血友病携带者与产前基因诊断_陆晔玲
甲型血友病的遗传咨询与产前诊断
甲型血友病的遗传咨询与产前诊断张燕【摘要】@@ 甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ(coagulationfactor Ⅷ,FⅧ)的遗传性缺陷或缺乏,以致凝血活酶生成障碍的一种常见X连锁隐性遗传性疾病,约占先天性出血性疾病的85%,是目前已经明确的单基因遗传性疾病.男性患病率约为1/5 000,约60%患者有遗传病家族史.目前本病尚无根治性措施,【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2010(002)004【总页数】6页(P28-33)【作者】张燕【作者单位】山东大学附属省立医院妇产科,山东,济南,250021【正文语种】中文甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ（coagulation factorⅧ，FⅧ）的遗传性缺陷或缺乏，以致凝血活酶生成障碍的一种常见X连锁隐性遗传性疾病，约占先天性出血性疾病的85%，是目前已经明确的单基因遗传性疾病。
男性患病率约为1／5 000，约60%患者有遗传病家族史。
目前本病尚无根治性措施，只能由凝血因子Ⅷ制品或新鲜全血预防和替代治疗，但输注血制品极有可能传播传染病；而且随着使用FⅧ制品的时间延长，约2.4%～50%的患者会产生抗FⅧ的同种抗体［1，2］，大大降低了FⅧ的促凝血活性，使FⅧ的替代效果减低甚至无效，为家庭和社会带来沉重的负担。
所以血友病携带者的检测及早期诊断是有效控制致病基因传递，防止患儿出生，降低发病率的主要措施。
血友病的产前诊断对于血友病家系的遗传咨询，减轻血友病家庭的经济和心理负担，具有重要的应用价值和社会效益。
1 甲型血友病的遗传咨询甲型血友病是一种常见的X连锁隐性遗传性疾病，该病主要是女性传递，男性发病，多见隔代遗传：① 甲型血友病男性患者与正常女性结婚，其儿子100%正常，其女儿100%为携带者，无甲型血友病患者出现；② 正常男性与甲型血友病女性携带者结婚，其儿子50%正常，50%为患者；其女儿50%正常，50%为携带者；③ 甲型血友病男性患者与甲型血友病女性携带者结婚，其儿子50%正常，50%发病；其女儿50%为携带者，50%发病；④ 正常男性与甲型血友病女性患者结婚，其儿子100%为患者，其女儿100%为携带者。
甲型血友病的基因诊断和产前诊断
甲型血友病是最常见的出血性疾病的一种，为X性连锁隐性遗传，男性发病率1/万，系第8因子（FⅧ）基因缺陷所致。
1984～1987年采用了“限制性酶切片段长度多态性”（RFLP）基因连锁分析法，其可诊断率≤75%，但该法繁而难予普及。
Kogan氏把PCR与RFLP结合起来扩增FⅧ基因内含BclI和XbaI多态性位点的两个DNA片段；含BclI多态性位点的DNA片段在FⅧ基因18外显子内，可产生99bp（碱基对）和43bp。
若只产生142bp，说明不具BclI 酶切位点的等位基因，与甲型血友病基因连锁；含XbaI多态性位点的DNA片段在FⅧ基因22内含子内，可产生68bp片段，若仅出现一条96bp的区带，说明不具XbaI酶切位点的等位基因，与甲型血友病基因连锁。
据酶切图谱分析这两个多态性位点的存在与否做为正常与血友病基因的遗传标志，通过家系连锁分析进行产前及基因携带者的基因诊断。
单用前者的诊断概率为38%，单用后者为49%，二者联合使用可达70%，实际可诊断率均高于该理论值。
胎儿性别之鉴定对甲型血友病这类性连锁遗传病的产前诊断来讲显然是应首先进行的。
因为如果测出胎儿为女性，则如无特殊情况及需要，一般不需继续作基因诊断。
因其最坏的可能也只是个携带者。
如为男性，是有必要运用PCR/RFLP技术做出产前诊断达优生之目的。
血友病的基因诊断和产前诊断
患者、患者父母、受检者本人。
② 受检者与患者为姨表亲，需至少六份血样：患者、
患者父母、受检者、受检者父母。（若可提供受
检者外公、外婆血样更利于检测） ③ 患者为受检者外甥：需六份血样：患者、患者父 母、受检者、受检者父母。
家中血友病患者已故，能做携带者基因检测吗？
提供肯定携带者血样（即患者母亲或女儿） 的前提下，可做出约90%血友病基因缺陷的检测。 如无法提供肯定携带者，通过直接基因诊断， 也可以做出90%左右致病基因检测。
什么是产前诊断？
产前诊断又称宫内诊断，是指胎儿出生前采用 各种方法预测其是否有先天性疾病（包括畸形和遗 传性疾病），为能否继续妊娠提供科学依据。
