1序论——蛋白质与酶工程
酶工程与蛋白质工程
酶工程与蛋白质工程酶工程与蛋白质工程是现代生物技术的重要领域，它们以分子水平为基础，通过基因工程技术来改造酶和蛋白质。
酶工程主要研究酶的结构与功能关系以及酶催化反应机理，以此来优化酶的性质和功能；而蛋白质工程则致力于蛋白质的高表达、纯化和改造，进而实现分子水平的控制和利用。
两者交叉融合，共同应用于工业、医药、环保和食品等各个领域，促进了生物技术的发展和推广。
一、酶工程简介酶是一种生物催化剂，具有极高的选择性和催化效率。
酶工程旨在通过对酶的分子结构和催化机理的研究，优化酶的性质和功能，使其在特定条件下能够更高效地催化反应。
比如，通过改变酶的氨基酸序列，可以实现酶催化活性和稳定性的提高。
再比如，通过引入新的催化中心或变异剂，可以改变酶的底物特异性和反应特性。
这些优化方法可以显著提高酶的效率和选择性，为实现工业生产和科学研究提供了有效手段。
酶工程的具体步骤如下：1. 酶的筛选和分离。
这个步骤是酶工程的基础，通常需要从自然界中分离出能够催化特定反应的酶。
现代酶工程技术一般采用高通量筛选法，通过分子筛、高速离心、色谱法等方法来分离出酶的纯品。
2. 酶的分子结构分析。
这个步骤是为了了解酶的分子结构和功能关系，找到优化方案的基础。
目前，常用的酶的分析方法有X射线晶体学和核磁共振法。
3. 酶的基因工程改造。
通过基因工程技术，改变酶的氨基酸序列和三维结构，使其获得更高的活性和稳定性。
常用的方法有扩展、交换和修饰等方法。
4. 酶的活性和特性检测。
通过活性酶测定、底物特异性、pH和温度对酶催化反应的影响等方法来检测酶的改造效果。
5. 酶的产量提高。
通过使用表达载体、调节生产菌株的生长条件等方法，使酶的产量达到最高。
二、蛋白质工程简介蛋白质工程是将目标蛋白基因从生物体内放大、纯化、定位和表达，以达到高效率和高纯度的目的。
主要应用于药物研发、工业化生产、分子诊断和分子工业等领域，对于制造可溶性蛋白、表达蛋白、纯化蛋白和修饰蛋白等方面都发挥着重要作用。
2019-2020学年生物技术专业《蛋白质与酶工程》第1章 绪论
高级结构的物理测定
（X射线衍射、核磁共振、冷冻电子显微学）
3.蛋白质结构和功能的设计和预测
预测方法：比较建模法、折叠识别法、二级 结构预测法、从头预测法等
4.通过基因重组改造或创造蛋白质
从预期的蛋白质功能出发→推测应有的氨基 酸序列→找到相对应的RNA序列→找到相对应的 DNA序列，进行基因工程学研究与改进。
紫膜
每个细菌视紫红质分子由248个氨基酸残基组成， 其分子量为26KD。每个细菌视紫红质结合一个生色 团视黄醛，位于216位的赖氨酸上，处于靠近肽链 C 端细胞膜内侧。
这种晶格结构排列在生物膜中很独特，增加了 膜结构的稳定性，也有利于进行结构分析，使其成为 目前生物膜结构研究中最为清楚的膜蛋白之一。
（2）DNA改组技术
是体外同源重组的一种再组装PCR技术。是将 一群密切相关的序列通过酶随机切成许多片段，通 过自身引导PCR，将改组的模板，多次筛选直到获得性状较为 满意的突变体。
（3）体外定向进化技术
又称分子进化，是在实验室模拟自然进化机 制，通过易错PCR等方法，对编码酶的基因进行随 机诱变，再通过高通量筛选或选择方法定向选择出 性能更加优良的酶或创造出自然界所没有的且就有 优良性质的酶。
应用前景：纳米生物材料、生物芯片、光信息存储等。
第二节 蛋白质与酶工程的 研究内容
一、蛋白质工程的研究内容 1. 蛋白质的分离纯化研究 2. 蛋白质改性研究 3. 蛋白质多肽应用研究 4. 蛋白质固定化研究（固定化酶、生物传感器、组织工程） 5. 蛋白质结构分析、功能设计和预测 6. 蛋白质的光电化学研究
血红蛋白-亚基第6位与HbA的区别
一、 蛋白质工程的内涵 1.蛋白质的分离纯化技术 2.蛋白质结构和功能的分析 3.蛋白质结构和功能的设计和预测 4.通过基因重组改造或创造蛋白质 5.蛋白质分子识别 6.蛋白质光电特性利用工程
第三章 蛋白质及酶工程
蛋白质三级结构推测及保守结构域分析
N端 β桶结构域
ATPaseα、β亚基 间C末端作用区域
ATPaseα亚基核心 结构域
3D structure prediction of ATPaseαsubunit in Elymus sibiricus
蛋白质三级结构推测及保守结构域分析
由5个 β 折 叠组成的 N 端区域
图5.13 Elymus sibiricus ATPase α亚基 天冬氨酸位点
图5.14 Elymus sibiricus ATPaseα亚 基与β亚基结合位点
E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723 E.sibiricus gi 114521 gi 3023328 gi 231592 gi 34501429 gi 114513 gi 5915723
蛋白质的分子量及等电点
用DNA Tool 5.1软件分析了Elymus sibiricus ATPase α亚基的分子量和等电点，推测蛋白质的分
蛋白质与酶工程酶学基本理论课件ppt1
酶的分类总结
第二节
酶的分子结构与功能
The Molecular Structure and Function of Enzyme
酶的不同形式
❖ 单体酶(monomeric enzyme)仅具有三级结构的酶。
❖ 寡聚酶(oligomeric enzyme)由多个相同或不同亚 基以非共价键连接组成的酶。
例如 L19 IVS能够催化RNA剪接、限制性内切、 去磷酸等作用
蛋白类酶 proteozyme
酶 enzyme
氧化还原酶类 Oxidoreductases
转移酶类
Transferases
水解酶类
Hydrolases
裂合酶类
Lyases
异构酶类
Isomerases
合成酶类
Synthetases Synthases
亚－亚类编号依次为 1. 2. 3. 4. 5. 6…….
