发出通知.通知强调,各级食品药品监督管理部门和卫生行政部门要高度重视《办法》的贯彻落实工作,充分认识药品不良反应监测工作在保障公众用药安全中的重要性,并按照《办法》要求,加强对药品不良反应报告和监测工作的领导,促进基层药品不良反应监测机构和监测能力建设,推动基层药品不良反应报告与监测工作的深人开展,提高药品不良反应报告和监测的管理水平;要加强协调与合作,不断建立健全药品不良反应监测处置联合工作机制,加强沟通和信息交流,强化药品群体不良事件的报告,调查,处理等工作,及时控制药品群体不良事件,保证公众用药安全.通知明确,各级食品药品监督管理部门要按照《办法》和医改相关要求,加强药品不良反应报告与监测体系建设,进一步完善药品不良反应监测体系.各级药品不良反应监测机构要配备专业技术人员,保障工作条件,确保药品不良反应监测工作顺利开展,要特别做好基本药物的不良反应监测工作.各级食品药品监督管理部门应加强信息化建设,做好药品不良反应监测网络系统的改造和升级工作,加强网络系统的应用,维护与管理.通知指出,各级食品药品监督管理部门和卫生行政部门要加大监督检查力度,督促药品生产,经营企业和医疗机构加强药品不良反应监测工作,主动监测,报告,分析和评价药品不良反应,特别是药品生产企业应主动开展药品重点监测,积极采取风险管理措施控制药品风险.国家食品药品监督管理局将组织制定药品不良反应重点监测相关技术指导原则,指导重点监测工作的开展.疑似预防接种异常反应是药品不良反应报告和监测的重要内容,必须给予高度重视.妇幻朝阳刀口口口口I=l口。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
一、基本原理
本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL，然后再进行细胞毒试验。
其原理为：外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性CTL克隆，在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后，能识别该抗原的T细胞克隆被选择性激活、增殖，而其他T细胞克隆则逐渐死亡；经3~4次刺激后，存活的均为识别特异性MHC/抗原肽复合物的细胞，即抗原特异性CTL 。
二、试剂及材料
1. 丝裂霉素C（Sigma）：用培养液或PBS配制300μg/ml。
2. 含20%的新生牛血清的RPMI 1640
3. EB病毒转化的B淋巴母细胞株
三、操作方法
1. 特异性CTL的诱导和制备
①取作者外周血分离PBMC，无血清1640洗两遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640调成1.5×106 /ml，置于24孔板中，于5% CO2 培养箱中4小时使单核细胞贴壁以去除之，然后收集细胞，计数；
②取EB病毒转化的B淋巴母细胞，加入丝裂霉素C，最终浓度为30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀细胞用1640液洗涤3次并计数；
③取2×106 个PBL于24孔板中，加入5×104 （2.5%）个经丝裂霉素C处理（30mg/ml、30min）的自身、同种异体（其HLA-I类型别完全不同）的EBV-LCL细胞作为刺激细胞，混匀，用完全培养基（RPMI 1640）补总体积至2ml；
④静置于培养箱中；4d后半量换液，继续培养3d；
⑤离心收集细胞，取1×106 个反应细胞，加入2×105个（20%）的刺激细胞，第三天加入重组IL-2，使终浓度为30U/ml；每三天半量换液一次并维持相同IL-2浓度。
⑥每周按相同程序刺激效应细胞一次，3~4次后，效应细胞即为特异性CTL，可用于杀伤实验。
2. 细胞毒试验
检测CTL细胞毒作用均可采用检测NK细胞杀伤活性的方法，仅效靶细胞比例不一样，现将LDH释放法简要叙述如下：
①靶细胞为用作刺激细胞的自身或同种异体EBV-LCL细胞，调成1×105/ml；
②效应细胞为上述诱导的特异性CTL，调成2.5×106/ml；
③各取0.1ml于96孔板中（效/靶比值为25:1）；轻轻吹打，使二者混匀；同时设靶细胞自然释放对照组（即只加靶细胞而不加效应细胞）和最大释放对照组（0.1ml靶细胞和0.1ml 1% NP-40）；
④1000rpm/min离心2min后，置37°C、5% CO2 培养箱中孵育4hr
⑤酶促显色反应：参见“NK细胞杀伤实验”。