血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取和分离
• 2．(2008年山东理综)科学家发现家蝇体内 存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有 极强的抗菌能力，受到研究者重视。 • (1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是 带电性质 、大小及形状 根据蛋白质分子的________ 迁移速度 不同而实现分 不同，在电场中的________ 离。 • (2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体 外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛 肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 碳源 和________ 氮源 ________ 。
㈡缓冲溶液
• ⒈作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基 本不变。 • ⒉组成：一般由缓冲物质对构成，调节缓冲物质的比例，可 得不同pH值的缓冲液 如：H2CO3 / NaHCO3 、NaH2PO4 / Na2HPO4 • ⒊作用机制：以H2CO3 / NaHCO3 为例 A：当酸性物质（如乳酸）进入后， 与溶液中的 NaHCO3 发生作用，生成乳酸钠和碳酸，而 碳酸可以分解成CO2和H2O，CO2排出则pH不变； B：当碱性物质（如碳酸钠）进入后， 与溶液中的H2CO3 发生作用，形成 NaHCO3 ，溶液pH不 变。 4.意义：准确模拟生物体内生理过程，必须保持反应溶液体 系的pH值基本不变。
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㈣血红蛋白
• 在红细胞的组成中，约 90%是血红蛋白。它由 四个肽链组成，包括两 个α—肽链和两个β—肽 链。每条肽链环绕一个 亚铁血红素基团，可携 带一分子氧或一分子二 氧化碳。血红蛋白因含 血红素而呈现红色。
血红蛋白占红细胞 湿重的34%，占干重的 90%。每个红细胞含 2.8亿个血红蛋白
有机溶剂
无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离
• 8.血红蛋白有什么特点？对蛋白质分离有何意义？ • 答：血红蛋白是有色蛋白，因此，在凝胶色谱分离 时，可以通过观察颜色，来判断什么时候应收集洗
脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简
化了实验操作。
凝胶色谱法的原理
十二烷基硫酸钠—能使蛋白质发生完全变性，它所带的电荷 远远大于蛋白质原有的电荷量，掩盖不同蛋白的电荷差异。
• 1.洗涤红细胞时，为何次数不能过少？ 答：无法除去血浆代白。 • 2.洗涤红细胞时，为何离心速度不能过高，时间不能 过长？ 答：会使白细胞等一同沉淀。 • 3.用沸水浴加热，是干燥的凝胶颗粒在洗涤液中膨胀 有什么好处？ 答：节约时间；除去颗粒中可能有的微生物；排除 空气。 • 4.向色谱柱中装填凝胶颗粒时，为何要紧密，不能有 气泡？ 答：降低颗粒之间的空隙；气泡会搅乱洗脱液中蛋 白质的洗涤次序，降低分离效果。
课题3
血红蛋白的提取和分离
一、基础知识： 1. 凝胶色谱 小分子，进入凝胶颗粒，路程长，运动慢； 法的原理 大分子，不4) 成分： 2.缓冲液 作用： 维持pH基本不变。
定义： 带电粒子在电场中的迁移。 分类： 琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
分离血红蛋白溶液 方法：2000r/min、 10min离心
粗分离 ——透析 ——磷酸缓冲液作透析液；除小分子杂质
凝胶色谱柱的制作 交联葡聚糖凝胶
一次性缓慢倒入色谱柱 纯化 凝胶色谱柱的装填 加磷酸缓冲液 （凝胶色谱操作） （洗涤平衡凝胶）
样品的加入与洗脱 ——看教材69页图5-22/21
纯度鉴定 —使用最多的— SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 5.凝胶色谱操作中，如果洗脱液流干，露出凝胶颗 粒，怎么办？ 答：重新装填。 • 6.如何判断色谱柱制作成功？ • 答：如果在洗脱液中，红色区带均匀一致地移动， 说明成功。 • 7.你能描述血红蛋白分离的完整的过程吗？
