基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术
分子生物学技术在基因诊断中的应用
分子生物学技术在基因诊断中的应用随着科学技术的飞速发展和基因研究的深入推进，基因诊断技术愈发成熟和完善，分子生物学技术也逐渐成为了基因诊断的重要方法之一。
分子生物学技术所具有的高效、高灵敏度和高特异性等特点，使其成为了基因诊断的重要手段，被广泛应用于基因相关疾病的诊断、筛查和治疗等方面，为人类健康事业做出了重要贡献。
一、分子生物学技术在基因诊断中的概念分子生物学技术主要是应用于研究物种遗传机制、基因表达调控、蛋白质结构和功能以及细胞分子机制等方面的技术手段。
而在基因诊断中，主要应用的是PCR技术、DNA测序技术、基因芯片技术和核酸杂交技术等。
1、PCR技术PCR技术，即聚合酶链式反应技术，是通过特定引物和热稳定的DNA聚合酶，对DNA片段进行大量扩增，并在扩增过程中进行定量、分型和序列检测等操作的一种技术手段。
PCR技术在基因诊断中主要应用于单基因遗传性疾病的检测、突变分析、基因多态性检测和分型等方面。
2、DNA测序技术DNA测序技术，即基因组测序技术，是通过对DNA片段进行全基因组或部分基因组的高通量测序技术，获取基因组DNA的全面信息，筛查潜在基因变异、诊断稀有疾病和进行基因组学研究等方面。
DNA测序技术在基因诊断中主要应用于遗传性疾病的突变分析和基因检测等方面。
3、基因芯片技术基因芯片技术，即基因芯片微阵列技术，通过将已知基因序列或变异数据存储在芯片上，将物种的基因信息快速获取和分析。
基因芯片技术在基因诊断中主要应用于基因突变和多态性检测、癌症基因的筛查和诊断以及基因表达谱的分析等方面。
4、核酸杂交技术核酸杂交技术，即Southern blotting技术，是通过DNA片段的特异性杂交，检测特定序列的存在和变异情况的一种技术。
核酸杂交技术在基因诊断中主要应用于基因探针的制备、分析和检测，特别是在遗传性疾病和癌症基因的诊断和研究方面发挥了重要的作用。
二、分子生物学技术在基因诊断中的实际应用分子生物学技术在基因诊断中的实际应用极为广泛，主要表现在以下几个方面：1、单基因遗传性疾病的检测和分型单基因遗传性疾病是由单个基因突变所导致的遗传性疾病，如先天性耳聋、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和先天性遗传异常等。
基因诊断
基因诊断作者：陈志宁来源：《新一代》2011年第05期摘要：基因诊断是通过分子生物学和分子遗传学的技术，用标记的DNA（或RNA）片段做探针，应用核酸分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，从而对疾病做出判断。
探针必须是只与目标DNA序列杂交的高度特异性的DNA（或RNA）片段。
基因组中碱基的变化可能导致限制酶酶切位点的消失或新的酶切位点的出现，从而使限制酶酶解获得的限制性片段（RF）的长度和数目发生改变。
根据RF与探针杂交后的图谱可进行产前诊断。
关键词：核酸分子杂交；基因探针；变性；限制性片段；产前诊断中图分类号：G620 文献标识码：A 文章编号：1003-2851（2011）05-0188-02基因作为生命的物质基础，其结构和功能的改变会导致表型改变，因而探查基因的状态有可能对疾病作出诊断，这种在基因水平上对疾病进行诊断就叫基因诊断，又叫分子诊断或DNA诊断。
基因诊断检测的疾病主要有3大类：感染性疾病的病原诊断、恶性肿瘤的诊断、遗传病的基因异常分析。
一、核酸分子杂交原理互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交，这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA 之间进行。
因此，当用一段已知基因的核酸序列经标记制成探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而在被检测基因组DNA中找到目的基因。
特异的DNA探针与被检基因组DNA都变性呈单链状态时就能进行分子杂交。
二、基因探针2.1基因探针携带基因的遗传信息，是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列经标记制成。
可以为基因的全部，也可以是基因的一部分；可以是DNA，也可以是由DNA转录来的RNA。
