人脂肪组织细胞外基质支架的构建
去细胞心脏支架的制备和鉴定
华中科技大学硕士学位论文去细胞心脏支架的制备和鉴定姓名：***申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：***2010-12-28去细胞心脏支架的制备与鉴定摘要背景心血管疾病已成为全球死亡率最高的疾病之一，心力衰竭是各种心血管疾病的终末期。
传统治疗方法主要有药物治疗、外科治疗和介人治疗等，都不能达到根治的程度，只能在一定程度上缓解心力衰竭的发生或症状，唯一能够根治心力衰竭的方法是进行心脏移植。
但是心脏移植术后的免疫排斥反应及其并发症是导致术后患者死亡的主要原因。
此外用于手术的供体短缺是长久以来限制心脏移植的进行和发展的另一重要因素。
当今，组织工程学进行了一系列的研究，以获得用于心脏移植手术的人工生物替代品。
研究探讨了多种聚合物以及天然生物材料，其中去细胞化材料具有低免疫原性，良好的组织相容性，促进细胞黏附、增殖等优点，是目前最具有研究前景的生物材料。
在组织工程技术和再生医学研究中,去细胞生物支架材料如心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、腱膜、韧带、小肠粘膜下组织、膀胱和肝脏,已经进入临床前期动物实验或临床治疗阶段。
目的：本文旨在利用去污剂在Langendorff灌流装置上进行主动脉逆行性灌流以制备去细胞心脏支架，并对该生物支架进行初步鉴定，为下一步结合种子细胞进行人工心脏构建提供实验数据。
方法：1.成年雄性SD大鼠，通过腹腔注射进行全身肝素化。
10%水合氯醛麻醉后正中胸骨切开术打开胸腔，除去胸骨后脂肪体，解剖分离升主动脉及分支血管。
结扎其分支血管，从胸腔取出心脏置于冰的肝素PBS中。
预先准备的主动脉插管插入升主动脉进行逆行性冠脉灌注。
首先用含有10uM腺苷的肝素PBS在77.4mmHg动脉灌注压下灌注15分钟，然后使用1％十二烷基硫酸钠灌流12-20小时至心脏成乳白色囊状物，接着用去离子水灌注15分钟，用1％Triton- X100灌注30分钟，最后用含有抗生素PBS灌注2小时。
2.对去细胞心脏支架进行固定，按照常规处理后进行H&E组织学染色，免疫荧光染色等初步鉴定。
脂肪原型细胞基质胶(ecm、svf-gel)
自体脂肪1.0时代
现在回头看看，由周哲男博士首创的 自体脂肪移植术被成为了传统自体脂 肪移植术，这项技术依然有相当多的 医生在使用，仍有很多方面属于未知， 其效果可预期性还不够理想。传统自 体脂肪移植术可以说是自体脂肪移植 术的1.0时代，那时候做这项手术的患 者诉求基本是以容积填充为主，例如 丰胸、丰臀，中老年人面部老化萎缩 （面部组织干瘪）后也会使用自体脂 肪移植填充面部，达到面部年轻化的 效果。
富的脂肪干细胞，所以其自身也可用于干细胞疗法方面的应用。 • 2：SVF-gel移植和比单纯的脂肪移植优点在哪里？ • SVF-gel比脂肪移植的最大优点就是成活率要高30％以上，但优点不只是成活率更高。不仅仅是更高，我们做到的是成活率更高，而且附加的各种让人心动的效应
更好，主要有以下几大优势 • ①比单纯脂肪的成活率高出30％ • ②可以增加皮肤胶原蛋白的合成，让皮肤更加红润，光泽度增高 • ③术后肿胀程度相对单纯脂肪填充减轻70％，恢复期缩短到一周 • ④对部分类型黑眼圈、局部创伤后疤痕、植皮后皮肤色差问题、手背部位老化等等问题的也有治疗作用 • ⑤因脂肪干细胞比例较普通脂肪高出6倍甚至更高（取决于个人脂肪质量），所以能够起到维持时间更长的整体面部年轻化作用，对于皮肤局部的细纹有显著改善
QA
• 5：什么是SVF-gel真皮填充焕肤术？ • 直观的来说，就是通过细针把SVF-gel直接送达可以直接改善肤质的层次---真皮层，脂肪干细胞
脱细胞脂肪组织制备：能否成为异体注射或原位成脂的软组织填充物
脱细胞脂肪组织制备：能否成为异体注射或原位成脂的软组织填充物 ·综述·
聂佳莹，易阳艳，朱元正(南昌大学第二附属医院整形美容科，江西省南昌市 330006)
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2213