血友病的基因诊断和产前诊断
南方医院妇产科 产前诊断和遗传病诊断技术中心
李莉艳
简介
血友病分甲型、乙型、丙型，还包括因血小板 vWF 因子的缺乏引起的假性血友病。这里主要述及
常见的甲型和乙型血友病。
血友病是X连锁隐性遗传病。
血友病的一般发病率为 1/5 000 ～ 10 000 ( 男
性)，其中约80%为血友病甲。目前我国普遍采用
断。
哪些人需要接受血友病的基因诊断？
直系亲属或母亲家系中有血友病患者的女性，
是临床上血友病基因诊断的主要对象。
血友病患者的女儿是一定的携带者。
为了产前检查的需要，也建议孕前提前进行血
友病相关基因检测，以免延误产前诊断时机。
只做血友病携带者检查，需要哪些人的血样？
按受检者与患者关系不同，分为以下几种情况：
FⅧ:C和FⅨ:C对血友病甲和乙进行诊断和分型。 对血友病这样目前还没有根治手段的遗传病， 鉴定携带者及产前诊断有利于优生优育，可以减 少发病率。 FⅧ 基因庞大，外显子数量多，结构复杂， 且相当部分患者无家族史，这给直接检测基因突 变带来极大不便。
甲型血友病基因诊断及产前基因诊断的研究的开题报告
甲型血友病基因诊断及产前基因诊断的研究的开题报告
一、课题背景
甲型血友病是由于凝血因子VIII缺乏而引起的一种遗传性出血性疾病。
该疾病主要由X染色体上的F8基因突变所致，患者多数为男性。
目前，该病的治疗主要是通过人工供给凝血因子VIII和其他治疗手段缓解症状和预防并发症。
然而，由于疾病的遗传性和临床表现的差异性，如何进行早期诊断和治疗仍然是该病研究的热点之一。
同时，对于携带F8基因突变的女性来说，其患病风险也较高，因此产前基因诊断也显得非常重要。
二、研究目的
本课题旨在通过F8基因的定位和突变基因的筛查，实现甲型血友病早期诊断，以及对于携带甲型血友病基因的孕妇进行产前基因诊断，为临床诊疗提供重要参考和支持。
三、研究方法和步骤
1.病例收集和样本准备：收集甲型血友病患者和携带甲型血友病基因的孕妇的血液样本，并进行相关临床检测和记录。
2.基因定位：通过PCR扩增F8基因区域，建立基因定位的方法。
3.突变基因筛查：利用Sanger测序技术对F8基因进行检测，筛查其突变情况。
4.数据分析：根据收集的患者和孕妇的相关临床资料，结合基因突变筛查结果，进行数据分析和统计。
5.结果解读和临床应用：根据数据分析结果，对甲型血友病的诊断和治疗提出建议和支持。
四、预期成果和意义
通过对甲型血友病基因的定位和突变基因的筛查，本研究将提供甲型血友病的早期诊断和产前基因诊断的支持，有助于改善甲型血友病患者的生活质量和生育健康。
此外，对于基因诊断技术的研究和推广，也有着重要的学术和临床意义。
同时存在血友病A及血友病B患者家系的基因诊断
同时存在血友病A及血友病B患者家系的基因诊断陆晔玲;丁秋兰;戴菁;谢炳寿;王明山;奚晓东;王鸿利;王学锋【期刊名称】《诊断学理论与实践》【年(卷),期】2010()5【摘要】目的:对1个同时存在血友病A(HA)及血友病B(HB)患者的家系进行分子发病机制研究,并对家系女性成员进行携带者检测。
方法:采用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fg)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性(FⅧ:C)、FⅨ活性(FⅨ:C)及血管性血友病因子(vWF)等测定进行HA及HB表型诊断;用长链聚合酶链反应(LD-PCR)进行F8基因内含子22倒位检测,2组序列特异的PCR对F8基因内含子1倒位进行检测;采用直接核苷酸测序法对F9基因各外显子及其侧翼序列进行检测,联合F9基因相关的6个微卫星位点(DXS8094、DXS1211、DXS1192、DXS102、DXS1227及DXS8013)进行家系遗传连锁分析。
结果:先证者1是由F8基因内含子22倒位引起的HA。
先证者2是由F9基因突变nt32772A→T突变(p.Ser365Cys,GI:22385320)引起的HB,其突变基因遗传自其母亲,来源于先证者2外公的X染色体,其外公为该突变的体细胞和生殖细胞嵌合体,其阿姨口腔细胞DNA未检出该突变。
结论:该家系2名先证者的基因诊断结果与表型诊断相符。
单碱基延伸法可用于突变嵌合率的检测,并为血友病散发家系的突变来源提供可靠的信息。
