第三章 蛋白质2
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分子生物学第三章蛋白质大分子结构与功能
• 如肌红蛋白。
49
4.蛋白质四级构造
一个蛋白质由几条多肽链组成1个活性单 位。亚基的相互关系，空间排布，亚基 间通过非共价键聚合成的特定构象。单 一亚基无活性，只有聚合后才有生物活 性。如血红蛋白。
50
51
蛋白质预测网站
Compute pI/WM ://expasy.hcuge.ch Predictprotein :// embl-heidelberg.de/predictprotein/ SOPMA :// ibcp.fr/predict.html Unpredict ://www /
43
44
45
46
构造域
• 多肽链在超二级构造根底上进一步卷 曲折叠成严密的近似球状的构造。对 较小蛋白质分子，构造域往往就是三 级构造，即这些蛋白质是单构造域。
• 许多蛋白质是多构造域。
47
构造域
48
3.蛋白质三级构造
• 多肽链的某些区域氨基酸形成二级构造: α螺旋、β-折叠、 β-转角、无规那么卷曲等构 象单元, 然后相邻二级构造集装成超二级构 造, 进而折叠绕曲成构造域, 由2个或2个以上 的构造域组装成三级构造。
30
二 硫 键
31
一级构造确定的原那么
• 测定蛋白质中氨基酸组成 • 蛋白质N端和C端的测定 • 2种以上方法水解蛋白质，得到一系列
肽段 • 别离提纯所得肽，测其序列 • 从有重叠构造的肽序列中推断蛋白质
的全部氨基酸的排列顺序
32
〔二〕蛋白质的空间构造
• 肽平面：肽腱中的4个原子以及相邻的 2个α-碳原子处在同一平面，使肽链具 有一定的稳定性
20
氨基酸与异硫氰酸苯酯的反响
• AA的氨基可与异硫氰酸苯酯(PITC)反 响,生成苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)。 所得PTC-AA经乙酸乙酯抽提→层析鉴 定→ 确定N端氨基酸的种类。 “多肽 顺序自动分析仪〞据此原理。
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4.蛋白质四级构造
一个蛋白质由几条多肽链组成1个活性单 位。亚基的相互关系，空间排布，亚基 间通过非共价键聚合成的特定构象。单 一亚基无活性，只有聚合后才有生物活 性。如血红蛋白。
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蛋白质预测网站
Compute pI/WM ://expasy.hcuge.ch Predictprotein :// embl-heidelberg.de/predictprotein/ SOPMA :// ibcp.fr/predict.html Unpredict ://www /
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构造域
• 多肽链在超二级构造根底上进一步卷 曲折叠成严密的近似球状的构造。对 较小蛋白质分子，构造域往往就是三 级构造，即这些蛋白质是单构造域。
• 许多蛋白质是多构造域。
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构造域
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3.蛋白质三级构造
• 多肽链的某些区域氨基酸形成二级构造: α螺旋、β-折叠、 β-转角、无规那么卷曲等构 象单元, 然后相邻二级构造集装成超二级构 造, 进而折叠绕曲成构造域, 由2个或2个以上 的构造域组装成三级构造。
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二 硫 键
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一级构造确定的原那么
• 测定蛋白质中氨基酸组成 • 蛋白质N端和C端的测定 • 2种以上方法水解蛋白质，得到一系列
肽段 • 别离提纯所得肽，测其序列 • 从有重叠构造的肽序列中推断蛋白质
的全部氨基酸的排列顺序
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〔二〕蛋白质的空间构造
• 肽平面：肽腱中的4个原子以及相邻的 2个α-碳原子处在同一平面，使肽链具 有一定的稳定性
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氨基酸与异硫氰酸苯酯的反响