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白的分离和提取是一个复杂却又充满魅力的过程。
它不仅关乎科学，也与生命息息相关。
想象一下，血液中那闪烁的红色，仿佛在诉说着每一个细胞的故事。
血红蛋白，作为携氧的英雄，承担着生命的重任。
在这个过程中，首先要明确分离的目标。
你得知道，血红蛋白的结构并不是简单的。
它是由四个亚基构成的，每个亚基都有自己的个性。
比如，α亚基和β亚基之间的相互作用，就像朋友间的默契，缺一不可。
分离时，采用的方法多种多样，比如盐析、透析和色谱技术等。
盐析是个经典手法。
它就像是聚会时的筛子，把不必要的“嘉宾”排除在外。
加入盐后，蛋白质的溶解度变化，最终分离出你想要的血红蛋白。
接着透析，简单来说，就是用半透膜把小分子杂质过滤掉。
想象一下，你在海边捞水，想把沙子留在外面，只让清水流进桶里。
再来就是色谱技术，真的是个科学的魔法。
根据分子大小和亲和力，血红蛋白会在色谱柱中“走出”不同的轨迹。
你只需耐心等待，最终就能得到纯净的血红蛋白。
每一步都需要细致的观察和实验者的直觉，心态要稳。
接下来，提取的步骤也很重要。
提取后，血红蛋白会被溶解在缓冲液中。
这个缓冲液就像是血红蛋白的家，让它保持稳定。
记得在这一过程中，要控制好温度和pH值。
过高的温度会让血红蛋白变性，就像你把冰淇淋放在阳光下，瞬间化为一滩水。
从分离到提取，这一系列的操作需要技巧。
你得时刻保持警觉，观察每一个变化。
哪怕是微小的细节，都可能决定最终的结果。
每一个实验都是一次新发现，充满了期待和惊喜。
最后，谈谈收获。
提取到的血红蛋白可以用于多种研究，甚至是临床应用。
它帮助我们理解许多疾病，像贫血或氧合能力不足等。
科学的探索如同一场旅程，虽然艰辛，却能收获无数的知识和感动。
总之，血红蛋白的分离和提取是一个充满挑战的过程。
它需要耐心、技巧和对科学的热爱。
每一步都透着生命的力量。
通过这一过程，我们不仅了解了血红蛋白的奥秘，也感受到了科学的美妙与神奇。
探索的旅程从未止步，期待着下一次的发现与启迪。
《血红蛋白的提取和分离》 讲义
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、引言血红蛋白是人体内一种重要的蛋白质，它在氧气运输和二氧化碳代谢中发挥着关键作用。
对血红蛋白的提取和分离是生物化学和医学研究中的重要操作，有助于深入了解其结构与功能，为疾病诊断和治疗提供依据。
二、血红蛋白的基本性质血红蛋白是一种由珠蛋白和血红素组成的结合蛋白，相对分子质量约为 64500。
它在红细胞中含量丰富，每个红细胞中约含有 28 亿个血红蛋白分子。
血红蛋白的主要功能是携带氧气和二氧化碳，其与氧气的结合具有可逆性，在氧分压高的肺部结合氧气，在氧分压低的组织释放氧气。
三、提取血红蛋白的材料选择1、新鲜血液通常选用哺乳动物的新鲜血液，如猪、牛、羊等。
新鲜血液能保证血红蛋白的活性和完整性。
2、抗凝处理在采集血液时，需要加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，以防止血液凝固。
四、血红蛋白提取的原理1、离心分离利用不同物质的密度差异，通过离心的方式将红细胞从血浆等成分中分离出来。
2、渗透破碎将红细胞置于低渗溶液中，使红细胞吸水膨胀破裂，释放出血红蛋白。
五、血红蛋白提取的步骤1、采集血液使用无菌采血针和采血管采集适量的新鲜血液，并立即与抗凝剂混合均匀。
2、离心分离红细胞将血液以一定的转速离心一段时间，使红细胞沉淀在离心管底部，上层为血浆等成分。
小心吸取上层液体，留下红细胞沉淀。
3、洗涤红细胞用生理盐水多次洗涤红细胞，去除血浆蛋白等杂质。
4、红细胞的破裂将洗净的红细胞缓慢加入到低渗溶液中，搅拌均匀，放置一段时间，使红细胞破裂。
5、离心获取血红蛋白溶液再次离心，使细胞碎片等沉淀，上清液即为血红蛋白溶液。
六、血红蛋白的分离方法1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称分子筛色谱法。
其原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，小分子物质能进入凝胶颗粒内部，而大分子物质则被排阻在颗粒外部，从而实现分离。
