碱性蛋白酶活力测定
碱性蛋白酶检测
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碱性蛋白酶检测
碱性蛋白酶（Alkaline protease）是属于内肽酶中的一种丝氨酸蛋白酶类，在碱性环境下作用于肽键，可将蛋白质水解为氨基酸、多肽以及游离氨基酸，还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能，广泛应用于酶洗涤剂工业、食品加工、酿造、医药和皮革加工等领域。
迪信泰检测平台采用生化法，结合相应的酶类的试剂盒可以高效、精准的检测碱性蛋白酶的活性变化。
此外，我们还提供其他酯酶类的检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定碱性蛋白酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 碱性蛋白酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
Folin法测定碱性蛋白酶活性
• 2、碱性蛋白酶活力计算 • 酶活力(μg/ml) = K· A· N· 4/10
• K-标准曲线斜率的倒数 A-吸光度值 N - 酶的稀释倍数10000倍
• 4-反应总体积为4mL
10 - 反应时间为10min
• 将两个样品测定结果取平均值后代入公式，计算酶活
五、实验注意事项
精密电子天平分光光度计恒温水浴锅容量瓶刻度吸管或可调式移液器烧杯量筒滤纸folin试剂碳酸钠盐酸氢氧化钠三氯乙酸酪蛋白酪氨酸7对照标准酪氨酸ml0103040506070002mollhclml08070605040310naml50folin试剂ml10混匀水浴4020min冷却后680nm波长处比色1标准曲线测定取试管干净7支分别吸取标准酪氨酸010203040506于试管中并用02mollhcl溶液稀释至10ml分别加入04mollna50ml再加入folin试剂10ml混匀置于40恒温水浴中20min冷却后于680nm波长处比色
实验一
Folin法测定碱性蛋白酶活性
Folin法测定碱性蛋白酶活性
• 一、实验目的 • 了解蛋白酶活测定方法及原理，掌握其基
本操作。
二、实验原理
• （1）碱性蛋白酶：能催化蛋白质水解，它不仅能水解肽键，
也能水解酰胺键和脂键等，因此可以利用酪蛋白为底物进行
水解反应。 • （2）Folin试剂：磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下 不稳定，可被酚类化合物还原，而呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合 物）由于蛋白质或者水解产物中含有具酚基的氨基酸（如酪 氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），故也可呈上述反应。 • 本实验就是利用碱性蛋白酶水解产物中含有酚基的氨基酸的 呈色反应强度来表示蛋白酶活性。
二、实验原理
蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力的测定1范围本文件规定了酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定方法。
本文件适用于酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.1中性蛋白酶活力单位neutral protease active unit在温度为40℃、pH值为7.2的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个中性蛋白酶活力单位。
3.2酸性蛋白酶活力单位acidic protease active unit在温度为40℃、pH值为3.0的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个酸性蛋白酶活力单位。
3.3碱性蛋白酶活力单位alkaline protease active unit在温度为40℃、pH值为10.5的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个碱性蛋白酶活力单位。
4原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，可将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。
采用分光光度计（波长660nm）测定其吸光度，进而计算蛋白酶活力。
5试剂和材料5.1试剂除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。
5.1.1钨酸钠（Na 2WO 4·2H 2O）。
5.1.2钼酸钠（Na 2MoO 4·2H 2O）。
5.1.3硫酸锂（Li 2SO 4）。
5.1.4溴（Br）。
5.1.5无水碳酸钠（Na 2CO 3）。
5.1.6三氯乙酸（CCl 3COOH）。
蛋白酶活力的测定
1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。
1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。
其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。
以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。
表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取 100 μg/mL 酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。
图 2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。
03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
实验三. 碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
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碱性蛋白酶活力测定
1 定义
1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1µg酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
2 福林法
2.1 原理
碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2.2 试剂和溶液
2.2.1福林酚试剂已配
2.2.2 碳酸钠溶液c(Na
2CO
3
)=0.4mol/L
称取无水碳酸钠(Na
2CO
3
)21.2g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.3 三氯乙酸（CCl
3
·COOH）=0.4mol/L
称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.05mol/L
按GB601配制。
2.2.5 硼酸缓冲溶液（pH10.5）
甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述缓冲溶液，需用pH计校正。
2.2.6 10g/L 酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。
2.2.7100µg/mL L-酪氨酸标准溶液
a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100µg/mL L-酪氨酸标准溶液。
2.3 仪器和设备
2.3.1恒温水浴（40±0.2）℃
2.3.2 分光光度计 应符合GB 9721的规定。
2.4 分析步骤 2.4.1 标准曲线的绘制
a. L-酪氨酸标准溶液 按附表1配制。
表1 L-酪氨酸标准溶液
b.分别取上述溶液各1.00mL (需做平行试验)，各加0.4mol/L 碳酸钠溶液5.00mL 、福林试剂使用溶液1.00mL ，置于（40±0.2）℃水浴中显色20min ，取出，用分光光度计与波长680nm ，100mm 比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A 为纵坐标，酪氨酸的浓度c 为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（µg），即为吸光常数K 值。
其K 值应在95～100范围内。
2.4.2 测定
酶液制备：精确称取干酶粉1g （±0.001），加入10mL 缓冲液（2.2.5），在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静置片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL 容量瓶中。
用缓冲液定容至刻度，充分摇匀，用四层纱布过滤。
吸取滤液5mL ，移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液位稀释2000倍的酶液。
（稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活）
a.先将酪素溶液放入（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min 。
b.按下列程序操作： ↓ ↓
↓（40±0.2）℃，2min ↓（40±0.2）℃，2min
↓ （
40±0.2）℃，10min ↓（
40±0.2）℃，10min
↓ ↓
↓
2.5 计算
X=A ×K ×4/10×n=2/5×A ×K ×n 式中 X-样品的酶活力（u/g 或u/mL ）
A-样品平行试验的平均吸光度 K-吸光常数
4-反应试剂总体积（mL ） 10-反应时间10min ，以1min 计 n-稀释倍数
所得结果表示至整数。
2.6 思考题
实验过程中添加三氯乙酸的作用？。