2.2探针来源①基因组探针：来自基因组中有关的基因本身②cDNA探针：从相应的基因转录获得的mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针。
临床分子生物学检验技术
04
优势：快速、准确、灵敏度高
05
局限性：成本高、技术要求高、需要专业人员操作
遗传病诊断
基因检测：通过基因测序技术， 检测遗传病相关基因突变
产前诊断：通过基因检测，评估 胎儿遗传病风险，指导优生优育
遗传咨询：根据基因检测结果， 提供遗传病风险评估和预防建议
药物治疗：根据基因检测结果， 制定个性化的药物治疗方案
04 跨界合作：与其他领域的技 术相结合，如人工智能、大 数据等，为分子生物学检验 技术带来更多的市场机遇。
汇报人：xxx
液体活检技术的发展： 通过血液样本检测肿瘤 细胞，提高了肿瘤检测
的准确性和便捷性
生物芯片技术的应用： 用于基因表达分析、 基因分型等，提高了 检测效率和准确性
单细胞测序技术的发展： 实现了对单个细胞的基 因表达分析，提高了检
测的灵敏度和分辨率
基因编辑技术的发展： CRISPR/Cas9等基因 编辑技术的出现，为基 因治疗提供了新的可能
市场前景与机遇
01 市场需求：随着人们对健康 重视程度的提高，分子生物 学检验技术在医疗领域的应 用将越来越广泛。
02 技术进步：随着分子生物学 技术的不断发展，检验技术 将更加精准、高效，为市场 带来更多机遇。
03 政策支持：政府对医疗领域 的投入加大，为分子生物学 检验技术的发展提供了有利 的政策环境。
生物学与工程学的融合：分子 生物学检验技术需要利用工程 学原理和方法，如微流控芯片、 纳米材料等，进行生物大分子 的检测和分析。
技术瓶颈与难题
技术难度：分子生物学检验技术涉及 多个学科，技术难度较大
成本问题：分子生物学检验技术成本 较高，难以普及
检测准确性：分子生物学检验技术检 测准确性有待提高
基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术
Sanger法测序原理：
• 每一次测序由一套四个单独的反应构成，每个反应含有 所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一 种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺 乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性 地在G,A,C,T处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而 定。每一dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反 应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有 共同的起始点，但终止在不同核苷酸上。可通过高分辨 率的变性凝胶电泳分离大小不同的片段。凝胶后可用X光胶片放射自显影或非同位素标记进行。
硼酸
55g
EDTA（粉末） 5.96g
加去离子水至800ml 高压蒸气灭菌，室温 保存
• 8%丙烯酰胺（含50%尿素）：
丙烯酰胺
38g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺 2g（变性胶液）
10×TBE
25ml
尿素
250g
加去离子水至500ml室温避光保存
• 固定液：
无水乙醇
冰醋酸
加一蒸水至
• 染色液：
AgNO3 加一蒸水至
PCR实验步骤：
• 变性（Denaturation） 将待扩增DNA模板加热，一般 变性温度为95℃，双链DNA变性成为单链DNA。
• 退火（Anealing） 两条引物分别与两条DNA的两翼序 列特异性结合——复性。退火温度（Tm）与引物序列 的碱基组成、长度相关。
• 延伸 ( Extention) 在适合的条件下，由Taq(或其 他)DNA聚合酶催化引导DNA合成，即引物的延伸。 延伸的温度一般是72℃， 这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循环。
2A 2B Target 2
•探针与靶序列杂交后，通过连接反应，就可形成一个完整的可扩增序列。 •每对探针的靶特异性序列与邻近的靶序列杂交，并通过热稳定的连接酶连接。 •每对探针只有与其靶序列完全匹配后才能被连接。