2、电泳法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
在血红蛋白的分离中，常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳等。
《血红蛋白的提取和分离》 讲义
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、血红蛋白的简介血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，存在于红细胞中。
它使得血液呈现红色，并且在氧气的运输和二氧化碳的排放过程中发挥着至关重要的作用。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成。
珠蛋白部分有四条多肽链，每条多肽链与一个血红素分子相连，形成了具有四级结构的蛋白质。
其分子结构的特点决定了它能够与氧气可逆性结合，从而实现氧气在体内的运输。
了解血红蛋白的基本结构和功能，对于我们进行其提取和分离的实验具有重要的指导意义。
二、实验材料和设备1、实验材料新鲜的猪血（或其他富含血红蛋白的动物血液）、磷酸缓冲液、生理盐水、蒸馏水等。
2、实验设备离心机、透析袋、电泳仪、层析柱、移液器、磁力搅拌器、分光光度计等。
三、血红蛋白提取和分离的原理1、提取原理血红蛋白在不同的溶液中溶解度不同。
通过向血液中加入一定量的低浓度盐溶液，如磷酸缓冲液，可以使血红蛋白从红细胞中释放出来，进入溶液中。
2、分离原理（1）离心分离：利用离心机旋转产生的离心力，使不同密度的物质分层，从而将血红蛋白溶液与其他杂质分离。
（2）凝胶过滤层析：根据蛋白质分子大小的不同进行分离。
层析柱内填充有特定的凝胶颗粒，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，因而先被洗脱出来；小分子蛋白质则能进入凝胶颗粒内部，后被洗脱出来。
（3）电泳分离：在电场的作用下，带电粒子会向与其所带电荷相反的电极移动。
由于不同蛋白质所带电荷的性质和数量不同，它们在电场中的移动速度也不同，从而实现分离。
四、血红蛋白提取的步骤1、红细胞的洗涤采集新鲜的血液，加入适量的生理盐水进行稀释。
然后将血液缓慢倒入离心管中，以一定的转速离心一段时间。
离心后，上层为血浆，下层为红细胞。
去除上层的血浆，再加入生理盐水，重复离心操作，直至上清液不再呈现黄色，以洗净红细胞中的血浆蛋白等杂质。
2、血红蛋白的释放向洗净的红细胞中加入一定量的低浓度磷酸缓冲液，在磁力搅拌器上充分搅拌，使红细胞破裂，释放出血红蛋白。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
课题3 血红蛋白的提取与和分离
(二）、凝胶色谱操作---血红蛋白的纯化
1.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1. 6 厘米的玻璃管，两端磨平
②底塞制作:打孔→挖凹 穴 +安装移液管头部→ 覆盖尼龙网，再用100目 尼龙纱包好。
③顶塞制作 ④组装
注意:底塞中插入的玻璃管的上部不得超出 橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网， 还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
(2)固定化细胞可以用海藻酸钠，其作用是___包___埋__细__胞____， 加热溶化后的海藻酸钠需冷却到室温才可以加入菌体的原因 是 防止温度高导致微生物死亡 ； 该操作还需要使用氯化钙溶液，其作用是________________。
促进海藻酸钠和微生物混合液形成凝胶珠（或交联剂）
(3)整个操作过程需要在无杂菌的条件下进行，对使用到的玻璃
2.本实验中所用的缓冲液
磷酸缓冲液 目的：利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。
(三)电泳 1.电泳的概念
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2.原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解 离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。
若想尽快达到理想的透析效果可采取的措施是?