（1）氧化还原酶类（Oxidoreductases） 包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素
氧化酶等 其催化的反应通式AH2 + B = A + BH2
被氧化的底物(AH2）为氢或电子供体 被还原的底物（B）为氢或电子受体 系统命名供体在前，受体在后，再加上氧化还原
的空间构象所必需。
活性中心以外 的必需基团
结合基团
底物
催化基团
活性中心
目录
溶菌酶的活性 中心
* 谷氨酸35和天
63
冬 氨 酸 52 是 催 化 基团；
* 色氨酸62和63、 天 冬 氨 酸 101 和 色 氨 酸 108 是 结 合基团；
* A~F 为 底 物 多 糖链的糖基，位 于酶的活性中心 形成的裂隙中。
蛋白质与酶工程名词解释
蛋白质与酶工程名词解释一、名词解释1.蛋白质工程（Protein Engineering）：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
2.蛋白质分子设计（Protein Molecule Design）:从分子、电子水平上，通过数据库等大量实验数据，结合现代量子化学方法，通过计算机图形学技术等设计新的分子。
3.亲和标记/亲和标记试剂（Affinity Labeling /reagent）：试剂对蛋白质分子中被修饰部位的专一性修饰，为亲和标记或专一性的不可抑制作用。
(亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。
这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂)4.定向进化（Directed Evolution）：在较短时间内完成漫长的自然进化过程（突变、重组和筛选），有效地改造蛋白质，使之适合于人类的需要，这种策略只针对特定的蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。
5.DNA改组技术（DNA Shuffling）：是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组，通过改变单个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。
DNA家族改组技术（DNA Family Shuffling）：是以来自不同种属的同源基因作为重排对象进行DNA改组操作的技术。
该技术打破不同种、属间的遗传界限，利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组6.超滤（Ultrafiltration）：利用压力或离心力使溶液中的小分子物质通过超滤膜，而大分子则被截留，一次实验就可以将蛋白质混合物分为分子大小不同的两部分的分离方法。
7.亲和层析（Affinity Chromatography）：是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。
蛋白质与酶工程
♦ 没有酶的专一性，细胞中有秩序的物质代谢将不复存
在。酶的专一性对酶工程的发展具有重要意义。
♦ 酶可催化正、逆双向反应。
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(3)酶活性可调节
♦ 生命是严格有序的 一方面这种有序过程依赖于酶的催化作用； 另一方面，酶又必然受到这个有序过程的严格调控。
♦ 酶的量、酶的半衰期、酶的活性都是可以控制的 酶水平的调控是代谢调控的基本方式。
6．分子伴侣
♦ 蛋白质中二硫键的形成和少数蛋白质的折叠有赖于 叫做分子伴侣（chaperon）的酶或蛋白质的协助。
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第三节 蛋白质工程的类型
一、蛋白质的设计及改造
1．全新设计——按照人的意志设计合成自然界从未有的 蛋白质 蛋白质工程中最有意义、最为困难的操作类型。
♦ 往往应用于蛋白质类药物研究 如，艾滋病。人们根据艾滋病毒壳蛋白的结构，设计出 能够将其水解的酶。
3．天花粉蛋白改造 ♦ 优点 抑制肿瘤细胞的生长和艾滋病病毒的复制 ♦ 缺点 毒副作用强，造成过敏 ♦ 结构特点 引起毒副作用的结构部分和有用的活
性部分可分开 ♦ 改造设想 降低毒性，单独合成天花粉蛋白的治
病部分，其毒副作用即可排除。
4．抗体蛋白人源化 ♦ 当前用鼠等动物生产人的抗体容易引起不利的
链接
1．Anfinsen一级结构决定空间结构理论 ♦ 只要合成了某种蛋白质的一级结构，空间结构自
动形成 ♦ 人工合成胰岛素的实践初步证实了这一论断
但许多蛋白质从一级结构到空间结构的折叠 过程并非像胰岛素和牛胰核糖核酸酶那样简单。
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2．同源蛋白、蛋白质家族
♦ 蛋白质有结构上的分子进化同源性 ♦ 在预测一种新的蛋白质空间结构时，首先可以在
♦ 大部分酶的特性不适合于工业应用 ♦ 水解酶和异构酶是工业应用的首选酶 ♦ 世界上销售量最大的5种酶 细菌蛋白酶、葡萄糖淀粉
9.10 酶工程和蛋白质工程
、
（2）有机小分子： 维生素C、半胱氨酸、还 原型谷胱甘肽、巯基乙酸可使含酶—SH处 于还原态。
6.
抑制剂对酶催化反应速率的影响
1）抑制的作用 ① 失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。 ② 抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的 作用。（此作用使一部分酶的必需基团或辅助因子失 活（活力变小））。 2）抑制类型 ① 不可逆抑制：底物与酶共价结合，引起酶失活，是一 不可逆反应，二者结合后，不能透析除去抑制剂而恢 复酶活力，称为不可逆抑制作用。 ② 可逆抑制：底物与酶结合，为可逆反应，透析能除去 抑制剂使酶恢复活力，称为可逆抑制作用。