【总页数】6页(P443-448)【关键词】血友病A;血友病B;嵌合体;基因诊断【作者】陆晔玲;丁秋兰;戴菁;谢炳寿;王明山;奚晓东;王鸿利;王学锋【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科;温州市第三人民医院检验科;温州市第一人民医院检验科;上海交通大学医学院附属瑞金医院临床基因组学国家重点实验室;上海交通大学医学院附属瑞金医院临床上海血液学研究所【正文语种】中文【中图分类】R554.1【相关文献】1.两个特殊血友病A患者家系的基因诊断 [J], 王学锋;戴菁;傅启华;方怡;武文漫;丁秋兰;樊绮诗;王鸿利2.应用两种方法对血友病B家系进行产前基因诊断 [J], 王莉;廖世秀;王应太;姚丰;王涛;康冰3.3个血友病B家系患者与携带者的基因诊断 [J], 蒋雪雯;韦红英;刘壮4.甲型血友病家系的F8基因检测及产前基因诊断 [J], 高云鸽;程天一;赵淑慧;陈必良;杨红;宋婷婷;黎昱;金鑫;张建芳;徐盈因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
3个血友病B家系患者与携带者的基因诊断
ｂｙ ＰＣＲ，ｔ ｈｅ ｎ ｓ ｅ ｑ ｕｅ ｎｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ａ ｎｇ ｅ ｒ ｄ ｉ ｄ ｅ ｏｘ ｙ ｃ ｈａ ｉ ｎ — ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏｄ ．Ｔｈｅ ｒ ｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙｓ ｅ ｄ ．Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ：
（ Ｇｌ ｙ ２ ３ ６ Ｉ ｌ ｅ ｆ ｓ ＊６ ） ， 家 系 ３中先 证 者 基 因突 变 位 于 第 ７ 号外显子 ， 类型为 ３ ５ ０ ６ ８ — ３ ５ ０ ７ ０ ｄ ｅ １ ３（ Ｖａ １ ２ ６ ３ ｄ ｅ １ ） ， 均 为 未 经 报 道 的 突 变 类
型， 其 中 家 系 ３中 发 现 携 带 者 １例 ， 基 因 突变 类 型 与 家 系 ３中 先 证 者 基 因 突 变 类 型 相 同 。结 论 ： 本 次 基 因 诊 断 为 ３个 家 系 建 立 了家 系 图谱 ， 其 结 果 不 仅 补 充 了血 友 病 Ｂ 的突 变 数 据 库 ， 也 为 血 友 病 Ｂ发 病 的分 子 机 制 提 供 了 一定 分 析 依 据 。
ＨＡＥＭ ｏＰＨＩ ＬＩ Ａ Ｂ
Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｘｕ ｅ ｗｅ ｎ ，Ｗ ｅ ｉ Ｈｏ ｎ ｇ ｙ ｉ ｎ ｇ，Ｌｉ ｕ Ｚ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ．（ Ｐｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ ｉ ｃ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｆｉ ｒ ｓ ｔ Ａｆ ｆ ｉ ｔ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ
我国儿童血友病现状及诊断
１００种之多（部分缺失及全缺失者３０种，其余为各
种类型点突变）一ｏ。 ２．２临床表现血友病患儿绝大多数为男性，临床 特点是延迟、持续而缓慢的渗血，出血频度与部位取 决于患儿体内的凝血因子水平。血友病的出血在各 个部位都有可能发生，以关节最为常见，肌肉出血次 之；内脏出血少见，但病情常较重。出血发作是间歇 性的，数周、数月甚至多年未发生严重出血并不少 见。除颅内出血外，出血引起的突然死亡并不多见， 但年幼儿可因失血性休克致死。 重型患儿常在无明显创伤时自发出血，中型患 儿出血常有某些诱因。轻型血友病极少有出血，常 由明显外伤引起，患儿常在外科手术前常规检查或 创伤后非正常出血才被发现。 患儿首次出血常为学步前皮肤、软组织青斑、皮 下血肿；走路后关节、肌肉出血开始发生，若此时无 有效替代治疗，关节出血常反复发生并在学龄期后 逐步形成血友病性关节病，不仅致残而且影响患儿 就学及参与活动，影响其心理发育。上述疾病演变
中国小儿血液与肿瘤杂志２０１０年４月第１５卷第２期Ｊ Ｃｈｉｎａ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ａｐ羽２０１０，Ｖｏｌ １５，Ｎｏ．２