分子生物学 基因诊断ppt
基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交
方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知 核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随 后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小 的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分 子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，
PCR的基本反应步骤
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用 下 ， 以 dNTP 为原料 ，引物为复制 起点，模板 DNA的一条单 链在解链和退 火之后延伸为 一 条 双 链
变性 95 ℃ 变性，双链解链
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的 5℃左右）， 与模板DNA 互补退火形 成部分双链
二、基因诊断的特点
特异性高： 以分子杂交技术为基本原理
针对性强： 以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断” 。
灵敏度高： 基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人 类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的 单碱基改变。而且待测标本微量。 适应性强： 基因探针可为任何来源，任何种类，探针序 列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基 因亦可外源基因，诊断范围广。 安全高效、适应范围广、早期诊断、取样方便等
获得DNA片段条状图谱,便是所谓的DNA指纹。
谢谢
基因诊断
学院：环资学院 作者：毛新伟 学号：2013116011006
传统对疾病的诊断主要是以疾病的 表型改变为依据，如患者的症状、 血尿各项指标的变化，或物理检查 的异常结果，然而表型的改变在许 多情况下不是特异的，而且是在疾 病发生的一定时间后才出现，因此 常不能及时作出明确的诊断
产前诊断中的基因检测
产前诊断中的基因检测四川省妇幼保健院生殖中心；四川省计划生育科研所遗传室李运星以简炼的方式介绍产前诊断基因水平诊断的技术方法，并加以常见的病例给予说明，值得基层的产前诊断与优生优育工作者一阅。
基因检测在产前诊断中是十分重要，且正在不断发展与完善，其实质是在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。
基因诊断始于1978年，美国科学家首先将限制性片段长度多态性（RFLP）用于基因诊断，从而揭开了基因诊断的序幕，基因诊断不仅可以明确指定个体是否患病，存在基因缺陷并揭示基因状态，而且可以对表型正常的携带者、对某种疾病的易感者作出诊断和预测。
分子遗传检测技术大致可分为酶谱分析法、聚合酶链反应（PCR）、探针杂交分析法、DNA测序等方法。
实际上，临床上多将这几种技术联合应用于基因检测。
一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。
DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶为RFLP。
任何一个基因内切大片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影响到限制性内切酶位点的丢失或获得，也很可能引起限制酶片段的大小和数量发生变化，因而这类基因突变可以通过限制性内切酶DNA或结合基因探针的杂交方法将突变找出。
例如1.镰形红细胞贫血症的基因诊断：已知镰形红细胞贫血症的突变基因是编码β珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，可用限制性内切酶MstⅡ进行检测。
因为这一突变使正常存在的MstⅡ切点消失，这就使正常情况下存在的1.1kb及0.2kb条带变成患者（纯合子）的1.3kb条带。