• AA的氨基可与异硫氰酸苯酯(PITC)反 响,生成苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)。 所得PTC-AA经乙酸乙酯抽提→层析鉴 定→ 确定N端氨基酸的种类。 “多肽 顺序自动分析仪〞据此原理。
03-蛋白质的三维结构
目录
2．酰胺平面与二面角
肽键具有部分双键的性质， 不能自由转动。因此，每个肽 单位的六个原子都被酰胺键固 定在同一个平面上，这一平面 称为酰胺平面，也叫肽平面。 它是一个刚性平面，参与肽键 的6个原子C1、C、O、N、H、 C2的相对位臵都是固定不变的。 位于同一平面，C1和C2在平 面上所处的位臵为反式构型。
第三章 蛋白质的高级结构
一、蛋白质的一级结构 二、蛋白质的二级结构 三、蛋白质的三级结构 四、蛋白质的四级结构 五、稳定蛋白质三维结构的作用力 P207，掌握
目录
引言
蛋白质的多肽链并不是线形伸展的，而是 按一定方式折叠盘绕成特有的空间结构。 蛋白质的三维构象，也称空间结构或高级 结构，是指蛋白质分子中原子和基团在三 维空间上的排列、分布及肽链的走向。高 级结构是蛋白质表现其生物功能或活性所 必须的，包括二级、三级和四级结构。
首 N端
末C 端
其中的氨基酸称 氨基酸残基
目录
一级结构
1969年，国际纯化学和应用化学协会经过讨论规定一级 结构只指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，又称共 价结构、主链结构。其内容包括：肽键、氨基酸的种类 和数目，氨基酸的排列顺序、肽链数目、二硫键及酰胺 基的位置等。
一级结构要点：
1.蛋白质通过肽键-CO-NH-这一基本方式连接而成。
β转角
目录
β转角
作用力——同样 是肽键衍生来的 氢键 但由于只有这一 个氢键，只形成 β —转角结构。
O ……（ 氢 键 ）………H —C—（NH—CH—CO）2—N— R
目录
Ϋ-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称 之为发夹结构。 Ϋ转角的特征： ①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。 ②主链骨架以180°返回折叠。 ③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键 ④C1Ϊ与C4Ϊ之间距离小于0.7nm ⑤多数由亲水氨基酸残基组成。 在Ϋ转角中第一个残基地C=O与第四个残基地N-H氢键键 合，形成一个紧密地环，使Ϋ转角成为比较稳定地结构。 由于甘氨酸缺少侧链（只有一个H），在Ϋ转角中能很 好地调整其他残基地空间阻碍，因此是立体化学上最合 适地氨基酸，而脯氨酸具有环状结构和固定的φ角，因 此在一定程度上迫使Ϋ转角形成，促进多肽链自身回折。
第3章 蛋白质化学答案
第3章蛋白质化学答案第3章蛋白质化学答案第三章、蛋白质化学（一）氨基酸化学部分1、名称表述解：必需氨基酸：机体不能自行合成而必须从外界食物摄取的氨基酸。
ilemetvalleutrpphethrlys，对婴儿还有：arg、his。
非必需氨基酸：能够在人体内利用糖代谢中间产物转氨促进作用制备的氨基酸。
消旋作用：旋光性物质在化学反应中，其不对称原子经过对称状态的中间阶段，失去旋光性的作用。
消旋物：旋光性物质在化学反应中，产生d-型和l-型的等摩尔混合物，丧失旋光性的促进作用。
2、结构式丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸。
3、为什么共同组成蛋白质的基本单位就是氨基酸。
根据氨基酸侧链r基的极性可以分成哪几类？解：蛋白质水解产物是氨基酸。
分类：（1）非极性r基氨基酸（8种）：脂肪烃侧链的氨基酸（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸）；芳香族氨基酸：（苯丙氨酸、色氨酸）；甲硫氨酸（蛋氨酸）。
（2）、不拎电荷的极性r基氨基酸：7种；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸（3）、拎正电荷的r基氨基酸：碱性氨基酸，3种；赖氨酸、精氨酸、组氨酸。
（4）、拎负电荷的r基氨基酸：酸性氨基酸，2种；谷氨酸、天冬氨酸。
4、比较几种蛋白质水方法的特点。
求解：（1）、酸水解：产物不消旋，为l-氨基酸；色氨酸被全然毁坏；部分水解羟基氨基酸（丝氨酸或苏氨酸）被毁坏；asn、gln被毁坏。
（2）碱解：消旋，产物为d-和l-氨基酸的混合物；多数氨基酸破坏；色氨酸不被破坏（3）酶求解：不消旋，产物为l-氨基酸；不毁坏氨基酸；须要几种酶共同促进作用5、以芳香族氨基酸为基准表明其光吸收特点。
解：在可见光没有光吸收；在紫外部分有特征光吸收，酪氨酸275nm，苯丙氨酸257nm，色氨酸280nm。