・４９・
・专题论坛・
我国儿童血友病现状及诊断
胡群
１现状血友病是一种缺乏因子Ⅷ或因子Ⅸ的性
血友病患儿出血的严重程度与因子活性水平有 关，初次出血的年龄一般在１岁左右，出血的部位以
或兄弟中有血友病病人，则注意女眭携带者的诊断。
在血友病的诊断中实验室检查尤为重要。
度血友病的水平，也表现为与轻度男性血友病患儿
相同的出血表现。 ・２．３实验室检查和诊断根据ＦⅧ或ＦＩＸ的水平将 血友病分为三型见附表。
பைடு நூலகம்
３产前诊断血友病Ａ和Ｂ是常见的遗传性出血 病，呈ｘ性连锁隐性遗传，由于缺乏根治措施，故作携
血友病预防中的血友病因子基因突变筛查与遗传咨询建议
血友病预防中的血友病因子基因突变筛查与遗传咨询建议血友病是一种常见的遗传性疾病，主要表现为血液凝血因子缺乏或功能异常，导致患者易出血。
血友病的发病风险与遗传因素密切相关，因此，及早进行血友病因子基因突变筛查和遗传咨询显得尤为重要。
本文将向读者介绍血友病因子基因突变筛查的方法以及根据检测结果得出的遗传咨询建议。
一、血友病因子基因突变筛查的方法血友病主要分为血友病A和血友病B两种类型，分别与凝血因子VIII和IX的缺失或异常有关。
为了确诊血友病以及筛查潜在的基因突变，可以使用以下方法进行基因检测：1.基因测序：通过对凝血因子基因进行测序，检测基因序列是否存在变异。
这种方法能够准确地确定特定基因是否有突变，从而帮助医生确定患者是否为血友病，并进一步了解具体的基因突变类型。
2.基因芯片技术：利用基因芯片芯片上携带的数百万个位点进行基因检测，可以同时检测多个基因的突变情况。
这种方法具有高通量和高灵敏度的特点，适用于筛查多个基因的突变，并能够有效提高检测效率。
二、血友病因子基因突变筛查结果的遗传咨询建议根据血友病因子基因突变筛查的结果，遗传咨询专家可以提供以下建议：1.阳性结果：如果患者的基因突变筛查结果为阳性，即发现存在凝血因子基因的缺失或异常，那么该患者有较高的患病风险。
此时，建议患者及时就诊，并咨询专科医生进行进一步的确诊和治疗计划制定。
2.阴性结果：如果患者的基因突变筛查结果为阴性，即未发现凝血因子基因的缺失或异常，那么该患者的患病风险较低。
然而，仍建议患者注意遗传因素对子代的影响，并定期进行体检以排除其他可能疾病的风险。
3.携带者状态：女性患者可能是血友病基因的携带者，即拥有一个正常的基因和一个突变的基因。
这种情况下，携带者有较低的患病风险，但可能会将突变基因传给子女。
因此，建议携带者在计划生育前咨询遗传专家，了解相关的风险和遗传咨询建议。
三、血友病预防中的其他注意事项除了血友病因子基因突变的筛查和遗传咨询外，预防血友病的措施也是非常重要的。
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中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4
血友病 A(HA)和 B(HB)是常见的遗传性出 血病 , 呈 X性联隐性遗传 。由于缺乏根治措施 , 故 作携带者和产前诊断可避免血友病胎儿的出生 , 对 提高人口素质 , 减轻社会负担有重要意义 。 我们通 过对 HA家系作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 , 对 HB家系用直接核苷酸测序确定 F9基因突变 , 并联合应用对 2个基因相应 STR位点的遗传连锁 分析 , 建立了 1种简便 、快速的血友病携带者检测 与产前诊断的方法 , 现报道如下 。
陆晔玲 1 丁秋兰 1 戴菁 1 王鸿利 2 奚晓东 3 王学锋 1 (1.上海交通大学医学院附属瑞金医院 临床输血科 , 上海 200025;2.上海血液学研究所 ;3.基因组学国家 重点实验室 )