摘要 背景：通过脱细胞脂肪组织构建无种子细胞的组织工程脂肪为当前软组织填充的研究热点。 目的：探讨近年来脱细胞脂肪组织的制备方法对其移植后诱导脂肪再生效果的影响，并展望其临床应用前景。 方法：检索 1971 年 1 月至 2018 年 12 月 PubMed 数据、Elsevier 数据库相关文献，英文检索词为“adipose tissue engineering；adipose tissue extracellular matrix；soft tissue repair；angiogenesis；adipogenic induction”。阅读近年国内外与脱细胞脂肪组织制备和移植相关的文献，从脱细胞脂肪组织制备方法的改良， 交联细胞因子和生物材料等方面进行总结归纳。 结果与结论：当前研究表明，脂肪组织细胞外基质可作为软组织填充的理想支架材料，植入皮下可募集宿主 干细胞并诱导期增殖和成脂分化。但现有的脱细胞方案会导致细胞外基质蛋白和结构的损失，这极大的影响 了脱细胞脂肪组织植入体内的脂肪再生能力，但通过超临界二氧化碳设备脱油、机械力预处理、交联细胞因 子或生物材料等手段可以减少脱细胞脂肪组织制备过程中细胞外基质蛋白的损失和或补充具有促进组织再生 功能的蛋白，最终提高脱细胞脂肪组织移植后的血管和脂肪新生能力。脱细胞脂肪组织由于其天然的成脂诱 导能力，在脂肪组织工程中具有强大的应用前景，若能克服其制备流程中细胞外基质蛋白损耗或在安全可控 的前提下，有望成为可异体注射并原位成脂的理想软组织填充物。 关键词： 脂肪组织工程；脂肪组织细胞外基质；软组织修复；血管新生；成脂诱导 中图分类号：R446；R496；R318 基金资助： 国家自然科学基金资助项目(81660326)，项目负责人：易阳艳；江西省自然科学基金资助项目(20171ACB20037)， 项目负责人：易阳艳
人体结缔组织的概念
人体结缔组织是人体内一种重要的细胞外基质，它由不同类型的细胞和大量的细胞外基质组成。
结缔组织在人体中分布广泛，包括皮肤、骨骼、肌肉、血管、淋巴管、神经等各个系统。
结缔组织的主要功能是支持、保护、连接和营养细胞，同时也是维持人体生理功能的关键环节。
本文将对结缔组织的概念、分类、结构和功能进行详细介绍。
一、结缔组织的概念结缔组织是一种由细胞和细胞外基质组成的特殊结构，它们共同构成了人体的支架系统。
结缔组织中的细胞主要包括成纤维细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞等，这些细胞通过分泌细胞外基质来维持组织的形态和功能。
细胞外基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等大分子物质组成，它们具有很强的抗拉性和弹性，能够承受很大的应力。
二、结缔组织的分类根据结缔组织的功能和结构特点，可以将其分为以下几类：1. 疏松结缔组织：疏松结缔组织主要分布在皮肤、肌肉、内脏器官等处，其特点是细胞分布稀疏，细胞外基质丰富。
疏松结缔组织的主要功能是支持和保护细胞，同时也参与免疫反应和物质运输。
2. 致密结缔组织：致密结缔组织主要分布在骨骼、牙齿、韧带等处，其特点是细胞分布紧密，细胞外基质较少。
致密结缔组织的主要功能是提供支撑力和保护性，同时也参与物质的储存和释放。
3. 网状结缔组织：网状结缔组织主要分布在肝脏、脾脏等内脏器官，其特点是细胞分布呈网状，细胞外基质丰富。
网状结缔组织的主要功能是支持和保护细胞，同时也参与免疫反应和物质运输。
4. 脂肪组织：脂肪组织是一种以脂肪细胞为主的结缔组织，主要分布在皮下、腹腔等处。
脂肪组织的主要功能是储存能量和保护内脏器官，同时也参与体温调节和物质代谢。
三、结缔组织的结构和功能1. 结构：结缔组织的细胞主要分布在细胞外基质中，细胞之间通过紧密连接和间隙连接相互联系。
细胞外基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等大分子物质组成，它们具有很强的抗拉性和弹性，能够承受很大的应力。
2. 功能：结缔组织的主要功能是支持、保护、连接和营养细胞，同时也是维持人体生理功能的关键环节。
负载BMP-2组织工程骨修复骨缺损的研究进展
负载BMP-2组织工程骨修复骨缺损的研究进展符来想【摘要】组织工程骨修复骨缺损是当前研究的热点.骨形态发生蛋白(BMP)具有强大的促成骨活性,能够诱导间充质细胞不可逆地分化为骨、软骨组织;BMP-2是成骨能力最强的BMP之一,目前已被广泛应用于骨组织工程领域,并且展现出良好的应用前景.在此分析了近年来BMP-2在骨组织工程中应用研究的文献,概述国际上关于负载BMP-2组织工程骨研究现状及临床应用进展.