2.血友病A的诊断血友病A是一种X连锁隐性遗传病。
用VⅢ因子基因的cDNA片段作为探针对待检者DNA酶切片段进行杂交，就可检出VⅢ因子基因部分缺失的男性患者和女性携带者。
下图家系Ⅲ-1患有严重的血友病A，经VⅢ因子治疗后产生VⅢ因子抑制物。
分子生物学技术的应用
利用分子生物学技术改良生物材料的性能，提高其稳定性和功能性。
通过基因工程和蛋白质工程技术生产具有特定功能的生物制品，如药物、疫苗和酶等。
利用分子生物学技术对生物材料和生物制品进行质量控制和安全性评估，确保产品的安 全性和有效性。
通过分子生物学技术优化生物材料和生物制品的生产过程，提高生产效率和降低成本。
技术优势：环保、高效、可持续，适用于各种规模的环境治理项目。
生物监测技术定义：利用生物个体或种群对环境变化的敏感反应，对环境污染进行监测和评 估的方法。
生物监测技术的优势：直接反映生物与环境的相互关系，提供环境污染对生态系统影响的实 时信息。
生物监测技术的应用范围：水质监测、土壤污染监测、空气质量监测、生态毒理学研究等。
生物监测技术的未来发展：随着基因组学、蛋白质组学等技术的发展，生物监测技术将更加 精准和高效。
生物技术在污水处理中的应用：利用微生物降解有机污染物，提高水质。
生物技术在土壤修复中的应用：利用植物、微生物去除土壤中的重金属和有机污染物， 恢复土壤生态功能。
生物技术在空气净化中的应用：利用微生物、植物等生物材料吸收、转化空气中的有害 物质，改善空气质量。
生物标志物在个性化治疗中的应用：根据患者的生物标志物特征，可以制定个性化的治疗方案， 提高治疗效果。
简介：基因改良作物是通过分子生物学技术对植物基因进行改造，以获得抗逆性 更强、产量更高、品质更优的农作物。
原理：利用基因工程技术将优良基因导入植物细胞，实现基因的重组和优化，进 而改良植物性状。
基因治疗：利用基因工程技术修复或替换缺陷基因，为遗传性疾病和恶性肿瘤等疾病的治疗提 供新途径。
蛋白质组学研究：蛋白质组学技术不断发展，将有助于深入了解生命过程和疾病机制，为药物 研发和个性化医疗提供支持。
医学遗传学名词解释
1、携带者(carrier)是指表现型正常，但携带有致病遗传物质的个体。
其体指：①携带有隐性致病基因，本人表现正常的个体；②携带有显性致病基因，但没有外显的正常个体；③携带有致病基因，迟发个体；④染色体平衡易位或倒位的个体。
2、系谱分析(pedigree analysis)家系分析是一诊断遗传疾病的重要步骤，根据系谱图，对家系进行回顾性分析，以便确定所发现的某一特定性状或疾病在这个家族中是否有遗传因素的作用及其可能的遗传方式。
3、产前诊断（prenatal diagnosis)产前诊断称为宫内诊断，是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形做出准确的诊断。
4、绒毛取样法（chorionic sampling）绒毛取样法又称为绒毛吸取术，是通过特制的取样器，经孕妇阴道、宫颈进入子宫，达到胎盘处后吸取一定数量的胎儿绒毛组织。
5、基因诊断(gene diagnosis)应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断，又称为分子诊断。
6、聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)它是模拟体内条件卜应用DNA酶反应特异性扩增某一DNA片段的技术。
7、遗传标志(genetic marker)所谓遗传标志是群体中存在多态性而遗传上遵循孟德尔规律的，同时不受环境影响而改变的特征物，如染色体上的某些结构、HLA类型以及特征性的DNA序列等。
8、核酸杂交(nuclear hybridization)是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。
其原理是核酸变性和复性理论。
即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。
9、基因芯片技术(gene chip technique)基因芯片技术是大规模、高通量分子检测技术。
将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点。
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MLPA
Mlpa技术原理.