摘要 :目的 建立 1种简便 、快速的血友病携带 者检测 与产前 诊断体 系 。 方法 对 38 个血友病 A家系 , 用 长链 PCR及序列特异 PCR作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 ;有家族史家系可联合 F8基因 内外的 8个多态 性 位点进行遗传 连锁 分 析 , DXS52(ST14)位 点多 态 性以 PCR产物 凝 胶 电 泳法 检 测 , 7 个 STR位 点 (F8Civs13、 CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的 多 态性 以多 重荧 光 PCR法检 测 , 产 前诊 断 加用 性别 位 点 (Amelo);对于散发家系 , 通过直接核苷酸测序查找先证者的基因 突变 , 继而对 家系女 性成员作 携带者 与产前 诊 断 。 对 12个血友 病 B家系采用直接核苷酸 测序法确定基因突 变 , 多重 荧光 PCR法检测 F9基因外 6 个 STR位 点 (DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性 。 结果 38个血友病 A家系 中 , 10名 先 证者的 F8基因内含子 22倒位检测为阳性 , 1例先证者为 F8基因内含子 1倒位阳性 , 对于有家族史的家系 , 综合 应用倒位检测和遗传连 锁分析 , 携带者与产前诊断率均为 100%;4个散发家系 均可找到 致病突变 ;38个血友 病 A家系的携带者及产前 诊断总诊断率为 94.81% 。 12 个血友 病 B家 系中有 10个家 系通过 直接 测序可 找到 突 变 , 联合 F9基因外 6 个 STR位点对血友病 B家系的遗传连锁分析的可诊断率为 96.88%。 结论 F8基因内 含 子 22及 1倒位筛检联合 F8基因内 、外多个位点 的遗传连锁分析可 以进行血 友病 A的 携带者及 产前诊 断 ;直 接 核苷酸测序可确定 F9基因突变 , 而联合基因外多个多态 性位点检测并进行遗传连锁分析 , 是血友 病 B携带者 检 测与产前诊断的简便 、快速的方法 。 关键词 :血友病 ;携带者检测 ;产前诊断 ;倒位检测 ;核苷酸测序 中图分类号 :R457.1 文献标识码 :A 文章编号 :1004-549X(2008)04-0259-06 Carrierdetectionandprenataldiagnosisofhaemophilia LUYeling, DINGQiulan, DAIJin, etal.Departmentof Transfusion, RuijinHospital, Shanghai200025, China AbstractObjects Toestablishasimple, rapidcarrierdetectionandprenataldiagnosissystem forhemophilia. Methods Thirty-eightHAfamiliesweretestedfortheintron22 and1 inversionsinfactorVIIIgenebyLD-PCRand PCR.Theremaininginversionnegativefamilies, butwithfamilyhistory, werescreenedusinglinkageanalysiswith8 combined polymorphic markers, including St14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073, and DXS1108.Forsporadicfamilies, thewholegenesequencingwasapplieddirectlytodetectthemutation.ForHBfamilies, linkageanalysiswith6 STRs, includingDXS1192, DXS1211, DXS8094, DXS8013, DXS1227 andDXS102, wasappliedtogetquickdiagnosticinformation.Thewholegenesequencingwasusedtogetthefinaldiagnosis.TherapidfluorescentPCRcombinedwithpolymorphism markerswereappliedforlinkageanalysisinHAandHBfamilies, respectively.Assoonasthepregnancywasidentified, additionalAmelositedetectionwouldbeperformed.Results In38 HA families, introns22 and1 inversionswerefoundin10 and1 probands, respectively.ThediagnosticratesofSt14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073 