高效液相色谱法基本原理共27页
高效液相色谱HPLC基本原理
4）安培检测器 由恒电位仪和一薄层反应 池（体积为 1~5L ）组成。如 图。 该检测器是利用待测物流 入反应池时在工作电极表面发 生氧化或还原反应，两电极间 就有电流通过，此电流大小与 待测物浓度成正比。 采用安培检测器时，流动 相必须含有电解质，且呈化学
塑料块 Teflon 接参比电极 和对电极 接色谱柱
Inject
To Waste
To Column Sample Loop (Fixed Volume) To Column From Pump
From Pump
2）自动进样器
工作原理
3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。
柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱 柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：
果有两个或以上泵，调节各自的流量，在 高压下混合。
低压梯度
高压梯度
2. 进样系统
进样装置包括两种： 1）手动进样器：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制， 因此进样准确，重复性好，如图。
装入样品 采样环
进样
进色谱柱 泵入溶剂
出口
手动进样器－六通阀
Load
Sample Syringe To Waste
2） HPLC与GC的比较
分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物 质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不 稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运 载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合， 可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定 相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来 控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
高效液相色谱法基本原理 PPT
反相色谱法的分离机理1
疏溶剂理论：
当溶质分子进入极性流动相后,即占 据流动相中相应的空间，而排挤一部分 溶剂分子；
当溶质分子被流动相推动和固定相接 触时，溶质分子的非极性部分或非极性 分子）会将非极性固定相上附着的溶剂 膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷 基官能团相结合（吸附）形成缔合物， 构成单分子吸附层；
• 小分子量的化合物可以进入孔中， 滞留时间长；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。
• 常用于分离高分子化合物，如组织 提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
色谱类型选择
正确地选择色谱类型 尽可能多的了解样品性质 化学结构 极性和稳定程度 水中和有机溶剂中溶解度 相对分子质量的大小 熟悉各种色谱类型主要特点应用范围
树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换而分离。
应用 离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离 的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
分析物质 有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
凝胶色谱法实例
凝胶色谱（分子排阻色谱法） 油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定？
色谱柱：150mm×46mm 固定相：二醇基键合相，孔径200A，粒径5um 流动相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4
1-聚丙烯酰胺 2-原油+石油磺酸盐+氯化钠
凝胶色谱分离机理
凝胶色谱：（分子排阻色谱法）
分离机理 凝胶色谱分离示意图
• 以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于 分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要 大得多。
液相色谱分析法模块之
任务5 高效液相色谱法 分离原理
能力目标
理解已知分析方法中采用的色谱类型 能够正确解释色谱分离过程 能够根据组分性质选择合适的色谱类型
高效液相色谱仪工作原理
高效液相色谱仪工作原理高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于实验室中的分析仪器，它通过分离复杂样品中的化学成分，并用于定量和定性分析。
本文将介绍HPLC的工作原理，包括其基本组成部分、样品处理和分析过程。
一、HPLC的基本组成部分HPLC主要由以下几个基本组成部分构成：流动相系统、进样系统、色谱柱和检测器。
1. 流动相系统：流动相是指在色谱柱中流动的溶液，它由溶剂和缓冲液组成。
溶剂起到溶解样品和推动流动的作用，而缓冲液则用于控制流动相的pH值和离子强度。
2. 进样系统：进样系统用于将待分析的样品引入色谱柱中。
常见的进样方式有自动进样器和手动进样器两种。
3. 色谱柱：色谱柱是分离和分析样品的关键部分。
它通常由含有吸附剂或离子交换树脂的管状介质构成，样品分离通过溶液在色谱柱中的传递来实现。
4. 检测器：检测器用于监测从色谱柱中流出的化合物。
常见的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
二、HPLC的样品处理和分析过程HPLC的样品处理和分析过程一般包括以下几个步骤：前处理、样品进样、色谱分离和检测。
1. 前处理：前处理主要是将待分析的样品净化和浓缩，以去除杂质和提高分析灵敏度。
常见的前处理方法包括固相萃取、液液萃取、净化柱等。
2. 样品进样：进样是将处理过的样品引入进样系统的过程。
样品进样的方式有自动进样和手动进样两种。
自动进样器可以实现多个样品的连续进样，提高工作效率。
3. 色谱分离：色谱分离是HPLC的核心步骤，通过样品在色谱柱中的分配系数差异来实现样品分离。
不同的色谱柱和流动相的选择可实现对不同化合物的分离。
4. 检测：检测器用于监测从色谱柱中流出的化合物，获取它们的信号。
不同的检测器根据其原理和应用场景选择，从而实现对不同样品的定性和定量分析。