6、何为氨基酸等电点？氨基酸在等电点时存有什么特性。
解：等电点：氨基酸处于正负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态时溶液的ph 值。
生化第3章_蛋白质_2
3000 ~ 80000D), G-100 (分级范围 4000 ~ 150000D)。
• 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕 • 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 • 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 • 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量
4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE)
1. 球状蛋白质（globular protein): 外形接近球形或椭圆形， 溶解性较好，能形成结晶，多数蛋白质属于这一类。 2. 纤维状蛋白质 (fibrous protein): 分子类似纤维或细棒, 又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。
二. 依据蛋白质的组成分类 按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白和结合蛋白。
×100% = 55.8/0.335 ×100 = 16700
2. 蛋白质的沉降分析： 利用超离心法 （ultracentrifuge）测定蛋白质及其它 生物大分子的分子量，有两种方法：沉降速度法和沉
降平衡法。
1）沉降速度法 (sedimentation velocity):
•
在 60 000～80 000 rpm 的高速离心力作用下，蛋白质 分子会沿旋转中心向外周方向移动，形成沉降界面， 界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速度。
★ 蛋白质沉淀的几种方法：
1.可逆沉淀: 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当 的条件下，可以重新溶解形成溶液，称为可逆沉淀或非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法。 1）pI 沉淀法：在温和条件下，通过改变溶液的 pH 或电荷状 况，使 pr 从胶体溶液中沉淀分离。
2）盐析法：加入大量中性盐（NaCl、(NH4)2SO4、Na2SO4）使 pr
• 测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕 • 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 • 再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕 • 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量
4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE)
1. 球状蛋白质（globular protein): 外形接近球形或椭圆形， 溶解性较好，能形成结晶，多数蛋白质属于这一类。 2. 纤维状蛋白质 (fibrous protein): 分子类似纤维或细棒, 又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。
二. 依据蛋白质的组成分类 按照蛋白质的组成，可以分为简单蛋白和结合蛋白。
×100% = 55.8/0.335 ×100 = 16700
2. 蛋白质的沉降分析： 利用超离心法 （ultracentrifuge）测定蛋白质及其它 生物大分子的分子量，有两种方法：沉降速度法和沉
降平衡法。
1）沉降速度法 (sedimentation velocity):
•
在 60 000～80 000 rpm 的高速离心力作用下，蛋白质 分子会沿旋转中心向外周方向移动，形成沉降界面， 界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速度。
★ 蛋白质沉淀的几种方法：