五. 酶的生产与酶的分离纯化
1.酶的生产与制造 化学合成 生物合成 微生物发酵优点： 种类繁多，酶系完整；可以获得高产菌株； 微生物繁殖快、生产周期短；成本低
2.提高酶产量的途径： 调节机制：操纵子模型 （结构基因和调控基因）
3. 酶的分离纯化
3.1 基本要求 防止酶变性； 认真选取有效纯化方法； 在整个分离纯化过程中，应始终检测酶活 性，以及时调整和改善分离条件。
2. 底物浓度[S]对酶促反应速度V与底物浓度[S]的关 系
Michaelis&Menten提出的著 名的米氏方程 根据如下现象的观测： 当底物浓度较低时候，反应 速率与底物浓度成正比，即 符合一级反应动力学；当底 物浓度较高时，反应速率与 底物浓度无关，即符合零级 反应动力学 当酶的浓度大大小于底物浓度 时，反应速率与酶的加入量 成正比
⑤干燥 酶溶液或含水量高的酶制剂即使在 低温下也极不稳定，只能作短期保存。为 便于酶制剂的长时间的运输、储存，防止 酶变性，往往需用对酶进行干燥，制成含 水量较低的制品。 常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、 喷雾干燥等。
蛋白质与酶工程
蛋白质与酶工程重点1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。
3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。
5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。
6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。
8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。
10.酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。
11.酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。
12.微生物作为酶源的优越性：1）容易获得酶需要的酶类；2）容易获得高产菌株；3）生产周期短；4）生产成本低；5）生产易管理；6）提高微生物产酶的途径比较多。
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大肠杆菌中进行表达
人的干扰 素的cDNA
问题 分析 原因 解决
天然产品的十分之一
抗病毒活性为 10^6 U/mg
虽然在大肠杆菌中合成的β-干扰素量很多， 但多数是以无活性的二聚体形式存在。? β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位） 推测：不正确的二硫键 将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸
蛋白质工程的诞生
基因工程诞生10周年之际著名科学家Kevin M.Ulmer
于1983年在SCIENCE(VOL.219)发表了论文 « Protein Engineering» ,该文的摘要是: The prospects for protein engineering ,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA ,and computer modeling of protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for altering protein structure and function in ways not possible by any other method. 该文的发表标志着作为生物工程三大技术之一的蛋 白质工程诞生了。 1
而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白 质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展， 其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白 质工程的一部分。
13
酶工程领域的未来研究热点
• 一、微生物酶源是酶工程研究的主源流
• 二、以基因工程和蛋白质工程改造和设计 酶是革命性导向 • 三、酶法转化、折分合成手性药物及精细 化合物 • 四、构建新酶———抗体酶、核酶及人工 合成酶是一个前沿生长点
白质工程最根本的目标之一。
3
3、蛋白质工程的定义
定义
目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。
一般认为，蛋白质工程就是通过基因重
组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白 质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化， 蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基 因重组或其它手段改造或创造蛋白质。
从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、
结果
抗病性活性提高到10^8 U/mg，并且比天然β干扰素的贮存稳定性高很多。
7
（二）思考与探究
蛋白质工程为什么能够迅猛崛起？ 蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工 程有什么不同？ 什么是酶工程？绝大多数酶都是蛋白质， 酶工程与蛋白质工程有什么区别？