%Repairing bone defects using tissue engineered bone has become a hot spot. There is a strong osteomductive potentiality in bone morphogenetio protem( BMP ), which could induce the irreversible differentiation of mesenchymal cells into bone and cartilage. BMP-2 is one of BMPs with the most osteoinductive potentiality, which has been widely used in the bone tissue engineering presenting an excellent application prospect. Here reviews literatures published in recent years on the application of BMP-2 in bone tissue engineering , and summarizes the research progress and clinical applications of repairing bone defects with BMP-2 loaded tissue engineered bone.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2013(019)004【总页数】4页(P590-593)【关键词】骨形态发生蛋白2;组织工程骨;骨缺损【作者】符来想【作者单位】中国人民解放军第一零五医院骨一科,合肥,230031【正文语种】中文【中图分类】R68骨缺损的修复一直是骨科领域的一大难题。
组织工程在软组织再生中的新探索
组织工程在软组织再生中的新探索在医学领域，软组织损伤和缺失一直是困扰医生和患者的难题。
传统的治疗方法往往效果有限，且可能伴随着诸多并发症。
然而，随着组织工程技术的不断发展，为软组织再生带来了新的希望。
软组织是指人体中除骨骼、软骨和实质器官外的组织，如肌肉、肌腱、韧带、皮肤、脂肪等。
这些组织在维持身体结构和功能方面发挥着至关重要的作用。
当软组织受到损伤或缺失时，会严重影响身体的正常功能和生活质量。
例如，大面积的皮肤烧伤可能导致严重的感染和瘢痕形成，肌肉或肌腱的损伤可能影响运动能力，脂肪组织的缺失可能导致外观畸形等。
组织工程是一门结合了生物学、工程学和医学的交叉学科，其目的是构建具有生物活性和功能的组织替代物，以修复或重建受损的组织和器官。
在软组织再生方面，组织工程主要通过三个关键要素来实现：细胞、生物材料支架和生物活性因子。
细胞是组织工程的基础。
在软组织再生中，通常使用的细胞包括成纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞等。
这些细胞可以从患者自身的组织中获取，经过分离、培养和扩增后，用于构建组织替代物。
使用患者自身的细胞可以减少免疫排斥反应的发生，提高治疗的成功率。
生物材料支架为细胞的生长和分化提供了支撑和引导。
理想的支架材料应具有良好的生物相容性、生物可降解性、合适的孔隙结构和机械性能。
目前，常用的支架材料包括天然材料（如胶原蛋白、透明质酸等）和合成材料（如聚乳酸、聚乙醇酸等）。
通过对支架材料的结构和性能进行优化，可以更好地模拟体内的细胞外基质环境，促进细胞的黏附、增殖和分化。
生物活性因子可以调节细胞的行为和功能，促进组织的再生和修复。
在软组织再生中，常用的生物活性因子包括生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等）、细胞因子（如白细胞介素、肿瘤坏死因子等）和激素（如胰岛素、甲状腺素等）。
这些因子可以通过直接添加到支架材料中或由基因工程技术改造的细胞分泌来发挥作用。
近年来，组织工程在软组织再生方面取得了许多新的探索和突破。
一种用于肌肉修复的再生材料及其制备方法
一种用于肌肉修复的再生材料及其制备方法
一种用于肌肉修复的再生材料是基于细胞外基质（ECM）的材料。
制备方法包括以下几个步骤：
1. 选择合适的组织来源，如脂肪组织、肌肉组织等。
这些组织具有丰富的ECM成分。
2. 将组织切割成小块，去除其中的细胞，保留ECM。
可以使用酶处理来去除细胞。
3. 对去细胞的组织进行低温冻干处理，以去除水分，并保持ECM的完整性。
4. 将冻干的ECM粉末进行粉碎，得到均匀的颗粒。
5. 将粉碎后的ECM颗粒进行消毒处理，以去除潜在的微生物污染。