（练习）红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的功能主要是由血 红可（ 分蛋以3离）白选，同完用在学成猪电甲的、泳利，牛过用血 、程琼红 羊中脂蛋 或，糖白 其影凝的 他响胶主 脊蛋电要 椎白泳功动质技能物迁术是的移将携血速得带液率到O进的的2行因或蛋实素C白O验包2质，括，进来我行提们取 和蛋分白离质血带电红性蛋质白。、根分据子材本料身回大答小下以列及问分题子：的形状 不同等。
血红蛋白的提取和分离教案
血红蛋白的提取和分离教案教案一: 血红蛋白的提取和分离教学目标:- 理解血红蛋白的结构和功能。
- 学习血红蛋白的提取和分离方法。
- 掌握实验室中分离血红蛋白的步骤和操作技巧。
教学步骤:引入活动:在开始实验之前，首先向学生介绍血红蛋白的结构和功能，以及为什么需要提取和分离血红蛋白。
1. 血红蛋白的提取:a. 实验材料准备:- 鲜血样本- 磷酸缓冲溶液（pH 7.4）- 离心管- 离心机- 冷藏器b. 实验步骤:1) 将鲜血样本取出，用磷酸缓冲溶液稀释。
2) 将稀释后的样本置于离心管中，离心10分钟。
3) 将离心后的上清液转移至新的离心管中，置于冷藏器中。
2. 血红蛋白的分离:a. 实验材料准备:- 血红蛋白样本- 离心管- pH 4.7缓冲溶液- pH 5.2缓冲溶液- pH 6.0缓冲溶液- pH 7.0缓冲溶液b. 实验步骤:1) 将血红蛋白样本转移到离心管中。
2) 分别加入pH 4.7、pH 5.2、pH 6.0和pH 7.0缓冲溶液，使其达到不同的酸碱度。
3) 转动离心管，使其充分混合。
4) 将混合溶液置于冰箱中冷藏一段时间。
5) 通过离心，收集上层液体，然后分别加入酸、碱溶液，使其达到酸碱中和。
6) 重复以上步骤，直到获得纯净的血红蛋白。
实验注意事项:- 实验过程中要注意安全，佩戴实验室衣物和手套。
- 实验器材要严密封闭，避免反应物外泄。
- 实验后要彻底清理实验场地。
教学总结:通过本次实验，学生可以了解血红蛋白的结构和功能，并掌握了提取和分离血红蛋白的方法。
同时，学生也了解了实验室实验的注意事项和操作技巧。
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项目
分析
血液样品的处
分层____→样品处理完成 理
凝胶色谱柱的 放一个与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查； 加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖或红色葡聚糖，若
装填
色带均匀、狭窄、平整→装填成功
血红蛋白的分 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓
离
慢流出→分离成功
知识点一 分离蛋白质的基本方法原理 1．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，蛋白质洗脱出来的顺序是( ) ①相对分子质量最大的 ②相对分子质量最小的 ③相对分子质量适中的 A．①②③ B．③②① C．①③② D．②①③ 2．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白 质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须( ) A．具有相同的相对分子质量 B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子 C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子 D．具有不同的相对分子质量 知识点二 分离蛋白质的实验操作 3．对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是( ) A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐 B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝 胶面
C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶 开始洗脱 D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流 出液 4．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程的分析无误的是 ( ) A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的 效果 C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 答案 一、1.分配色谱法 相对分子质量 蛋白质 大于 外面 较快 小于 较慢 2．(1)酸 碱 pH (2)1～2 使用比例 在不同pH范围内使用 3．(1)带电粒子 电场 迁移 多肽 核酸 正电 负电 与其所带电 荷相反 (2)带电 大小 形状 不同的迁移速度 (3)①琼脂糖凝胶 ②聚丙烯酰胺凝胶 二、1.(1)去除杂蛋白 (2)②离心 ③血浆 ④洗涤 2．释放 (1)蒸馏水 甲苯 (2)涨破 3．(1)①离心管 离心 (2)血红蛋白
③将滤液置于分液漏斗中，静止片刻后，分出下层的红色透明液体，即 为血红蛋白溶液。 (2)目的：使________与大部分杂质分离开，便于后续纯化。 (3)离心后试管中的溶液分为4层，最上面的一层是甲苯层，第二层是脂 溶性物质沉淀层，第三层是血红蛋白水溶液层，最下层是杂质沉淀层。 4．粗分离——透析 (1)原理：______能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。 (2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。 (3)目的 ①除去样品中相对分子质量较小的杂质。 ②用于更换样品的缓冲液。 三、纯化蛋白质 1．凝胶色谱柱的制作 (1)取长40 cm，内径为1.6 cm的________，两端需用砂纸磨平。 (2)柱底部制作：打孔→挖出________→安装移液管头部→覆盖尼龙网， 再用100目尼龙纱将________上部包好。 (3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。 (4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。 2．凝胶色谱柱的装填 (1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量
↓ (2)凝胶________：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬液 ↓ (3)________：将色谱柱垂直固定在支架上 ↓ (4)________：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内 ↓ (5)________：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h， 使凝胶装填紧密 3．样品的加入和洗脱 (1)调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面 ________
血红蛋白的提取和分离
目标导航 1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.理 解缓冲液的组成和作用机理。3.体验提取生物大分子的基本过程和方 法。
一、分离蛋白质的基本方法原理 1．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做___________的有效方法。
