01【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分

第一章酶的分离提取与纯化
1.1离心分离和层析分离
1.1.1酶的提取方法
离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。

离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。

1.1.1.1离心机的种类与用途
常速离心机，高速离心机，超速离心机
1)常速离心机：转速<8000 r/min 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣
及粗结晶等较大颗粒
2)高速离心机：转速：1~2.5*104 r/min 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片
及较大的细胞器
3)超速离心机：转速：2.5~12*104 r/min 用途：用于DNA、RNA、蛋白质
等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化
1.1.1.2离心方法
差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心
1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗
粒分不分离的方法。

用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子
2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用
下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

常用介质：蔗糖、甘油
3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密
度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。

介质：铯盐
1.1.1.3层析分离技术
又称色谱技术，是一种物理的分离方法。

利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离
根据分离原理分类
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等
1)吸附层析
原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。

2)分配层析
原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

3)分配层析
原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。

离子交换剂载体：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖
阳离子交换剂：平衡粒子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用
阴离子交换剂：平衡粒子带负电的离子交换剂，能与带负电的离子基团发生交换作用
4)凝胶层析
原理：是以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子量不同，而达到物质分离的一种层析技术。

常用凝胶：葡聚糖凝胶；琼脂凝胶
5)亲和层析
原理：是利用生物分子与配基之间所具有的转移而又可逆的亲和力，而使蛋白质分子分离纯化的技术。

1.1.2讨论与问题
1)利用梯度混合器制备得到的密度梯度可以有哪几种？
线性、凸性、凹性
2)制备密度梯度溶液，一般采用什么仪器进行制备？
梯度混合器
3)沉降系数比较接近的蛋白质分子适用于哪种分离方法？
A.差速离心法
B.密度梯度离心法
4)常用的层析方法有？
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析
5)在酶的离子交换层析中，阳离子交换剂可吸附带负电荷的蛋白质（X）。

6)凝胶层析过程中，小分子量的蛋白质能直接通过凝胶珠之间的缝隙，首先被
洗脱下来。

（X）
7)凝胶层析分离酶蛋白的依据是各组分的相对分子质量不同。

（√）
解析:当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的
蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长！凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。

因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。

1.2过滤和膜分离技术
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。

过滤（非膜过滤和膜过滤）介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维等非膜过滤：采用高分子膜以外物质作为过滤介质。

粗滤和部分未滤
膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质。

大部分微滤、超滤、反渗透
1.2.1过滤的分类及特性
1.2.2非膜过滤
粗滤：
截留颗粒直径大于2μm,用于分离酵母、霉菌、动植物细胞、培养基残渣等。

过滤介质有滤纸、滤布、多孔陶瓷等
常压过滤以液位差为推动力，易操作，分离效果差，难成规模。

加压过滤以压力泵或压缩空气为推动力。

效果较好，生产上应用广泛。

减压过滤真空过滤、抽滤。

多用于粘性不大的物料。

微滤：
微孔过滤，截留颗粒直径0.2~2μm,光学显微镜可见颗粒，采用微孔陶瓷、烧结金属等
1.2.3膜分离技术
借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小。

不同形状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术。

薄膜有丙烯啨、醋酸纤维素、硝酸纤维素等高分子聚合物制成的高分子膜。

1.2.3.1根据颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力不同分三类
1.2.3.2加压膜分离
以薄膜两边的流体静压差为推动力。

根据截留颗粒大小分为3种：微滤（0.2-2um/细菌）；超滤（截留菌丝体和可溶性蛋白）；反渗透（分离各种离子和小分子物质）
1.2.3.3电场膜分离
在半透膜的两侧分别装上正负极，电厂作用下小分子带电物质或离子向其与本身电荷相反的电极移动，通过半透膜，达到分离目的。

电渗析
离子交换膜电渗析
1.2.3.4扩散膜分离
利用小分子扩散作用透过半透膜，而大分子被截留;用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。

透析设备简单，但操作时间长，要更换水或缓冲液。

1.2.4电泳分离
带电粒子在电厂中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。

按其使用的支持体不同，电泳分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳，自由电泳、等电聚焦电泳。

1.2.4.1基本原理
是指在电场作用下，带点颗粒由于所带电荷不同及分子大小差异而有不同迁移行为，从而彼此分离开来的一种实验技术。

由于混合样品中各组分带电性质、带电量、相对分子量不同，在同一电场作用下，涌动的方向和速率各异，从而达到分离鉴定的目的。

1.2.4.2电泳装置
1.2.4.3影响电泳分离的主要因素
1)待分离生物大分子的性质
电荷量越大，直径越小，形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快
2)缓冲液的性质
3)电场强度
4)电渗
5)支持介质的筛孔
1.2.4.4电泳的分类
1)区带电泳：各组分在支持介质中被分离成许多条明显的区带，是当前应用最
广泛的电泳技术。

2)自由界面电泳：无支持介质，分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。

3)等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各
4)电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。

5)等电聚焦电泳：由两性电质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大
分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带
1.2.4.5电泳技术的应用
1)分离各种有机物
2)分析物质的浓度
3)测定某种物质的相对分子质量
4)与其他技术（层析法）结合，用于蛋白质结构分析如“指纹法”。