1.可逆沉淀: 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当 的条件下，可以重新溶解形成溶液，称为可逆沉淀或非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法。 1）pI 沉淀法：在温和条件下，通过改变溶液的 pH 或电荷状 况，使 pr 从胶体溶液中沉淀分离。
2）盐析法：加入大量中性盐（NaCl、(NH4)2SO4、Na2SO4）使 pr
生物化学第三章 蛋白质的功能及其与结构之间的关系
RR O2 O2
波尔效应
定效中义应吸：可CO是解2排指释氧HH+b。和为C什O么2促在进肺H中b释吸放氧O排2的CO现2，象而。在波肌尔肉 原进因Hb：从是R态H+转和变CO为2能T态够，与释H放b特O定2 位点结合，而促 与H+引发的波尔效应相关的基团有：亚基的N端
氨基、亚基的His122咪唑基以及b亚基的His146咪 唑基。 这三个基团在Hb处于T态的时候都是高度质子化的， 而当氧气与Hb结合以后，质子发生解离。如果溶 液中的pH降低，将有利于这三个基团处于质子化 状态，从而稳定T态，抑制氧气的结合。
2. 参与糖酵解的3-磷酸甘油醛脱氢酶以四聚体的形式存在于细胞液， 而当以单体的形式存在于细胞核的时候，它却是一种尿嘧啶DNA糖苷酶，参与DNA的碱基切除修复；
3. 大肠杆菌的生物素合成酶兼做其生物素操纵子的阻遏蛋白。
蛋白质结构与功能关系的一般原则
① 每一种蛋白质都具有特定的结构，也具有特定的功能。 一旦结构（特别是高级结构）破坏，其功能随之丧失。
α角蛋白的结构层次
烫发或直发的原理
β角蛋白
一级结构：富含Ala和Gly，具有重复序列Gly-Ala/Ser-Gly-Ala/Ser； 二级结构：主要是有序的反平行β折叠，还有一些无序的α螺旋和无
规则卷曲环绕在β折叠的周围。 β折叠赋予蛛丝强度，而α螺旋赋予蛛丝柔韧性。
蜘蛛丝中的丝心蛋白的结构层次
体积最小的Gly正好位于螺旋 的内部，构成紧密的疏水核 心，而Pro和Hyp 的侧链位于 三股螺旋的表面，面向外， 以尽量减少空间位阻。
每个Gly残基的NH与相邻的X 残基C=O形成氢键。
胶原蛋白的三股螺旋
原胶原的三股螺旋内和三股螺旋之间进一步形成共价交 联，增强稳定性，提高胶原蛋白机械强度。
第三章 蛋白质化学 第1-2节
=
-C-C-C-N-C-N
N+
Aromatic Trp W
-C-OH -CN
Amino Acid Subway Map
Arg R Basic
Lys K
-C-C-C-C-NH3
+
Tyr Y
-C-
-C-CONH2
-C-C-CONH2
Asn N
Asp D
-C-COOH
Gln Q Amide
Glu E Acidic
(1) α- 氨基参加的反应
①与亚硝酸反应（范斯莱克法测定氨基酸氮的依据）
可用来进行氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。 室温下
NH2 R-CH-COOH + HNO2
OH R-CH-COOH + N2 + H2O
②氨基酸的甲醛滴定(用于氨基酸定量分析)
氨基酸不能直接用酸、碱滴定来进行定量测定。
元素组成特点：蛋白质的含氮量接近于16%。 蛋白质系数：1克氮所代表的蛋白质质量(克数)。即6.25。
蛋白质系数是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。
粗蛋白含量 ＝样品含氮量 6.25
蛋白质含量 = 样品蛋白氮 6.25
元
素
C
50~55
H
6~8
O
20~23
N
15~18
百分比
有些还含有Ｓ／Ｐ／Ｆe/Cu/Zn/Mn等.
用纸电泳法分离氨基酸主要是根据氨基酸的极性不同。 下列氨基酸溶液除哪个外都能使偏振光发生旋转? A.丙氨酸 B.甘氨酸 C.亮氨酸 D.丝氨酸 在生理pH条件下。具有缓冲作用的氨基酸残基是 A.Tyr B.Trp C.His D.Lys 在生理条件下(pH6.0-7.0左右)，蛋白质分子中的 ____侧链和__侧链几乎完全带正电荷，但是___侧链 则部分带正电荷具有缓冲能力。 必需氨基酸包括哪些？
第3章 蛋白质的结构与功能
turn
g turn
Pro
剧烈转折
第三节 纤维状蛋白
• 蛋白分子从外形上可分为纤维蛋白和球形 蛋白； • 纤维蛋白外形呈纤维状或细棒状，分子轴 比(长轴／短轴)大于10。功能较简单，是 动物体的基本支架和外保护成分。 • 通常是疏水的，如角蛋白，丝心蛋白。 • 结构单元是重复的二级结构单元。
Y—肌（血)红 蛋白的氧饱和 度，等于蛋白 中被占的氧合 部位除以血红 蛋白中氧合部 位总数。
S形曲线的基础：血红蛋白为 别构蛋白
• 去氧血红蛋白：没有结合氧的蛋白，8个 盐桥连着，结构紧密，和氧亲和力低， 分子处于紧张态（T态）； • 氧合血红蛋白：结合氧的蛋白，盐桥断 裂，结构疏松，分子处于松弛态（R态）， 和氧亲和力高。