6. 将消毒后的ECM颗粒进行密封包装，以确保其在使用时的无菌性。
7. 在肌肉修复时，将ECM颗粒与患处接触，利用其生物相容性和组织诱导功能，促进肌肉组织的再生和修复。
此种再生材料的制备方法简单高效，并且具有生物相容性和生物活性，适用于肌肉修复等组织工程领域。
再生材料中的
ECM可以提供支架和信号分子，促进患处的细胞增殖、分化和重建，从而达到肌肉修复的效果。
人脂肪组织基质血管组分的分离培养
人脂肪组织基质血管组分的分离培养作者：庄伟, 谢良地, 黄杰, 许昌声【关键词】脂肪组织; 细胞外基质；细胞,培养的ABSTRACT: Objective To establish a method for the isolation and culture of stromal vascular fraction(SVF) of human adipose tissue in vitro, which has the characteristics of stem cells. Methods Normal human abdominal subcutaneous adipose tissue was digested with collagenase Ⅰand precipitated by centrifuge. The lowest layer cells were suspended and cultured with DMEM F12. Immunofluorescence assay was used to determine the presence of the surface molecule marker CD31 and CD34. Results Immunofluorescence assay showed that about 70％ of the 2nd generation of cultured SVF cells were CD34 positive, but CD31 negative. Conclusion A rapid reproducible method was set up for the isolation and culture of SVF with the characteristics of stem cells from human adiposetissue, which possess clinical and research implication of stem cells.KEY WORDS: adipose tissue; extracellular matrix; cells, cultured传统的干细胞多取材于胚胎、骨髓和脐血,在伦理和供体来源方面受到一定限制。
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５５・
实验论著・
人脂肪组织细胞外基质支架的构建
察鹏飞 高建华 陈阳
鲁峰
【摘要】
目的探讨从人脂肪组织中提取细胞外基质并构建支架的方法，研究其结构特点，分 收集抽脂术患者的脂肪组织，共７例，每例约３１０
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Ｊ．ｉｓｓｎ．１００９４５９８．２０１２．０１．０１４ 广州，南方医科大学南方医院整形外科
作者单位：５１０５１５
通信作者：高建华，Ｅｍａｉｌ：ｇａｏｐｓｎｆ＠ｇｕａｎｇｚｈｏｕ．ｇｄ．ａｎ
万方数据
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０００ ｒ／
ｍｉｎ离心３ ｍｉｎ，去除上层的游离脂滴及下层的水 分，收集纯脂肪组织约１００ ｍｌ。共重复７次。向收 集的脂肪组织中按脂肪：水分＝２：１的比例加入５０ ｍｌ蒸馏水，转移至匀浆机（ＪＪ－２Ｂ型），１０
１２ ０００ ０００— ０００
ｒ／ｍｉｎ匀浆３ ｍｉｎ，将匀浆后的混合物３
ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ。去除上层的游离脂滴及中层的
到脂肪来源干细胞和细胞外基质粉末。脂肪来源干细胞具有成脂、成软骨和成骨分化的能力；扫描 电镜观察细胞外基质粉末具有多孔、粗糙表面和光滑表面的结构。脂肪来源干细胞与支架粘附较
好；ＤｉＩ标记前、后细胞粘附率分别为（８８．８１±４．８１）％和（８６．４８±４．５８）％，两样本ｔ检验，Ｐ＝