三、HPLC的分析应用HPLC在各个领域广泛应用于化学分析和质量控制。
高效液相色谱HPLC基本原理
色谱柱的温度控制：优化色谱柱的 温度提高分离效率
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
色谱柱的维护：定期清洗和维护色 谱柱保证其性能稳定
色谱柱的填充：优化色谱柱的填充 方式提高分离效果
流动相的组成：有机溶剂和水
流动相的选择原则：根据样品性质和检测器类型选择
流动相的优化方法：通过改变有机溶剂和水的比例、改变有机溶剂的种类、改变有机 溶剂的浓度等方法进行优化
流动相的优化效果：提高分离效果、提高检测灵敏度、降低检测时间等
固定相的选择： 根据样品性质 和分离要求选 择合适的固定
相
固定相的粒径： 粒径越小分离 效果越好但会 增加压力和延
长分析时间
固定相的表面 处理：表面处 理可以提高固 定相的稳定性
和选择性
固定相的填充： 填充方式会影 响柱效和分离 效果常用的填 充方式有轴向 填充、径向填 充和螺旋填充
汇报人：
智能化：I技术在HPLC中的应用提 高分析效率和准确性
高通量：高通量HPLC技术的发展提 高分析速度和通量
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
微型绿色环保：环保型HPLC技术的发展 降低对环境的影响和污染
气相色谱-质 谱联用：提高 检测灵敏度和
准确性
样品采集：选择合适的样品采 集方法如抽样、取样等
样品预处理：对样品进行预处 理如过滤、离心、稀释等
样品保存：选择合适的样品保 存方法如冷藏、冷冻等
样品分析：对样品进行分析如 定性、定量等
进样器选择：根据样品性质 和实验要求选择合适的进样 器
样品准备：选择合适的样品 进行适当的处理和稀释
进样操作：将样品注入进样 器确保样品完全进入色谱柱
高效液相色谱HPLC基本原理ppt课件
完整版PPT课件
38
完整版PPT课件
39
3）示差折光检测器
原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束 （通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两 束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录， 该信号代表样品的浓度。
为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温 度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF 等。 填充方法：
填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中， 然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要 求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
完整版PPT课件
22
完整版PPT课件
23
3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱 柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：
即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的 匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法：
Deuterium lamp
Lens
Lens system Holmium filter Detector cell
Optical slit
完整版PPT课件
Diode Array
Grating 33
Time msec
LIGH T
PHOTODIOD E
Wavelength nm
手性高效液相色谱法
3.配基交换型手性添加剂
配基交换原理：
在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位 体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其 形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。
常用的手性配合试剂：氨基酸及其衍生物 如L-苯丙氨酸，L-脯氨酸等配位金属有Cu2+、
Zn2+、Ni2+、Cd2+等。
第17页/共27页
应用实例
手性衍生化HPLC测定血浆中艾司洛 尔及其代谢物对映体
色谱柱：Aglient Zorbax C18 （250mm×4.6mm，5μm） 流动相：乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲 盐（55:45，用磷酸调pH至4.5） 流速：0.75 ml/min 检测波长：224nm 进样量：20μl 柱温：室温
第13页/共27页
环糊精分类-根据空腔大小 α-环状糊精 适合于分子量小的药物对映体分析 β-环糊精 适合于多数对映体的位阻和电子特征 γ-环糊精 适合于较大分子药物的对映体分析
第14页/共27页
2.手性离子对色谱法
一类分离可解离对映体的离子对色谱法，已成功分离了β-氨基醇类、氨基醇类、胺 类等对映体化合物。
第8页/共27页
手性HPLC法
直接法和间接法异同点 均以现代色谱分离技术为基础，引入手性
环境(不对称中心)，使药物对映体间呈现理化 性质的差异而实现分离，不同的是间接法是将 其引入分子内，而直接发引入分子间。
第9页/共27页
手性衍生化试剂法
对映异构体与手性试剂反应，产生相应的非对 映异构体
(R)
传统的拆分方法为非色谱法： 如分步结晶法，具有很大的局限性，操作过程繁复、耗时，难于进行微量分离和
测定。 大多采用色谱法：
高效液相色谱仪的原理及应用课件
四、正相高效液相色谱
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动 相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是 改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正 己烷。吸附色谱也属正相HPLC。 溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加 而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时 间越长。
第二节 高效液相色谱仪的组成
Agilent 1100
流速：2mL／min。 二、液相色谱中常用术语和参数
进样器
A 泵 μL/min~几千mL/min
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。
色谱柱 柱温箱
色谱柱：50cm 2.