两个肽平面间不能任意转动
R 基团的大小与电 荷，会影响两个平 面之间的立体关系， 因此平面的转动受 限制，受限程度取 决于 R基团的种类。 这也说明了为何氨 + 基酸的序列，会影 响蛋白质的构型， 也因此决定了这个 蛋白质的功能。
二、二级结构的主要形式
• 结构形式：-螺旋、-折叠、无规则 卷曲。 • 连接单元：-转角 • 稳定作用力：氢键
3.613-螺旋 4.416-螺旋
a helix 的方向性
＋
左 手 旋
右 手 稳 定
有 极 性
—
各种 helix 的表达形式
影响-螺旋形成的因素
• 多肽能否形成α-helix以及helix是否稳定→ 由AA组成，顺序决定的
• 1）R基的电荷：酸性或碱性氨基酸集中的区域， 由于同电荷相斥，不利于α－螺旋形成； • 2） R基的大小：β碳上有大的基团
+
N
1）方向性 2）饱和性
食品化学 第三章 蛋白质
与茚三酮反应
与邻苯二甲醛反应
第二节
蛋白质和肽
肽：是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物。
由两个氨基酸以肽键相连的化合物称为“二肽”，由多个 氨基酸组成的肽则称为多肽。
N－末端 氨基末端
肽键
C－末端 羧基末端
特点：
肽键不同于C-N单键C=N双键 羰基不是完全的双键
肽键不能自由旋转
肽单位是刚性平面结构 肽单位平面有一定的键长和键角
抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构
4、蛋白质的四级结构
是指含有多于一条多肽链的蛋白质分子的空间排 列，以二聚体、三聚体、四聚体等形式存在。
稳定蛋白质结构的作用力
空间相互作用
金属离子 范德华力
二硫键
蛋白质结构稳定
氢键
疏水相互作用
静电相互作用
二硫键
氢键
疏水相互作用力
盐键（离子键）
范德华力
氢键
疏水相互作用
静电相互作用
5、蛋白质变性 概念 本质:分子中各种次级键断裂，使其空间构象 从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级 结构不破坏。 变性对蛋白质的影响 影响变性的因素(物理、化学)
第四节
蛋白质的功能性质
脂肪 糖
食品色泽 食品风味
相互作用
蛋白质 食品外形
构成
食品 品质
（4）有机溶剂：乙醇、丙酮
（5）促溶盐
改变水的介电常数，改变静电作用 非极性侧链在有机溶剂中比在水中更易溶解，有 机溶剂能穿透到疏水区，削弱或打断疏水相互作 用
低浓度（≤0.2）静电中和作用稳定了蛋白质的 结构
较高的浓度（＞1mol/L）离子特异效应
与邻苯二甲醛反应
第二节
蛋白质和肽
肽：是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物。
由两个氨基酸以肽键相连的化合物称为“二肽”，由多个 氨基酸组成的肽则称为多肽。
N－末端 氨基末端
肽键
C－末端 羧基末端
特点：
肽键不同于C-N单键C=N双键 羰基不是完全的双键
肽键不能自由旋转
肽单位是刚性平面结构 肽单位平面有一定的键长和键角
抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构
4、蛋白质的四级结构
是指含有多于一条多肽链的蛋白质分子的空间排 列，以二聚体、三聚体、四聚体等形式存在。
稳定蛋白质结构的作用力
空间相互作用
金属离子 范德华力
二硫键
蛋白质结构稳定
氢键
疏水相互作用
静电相互作用
二硫键
氢键
疏水相互作用力
盐键（离子键）
范德华力
氢键
疏水相互作用
静电相互作用
5、蛋白质变性 概念 本质:分子中各种次级键断裂，使其空间构象 从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级 结构不破坏。 变性对蛋白质的影响 影响变性的因素(物理、化学)
第四节
蛋白质的功能性质
脂肪 糖
食品色泽 食品风味
相互作用
蛋白质 食品外形
构成
食品 品质
（4）有机溶剂：乙醇、丙酮
（5）促溶盐
改变水的介电常数，改变静电作用 非极性侧链在有机溶剂中比在水中更易溶解，有 机溶剂能穿透到疏水区，削弱或打断疏水相互作 用
低浓度（≤0.2）静电中和作用稳定了蛋白质的 结构
较高的浓度（＞1mol/L）离子特异效应
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8、确定原多肽链中二硫键的位置
• 肽内或肽间是否有二硫键？采用胃蛋白酶：
• 1）专一性低，切点多，生成的肽段包括含有S－S的几率 比较小， 对后续分离、鉴定比较容易
• 2）作用pH在酸性范围（pH＝2）有利于防止二硫键发生 交换反应。 • 肽段混合物进行Brown及Hartly的对角线电泳：
例：有一个A肽：