设计探针
人工合成的寡聚核苷酸 M13转染的寡聚核苷酸 1A 1B 2A 2B
引物x连接部位 短探针 长探针 填充片段 引物y连接部位
多重杂交和连接
不匹配探针不连接 1A 1B 目的片段1 2A 1B 目的片段 1 2A 2B 目的片段2
用共同引物x和y对探针进行PCR扩增
结果分析（以DMD为例）：
DMD基因位于X染色体上。在反应中含有一条 检测SRY基因的探针，如果是女性，即无此 峰。通过与正常男性和女性样品对照样品比 较，对应位置没有出现波峰，提示此外显子 缺失或男性半合子缺失；如果样品为女性， 当该峰值大约为正常女性对照样品的一半或 与其他外显子峰相比明显降低，则表示该样 品存在此外显子杂合性缺失。同样，波峰增 高大致为正常男性的倍数，提示此外显子出 现拷贝数增加，为重复突变。一倍为杂合突 变，两倍为纯和突变。
• 实验原理 • 主要试剂 • 实验步骤
实验原理：
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交 联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过 硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED)作为加 速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的 高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网 状结构。具有浓缩效应、电荷效应和分子 筛效应。当DNA分子进入凝胶，在电场下 进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而 得以分离 。
基因诊断与产前诊断中常用的 分子生物学技术
张淑杰
Commonly used Techniques
• • • • • PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA测序 MLPA 基因芯片
PCR
• 实验原理 • 实验步骤
PCR实验原理：
PCR (Polymerase chain reaction)即聚合酶链 式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母 链DNA为模板，以特定引物为延伸起点， 通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制 出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特 异地在体外扩增任何目的DNA。
Ratio
0.2 1
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
0
X-032.0 DMD exon 01 X-032.0 DMD exon 02 X-032.0 DMD exon 03 X-032.0 DMD exon 04 X-032.0 DMD exon 05 X-032.0 DMD exon 06 X-032.0 DMD exon 07 X-032.0 DMD exon 08 X-032.0 DMD exon 09 X-032.0 DMD exon 10 X-032.0 DMD exon 21 X-032.0 DMD exon 22 X-032.0 DMD exon 23 X-032.0 DMD exon 24 X-032.0 DMD exon 25 X-032.0 DMD exon 26 X-032.0 DMD exon 27 X-032.0 DMD exon 28 X-032.0 DMD exon 29 X-032.0 DMD exon 30 X-032.0 DMD exon 41 X-032.0 DMD exon 42 X-032.0 DMD exon 43 X-032.0 DMD exon 44 X-032.0 DMD exon 45 X-032.0 DMD exon 46 X-032.0 DMD exon 47 X-032.0 DMD exon 48 X-032.0 DMD exon 49 X-032.0 DMD exon 50 X-032.0 DMD exon 61 X-032.0 DMD exon 62 X-032.0 DMD exon 63 X-032.0 DMD exon 64 X-032.0 DMD exon 65 X-032.0 DMD exon 66 X-032.0 DMD exon 67 X-032.0 DMD exon 68 X-032.0 DMD exon 69 X-032.0 DMD exon 70 c c c c c
PCR实验步骤：
• 变性（Denaturation） 将待扩增DNA模板加热， 一般变性温度为95℃，双链DNA变性成为单链 DNA。 • 退火（Anealing） 两条引物分别与两条DNA的两 翼序列特异性结合——复性。退火温度（Tm）与 引物序列的碱基组成、长度相关。 • 延伸 ( Extention) 在适合的条件下，由Taq(或其 他)DNA聚合酶催化引导DNA合成，即引物的延伸。 延伸的温度一般是72℃， 这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循 环。
DNA测序：
• 实验原理（Sanger法） • 实验步骤
DNA测序原理：