andDXS1108 were61.11%, 76.67%, 71.43%, 70.59%, 62.50%, 10.00%, 75.00% and50.00%, bininginversiondetectionandlinkageanalysis, thediagnosticrateofcarrierdetectionandprenataldiagnosisoffamilieswithHAfamilyhistorywereboth1 00%.Oneintron22 inversionand3 mutationsweredetectedin4 sporadicfamilies.Thetotaldiagnosticrateof38 HAfamilieswas94.81%. And10 mutationsweredetectedinthe12 binedwiththelinkageanalysis, thetotaldiagnosticratewas 96.88%.Conclusions Introns22 and1 inversionscreeningcombinedwiththelinkageanalysis, usingthehighlyinformativepolymorphicmarkers, canbeusedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisinChineseHAfamilies.ThedirectsequencingofFⅨ withthelinkageanalysiscanbesuccessfullyappliedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisof HBfamilies. Keywords:Haemophilia;Carrierdetection;Prenataldiagnosis
DO I :10.13303/j .c jbt .issn.1004 -549x .2008.04.024
中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4· Nhomakorabea259·
· 论 著 ·
血友病携带者与产前基因诊断
献 [ 2]方法操作 , 根据扩增产物的片段长度进行判 断 :正常人的 LD-PCR产物片段为 12kb, 男性若发 生 F8基因内含 子 22 倒位 , LD-PCR产物片段为 11kb, 即可诊断为血友病 A;与其有血缘关系的女 性携 带 者 的 LD-PCR产 物 片 段 也 相 应 为 12 及 1 1kb。 1.4.2 PCR法检测 F8基因内含子 1倒位 按文献 [ 1, 4]方法操作 , 分别扩增 F8 基因内含子 1中的 Int1h-1片段及 F8 基因外的 Int1h-2 片段 , 产物经 琼脂糖凝胶电泳 25min后 , 紫外光下观察电泳条带 并摄影 。 1.4.3遗传连锁分析 间接诊断 。 1)PCR法检测 ST14(VNTR):参照文献 [ 2]引物及扩增条件 ;2)多 重 荧 光 PCR法 作 多 态 性 遗 传 分 析 :DXS15、 DXS9901、 G6PD、 DXS1073、 DXS1108、 F8Civs13、 CA22(图 1)和性别位点 (牙釉蛋白基因 ), 终产物 在 X染色体为 106bp, 在 Y染色体为 112bp。参考 文献 [ 1, 5]方法重新设计引物 (表 1), 所有引物有 着相同的退火温度 ;PCR反应分为 2组 (含引物 4 对 /组 ), 体 系均为 10μl, 含 1μl10 ×buffer, 0.4μl 25mmol/LMg2+, 0.2μl(dNTP各 2.5 mmol/L), 100ngDNA模板 , 0.3UHotstarTaqDNA聚合酶及 0.3μl引物混合液 (5μM);PCR反应条件 :95℃预 变性 15min, 94℃变性 20s, 62℃退火 40s, 72℃延伸 60s, 11 个 循环 , 每个 循 环退 火温 度 下降 0.5℃, 94℃变性 20s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 60s, 20个循 环 , 72℃最后延伸 8min;结果用 Genescan和 Genotyper软件 (AppliedBiosystems)分析判断 。