硅氧碳键型： ≡Si—O—C
B 浓度 C18色谱柱
十八烷基硅基化学键合
3）流动相pH使用范围为2～7.
（薄壳型微珠担体） 使流动相流量精确和稳定
一 高效液相色谱仪系统 然后，分别测量各个色谱的峰面积。
使流动相流量精确和稳定 早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；
进样口
1.输液系 流 速：1.
色谱柱：50cm 2. 超声波除气泡
统 高压泵 (2) 标准曲线的绘制 用微量注射器准确吸取每1mL含1μg的苯并芘标准溶液1、2、3、4、5uL按照上述实验条件进行操作，以获得相应
应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
废液
(2)检测器：荧光检测器，激发波长369nm，荧光波长405nm。
通常使用耐高压的六通阀进样装置：
1、输液系统
贮液装置 脱气装置 高压输液泵 梯度淋洗系统
输液系统的功能: 1.提供足够的驱动力使流动相通过填充柱 2.使流动相流量精确和稳定 3.使流动相组成精确
ODS柱的使用注意点：
分析化学高效液相色谱法
分析化学高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种分离和测定化学物质的重要分析方法，具有高分离效率、高灵敏度、宽线性范围和广泛的应用范围等优点。
下面将从仪器原理、工作原理和应用等方面对HPLC进行详细分析。
一、仪器原理：HPLC仪器主要由溶剂系统、进样器、柱温箱、液相分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
1.溶剂系统：通常采用双头柱泵供应稳定的流动相。
溶剂通过比例调节阀混合形成所需的溶剂混合物。
2.进样器：它将少量的样品溶液注入到流动相中，通常使用自动进样器进行样品进样。
3.柱温箱：控制流动相的温度，以提高分离的效果。
柱温一般在室温到高温之间进行控制。
4.液相分离柱：是HPLC的核心部分，其中填充有液相固定相。
根据不同的分析目标和样品性质，可以选择不同类型的液相柱，如反相色谱柱、离子交换柱等。
5.检测器：常见的检测器有紫外-可见光谱检测器（UV-VIS）、荧光检测器、折射率检测器等。
根据不同化学物质的性质和要求，可以选择不同的检测器。
6.数据处理系统：包括记录和处理仪器所得到的信号。
常见的数据处理系统有计算机数据采集系统，可以进行数据的分析和处理，生成相应的色谱图。
二、工作原理：HPLC通过运用固定相与移动相之间的亲疏水性差异来实现化学物质的分离。
样品在液相中与固定相发生相互作用，不同化合物的相互作用程度不同，因此在液相中呈现出不同的流动速度。
根据样品分离的顺序，不同的化合物在一定时间内通过液相分离柱，进而被检测器检测到。
HPLC中的流动相一般由溶剂和缓冲液组成，并通过色谱柱中的固定相将待测试的物质分离开来。
其中，缓冲液（通常称为背后电解质）可以调节流动相的pH值，改变待测试物质的性质，从而影响其分离。
三、应用：HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全和生化分析等领域。
1.药物分析：HPLC可以用于药物分析中，以检测药物的含量、纯度和杂质成分。
药物的测定可以通过校准曲线来进行分析。
2.环境检测：HPLC可以用于环境监测中，例如水质分析、大气污染物分析等。