8
基因工程是遵循中心法则
DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能
• 固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引 起的某些功能的衰竭等。
• 日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等，就更 是酶工程最直接的体现。
12
酶工程与蛋白质工程的区别
通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂， 而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然 后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等 步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理 充分利用；
一、绪论
1、蛋白质与酶工程产生背景
“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对 基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研 究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作 用。 2、蛋白质工程和酶工程是基因工程的
一个重要组成部分，或者说是新一 代的基因工程。原因：
A、基因工程手段是蛋白质与酶工程改造 的主要手段； B、基因工程的最终目的是获得有益的蛋 白质或酶产物。
1、 蛋白 质工 程为 什么 能够 迅猛 崛起？
2）而结构生物学对大量蛋白质分子的精确 立体结构及其复杂的生物功能的分析结果， 为设计改造天然蛋白质提供了蓝图。 3）以定点突变为中心的基因操作技术为蛋 白质工程提供了手段。
举例
通过蛋白质工程来提高重组β-干 扰素专一活性和稳定性。
干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。
10
酶工程 • 酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，
借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗
诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括 地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面 组成的。
11
酶工程的应用
主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。 • 举例： • α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个 酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖 浆； • 蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；
2
（一）蛋白质工程
1、蛋白质工程是一门综合学科
蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子 遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、 蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。
2、研究内容主要有两个方面：
A、根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质； B、确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。 在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生 物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋
14
生物技术的四大支柱
生 物技术 （ ห้องสมุดไป่ตู้物工程）
基因工程
细胞工程
酶工程
发酵工程
15
课后作业
• 1、蛋白质工程、酶工程的定义？ • 2、蛋白质工程与酶工程的区别与联系？ • 3、蛋白质工程操作程序的基本思路与基因 工程有什么不同？
16
化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计 合成具有特定功能的新蛋白质。
4
（二）思考与探究
1、蛋白质工程为什么能够迅猛崛起？
2、蛋白质工程操作程序的基本思路与基 因工程有什么不同？
3、什么是酶工程？绝大多数酶都是蛋白 质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？
5
原因：
1）工业生产和基础理论研究的需要。
基本上是生产出自然界已有的蛋白质。
蛋白质工程是按照以下思路进行的：
确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构
→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列
→应有的碱基排列 可以创造自然界不存在的蛋白质。
9
（三）思考与探究
• 蛋白质工程为什么能够迅猛崛起？ • 蛋白质工程操作程序的基本思路与基因 工程有什么不同？ • 什么是酶工程？绝大多数酶都是蛋白质， 酶工程与蛋白质工程有什么区别？