０．３７１，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。荧光显微镜下脂肪来源干细胞在细胞外基质支架上生长状 态良好。结论人脂肪组织细胞外基质粉末容易获取，形状和颗粒体积具有高度的多样性，表面积 较大，有利于脂肪干细胞的粘附和增殖，可作为一种较理想的脂肪组织工程支架材料。
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Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐ”ｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ”ｐａｒａｔｉｏｎ
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ｐｏｗｅｒ日：Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ
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ｕｎｄｅｒｇｏｎｅｌｉｐｏｓｕｅｔｉｏｎ；ｂ：Ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ，ｔｈｅ ｕｎｄｅｄｙｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＥＣＭ，ｔｈｅ
ｍｌ，
析其作为脂肪组织工程支架的可行性。方法
１０
ｍｌ用来分离培养脂肪来源干细胞，３００ ｍｌ提取细胞外基质，并制备成粉末状，扫描电镜观察其表
面结构。ＤｉＩ荧光标记脂肪来源干细胞，统计荧光标记后细胞存活率；将荧光标记前、后的细胞与支
架粘附，检测其粘附率，所得数据用ＳＰＳＳ １３．０软件两样本ｔ检验进行统计学比较，分析标记前后细 胞粘附率有无差异；荧光显微镜下观察细胞在支架表面生长情况。结果 从人脂肪组织中提取得
供者无急、慢性疾病，均签署知情同意书。②主要试
剂：胎牛血清、ＤＭＥＭ培养基、ＰＢＳ和胰蛋白酶均为 美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司产品；Ｉ型胶原酶和红细胞裂解 液为美国Ｓｉｇｍａ公司产品。③耗材：１５
ｍｌ及５０ ｍｌ
蒸馏水，底层乳白色的沉淀物即为ＥＣＭ。加入同等 体积的蒸馏水洗涤３—５次，将脂滴去除干净。收集
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图１。
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田Ｉ脂肪组织细胞外基质（ＥＣＭ）粉末提取流程＾：抽脂术中得到的人脂肪组织；ｂ：离心纯化脂肪组织，上层为游离脂滴．中层为脂 肪组织．底层为血液和膨胀液成分；ｃ：匀浆后的脂肪组织；ｄ：洗涤纯化ＥＣＭ．上层为游离脂滴，中层为蒸馏水，底层为ＥＣＭ；ｅ：纯化得 到乳白色凝胶状的ＥＣＭ；ｆ：冻干粉碎后得到的ＥＣＭ糟末
ＥＣＭ，约１０ ｍＩ，离心后，去除上层的水分。一２０℃
冰箱冷冻过夜，低温冻干机冻干４８ ｈ，此时的ＥＣＭ 呈球状、疏松、多孔的结构。将球状的ＥＣＭ放人匀 浆机。１２
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尖底离心管、１００ ｍｍ培养皿、一次性３ ｍｌ吸管、２５ ｅｍ２培养瓶等均购自于美国Ｃｏｍｉｎｇ公司。 １．２方法 １．２．１脂肪来源干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ・ｄｅｒｉｖｅｄ
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【关键词】
组织工程；
脂肪组织；
脂肪来源干细胞；
细胞外基质；
支架
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｉｔｈ
ｈｕｍａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｆｒｏｍ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ
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Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １ ０５ １ ５，Ｃｈｉｎａ