• 目前用于测序的技术主要有Sanger等发明 的双脱氧链末端终止法和Maxam 和Gilbert 发明的化学降解法。这两种方法原理上差 异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的 点开始，随机在某一特定的碱基处终止， 产生A,T,G,C四组不同长度的一系列核苷酸， 然后再变性的PAGE胶上电泳进行检测，从 而获得DNA序列。在这里主要讲解我们实 验室的测序法——Sanger双脱氧链终止法
对比其他技术，MLPA 能检测的范围更广，小到点 突变，大到染色体的缺失和重复
MLPA技术应用
• 用于检测人类基因或基因片段的缺失或重 复（如DMD基因诊断及SMA基因诊断等） • 用于检测染色体重排 • 用于检测单核苷酸多态性（SNP)和突变 • 用于检测染色体三体性 • 检测肿瘤（甲基化特异性MLPA,MS-MLPA)
脱 氧 核 苷 酸 与 双 脱 氧 核 苷 酸 结 构
DNA复制是按着5’（核苷酸戊糖的5位碳原子 处接着的磷酸基团）向3’（核苷酸戊糖的3 位碳原子处接着的羟基基团）方向进行的。 在DNA复制过程中起关键作用的酶是DNA 聚合酶，该酶只能将游离的核苷酸加到新 链的3’端（而绝不是5’端）。因为双脱氧的 核苷酸3’端的羟基也脱了氧，所以就不能继 续形成3’，5’-磷酸二酯键了，所以新链不能 继续延伸，故DNA复制终止于双脱氧核苷 酸处。
•
8%丙烯酰胺（含50%尿素）： 丙烯酰胺 38g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 2g（变性胶液） 10×TBE 25ml 尿素 250g 加去离子水至500ml室温避光保存
• 固定液： 无水乙醇 冰醋酸 加一蒸水至 • 染色液： AgNO3 加一蒸水至 • 显色液： NaOH 甲醛 加一蒸水至500ml
Sanger法测序原理：
• 每一次测序由一套四个单独的反应构成，每个反 应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并 混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G,A,C,T处 终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应 得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们 具有共同的起始点，但终止在不同核苷酸上。可 通过高分辨率的变性凝胶电泳分离大小不同的片 段。凝胶后可用X-光胶片放射自显影或非同位素 标记进行。
MLPA是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技 术。这一技术最先于2002年由荷兰的 Schouten JP等报道。并非通过 PCR扩增样本DNA,而是扩增与DNA靶序列杂交的探针。每个MLPA探针均 是由两个寡核苷酸序列所组成，两者特异性地与互补的DNA靶序列结 合，且两者结合的位点是毗邻的。在连接酶的作用下，两者连接成为 单一的分子。此外，所有的探针均含有序列相同的侧翼序列，因此， 使用带有荧光的通用引物即可使其呈指数形式地扩增。在针对某一特 定基因的MLPA试剂盒中，probemix含有所有针对不同位点的探针，为 所有探针的混合物。但是每一种探针扩增后的片段长度却是独一无二 的，从130bp-480bp不等。因此在进行毛细管电泳时，其电泳的速度 也会存在明显的区别。只有寡核苷酸与DNA靶序列充分结合后，才能 在连接酶的作用下发生连接反应，进而扩增并获得相应探针的扩增峰。 如果待检DNA样本与探针结合的靶序列区域存在点突变或者片段的缺 失或重复，则探针与其杂交的过程就会受阻，进而影响最后的扩增信 号收集。
目的片段的指数扩增
PCR反应体系（终体积20~100ul）：
• • • • • • 10×PCR缓冲液 2mmol/L dNTP 引物 DNA模板 Taq DNA聚合酶 ddH2O 1/10体积 1/10体积 各10~50pmol 10~20拷贝 0.2~2.5U 补至终体积
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
我们实验室基于Sanger法实现的 DNA自动测序原理图：
DNA测序大体步骤：
• • • • 测序模板PCR 测序产物纯化——酒精/EDTA/NaAc法 上机毛细管电泳——高分辨率变性胶电泳 数据处理
MLPA
• • • • • 实验原理 操作流程 主要优点 技术应用 结果分析（以DMD为例）
MLPA实验原理：
MLPA
片段分析
样本
对照
•扩增产物通过毛细管电泳分离和定量。 •通过比对对照样本判断目的序列的拷贝数。 •每个峰值大小（或面积）表示该目的片段扩增数量在所有扩增片段总量中所占的 比值；每个峰的位置由其片段大小决定。
MLPA操作流Biblioteka ：（1）DNA变性和杂交 （2）连接反应 （3）PCR反应 （4）PCR产物扫描与数据分析
主要试剂：
• 30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺 29g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 1g（非变性胶液） 加去离子水至100ml 室温避光保存 10%过硫酰铵（APS）： 过硫酰铵 1g 加去离子水至10ml 4℃避光保存
•
• •
TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺） 4℃避光保存 10×TBE： Tris碱 86.4g 硼酸 55g EDTA（粉末） 5.96g 加去离子水至800ml 高压蒸气灭菌，室温 保存
毛细管电泳 结果分析