4．(1)透析袋 三、1.(1)玻璃管 (2)凹穴 橡皮塞 2．(2)溶胀 (3)固定 (4)装填 (5)洗涤平衡 3．(1)平齐 (2)滴加 (4)缓冲液面 (5)洗脱 四、1.洗涤次数不能过少；低速、短时离心 2．沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物和 气泡 3．装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流 4．红色区带均匀一致地移动 五、1.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.明显 对点训练 1．C [分子很大，完全不能进入凝胶内的任何孔隙的蛋白质洗脱出来 的时间最短；分子大小适中，能进入凝胶内孔隙中孔径大小相应部分的 蛋白质，洗脱出来的时间次之；分子很小，能进入分子筛全部孔隙内的 蛋白质，洗脱出来的时间最长。] 联想 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法， 相对分子质量很小，能进入分子筛的全部孔隙，运动速度最慢，路程最 长；相对分子质量较大的，不能进入凝胶颗粒内，运动速度最快，路程 最短。所以，蛋白质可以按不同顺序洗脱出来。 规律链接 凝胶色谱中分子彼此间较易分开的原因 在凝胶色谱中会有三种情况：一是分子很小，能进入分子筛的全部内孔
相对分 直径大小
子质量
运动方式
运动速 运动 洗脱
度
路程 次序
____凝胶颗粒空
先从凝
大
隙直径，被排阻 垂直向下移动 ____ 较短 胶柱洗
在____
脱出来
____凝胶颗粒空 垂直向下移动，
小
隙直径，可以进 无规则扩散进入 ____
入颗粒内部
凝胶颗粒
2.缓冲液的作用和组成
后从凝 较长 胶柱洗
脱出来
(1)作用 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液 ________的影响，维持pH基本不变。 纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸 加入到1 L CH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混 合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(从1.00×10－7 mol/L增到1.01×10 －7 mol/L)，pH没有明显变化。 (2)组成 缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的 ____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型 主要有3种： ①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 ②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如 NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 ③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。 3．电泳 (1)概念 电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。许多 重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在 一定的pH下，这些基团会带上________或________。在电场的作用 下，这些带电分子会向着________________的电极移动。
只需1～2 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生 物，排出胶粒内的空气。 4．凝胶色谱柱的装填 在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 (1)在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的洗脱次序，降低分离效果。 (2)在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现 象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。 5．蛋白质的分离 滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据 红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。 4．D [洗涤红细胞的目的是去除血浆中除血红蛋白以外的杂蛋白；洗 涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果； 洗涤过程选用0.9%的生理盐水。]
(2)原理 在同一电场下，由于各种分子________性质的差异及分子本身 ________、________的不同，使带电分子产生________________，从而 实现样品中各种分子的分离。 (3)常用方法 ①____________电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电 场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状不同而不 同，从而得以分离。 ②________________电泳 加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；与各种蛋白 质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白 质原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率 完全取决于分子的大小。 二、粗提取血红蛋白 1．红细胞的洗涤 (1)目的：____________，以利于后续步骤的分离纯化。 (2)过程 ：为防止血液凝固，需在采血器中加入抗凝血剂柠檬酸钠
：500 r/min，离心2 min，这样做的目的是防止红细胞与白细胞一同沉 淀，达不到分离效果
：用胶头吸管吸去上层黄色血浆
：向盛有暗红色红细胞液体的烧杯中加入五倍体积的生理盐水，缓缓搅 拌10 min
：直至上清液中没有黄色，表明红细胞已经洗涤干净，否则需重复洗涤 (3)操作提示：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要，洗涤次数少， 无法除去血浆蛋白，离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀， 达不到分离效果。 2．血红蛋白的____ (1)方法：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加______到原血液的体积，再 加40%体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min。 (2)目的：使红细胞吸水____，血红蛋白释放出来。 (3)原理：渗透作用。 3．分离血红蛋白溶液 (1)方法 ①将搅拌好的混合液转移到__________中，以2 000 r/min的速度____10 min。 ②将离心管中的液体部分用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。
隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适 中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。三类分子彼此间较易 分开。 2．C [若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况 下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种 分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大 的那一部分凝胶。] 3．C [打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，在 用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲 液洗脱瓶开始洗脱。] 规律链接 血红蛋白提取与分离过程中的注意事项 1．红细胞的洗涤 (1)离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细 胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。 (2)重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除 血浆蛋白。 2．血红蛋白的释放 (1)蒸馏水的作用：使红细胞的细胞膜和核膜破裂。 (2)甲苯的作用：溶解细胞膜。 3．色谱柱填料的处理 为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常