天然存在的活性肽
• 具有特殊的生理功能，常称为活性肽，含有（非）蛋白 质氨基酸和肽键。 例：催产素、加压素等激素、抗生素 如短杆菌肽 • ※α- 鹅膏蕈碱 ：环状八肽，剧毒毒素。能与真核生物的 RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性。 • ※谷胱甘肽：γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 SH COOH CH2 H2N-CHCH2CH2CO—NHCHCO NHCH2COOH — Cys γ-Glu Gly 还原型谷胱甘肽在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红 蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态
生 物 化 学
第三章 蛋白质
§2.3 蛋白质的共价结构
• 一、肽和肽键的结构 • 蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键（peptide bond） • 在蛋白质和多肽分子中连接氨基酸残基的共价键除了肽键以 外，还有两个半胱氨酸残基的侧链之间形成的二硫键
丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-甘氨酰－亮氨酸（五肽）
三、蛋白质一级结构（共价结构、化学结构）
• 蛋白质一级结构：多肽链中氨基酸的序列，包括二硫键位置。
• （一）蛋白质一级结构的测定
• 要求：样品必须是均一，纯度>97%以上，知道蛋白质的相 对分子质量
• 每种蛋白质的一级结构均有自己特殊的问题需要解决，而一 般的步骤可概括为：
1、测定蛋白质分子中多肽链的数目 →经测定末端残基（C-端或N-端）的摩尔数 →看蛋白质的摩尔数与末端残基的摩尔数的比例？ 末端残基是蛋白质摩尔数的倍数→若检测到的末端基多于一种？
2、拆分蛋白质分子多肽链和二硫键
• 1）借助非共价相互作用缔合的（亚基之间）→ 采用变性 剂：8mol/L尿素；6mol/L盐酸胍；SDS处理。 • 2）通过共价二硫桥（S－S）交联的（链内或链间）→采 用过甲酸氧化或巯基化合物做还原剂将二硫键断裂。 • 3）分离、纯化多肽链
3、测定多肽链的氨基酸组成
PG
氨基被保护的aa，在低温且有叔胺存在下与氯甲酸乙酯生成 混合酸酐→能与另一aa酸酯缩合成肽 易产生消旋→无水溶剂中进行
4、 活化酯
R
H C NH PG
O C O NO2 H2N
H C R1 COO
-
O R H C NH PG C N H H C R1 COO- ＋ HO NO2
氨基被保护的氨基酸对硝基苯酯（一种活化酯）能与另一个氨 基酸的氨基缩合成肽 作用温和，产率较高
• 问A肽的氨基酸排列顺序如何？
• 答：Ala－Arg－Glu－Phe－Met－Ser
四、肽的化学合成
• (一) 、保护：对暂不参加反应的氨基和羧基的保护， 对氨基酸侧链上活性基团的保护 • 作为保护基条件：在接肽时能起保护作用，而在接肽 以后又很容易除去，但又不致引起肽键的断裂。 • (二)、肽键形成 • 活化：正常条件下，羧基和氨基之间形成肽键是不会 自发发生的→通常对参与形成酰胺键的羧基活化，以 增强碳原子亲电特性
• 蛋白质：分子量在5－6kDa以上的多肽称为蛋白质
二、肽的物理和化学性质
• 肽的晶体是离子晶格，熔点高。 • 具有两性解离和等电点：肽的酸碱性质－－决定于末端 α-氨基和α-羧基及R基。 • 具有旋光性： • 茚三酮反应、 α-氨基和α-羧基及R基的反应（注：茚三 酮反应不是肽的特有反应） • 具有双缩脲反应：肽和蛋白质所特有→两个或两个以上 的肽键化合物与CuSO4碱性溶液发生反应生成紫红色复 合物（参看实验讲义） • 具紫外吸收：在280nm处有最大吸收峰，可进行肽类定 量测定（原因是：含色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸 ）
DCC …….
CF3COOH/HBr
目标多肽
全自动多肽合成仪
• 多肽合成的自动化、程序化 • →将被保护的aa逐个偶联到惰性固相载体上去 • 利用强酸将肽链从载体上裂解下来，同时去除侧链保护 • 美国应用生物系统公司 • Applied Biosystem
• 报价：80000＄
典型蛋白质的一级结构
O
+
N H
C
N H
二环己基 脲 (dicyclohexylurea, DCU)
肽键形成方法
•（二）氨基活化法
•氨基活化一般不需要特殊的手段，通常是在接肽时加入 有机碱，如三乙胺以保证氨基处在自由状态
固相多肽合成
氯甲基苯乙烯树脂
1962年，美国Merrifield R. B.
叔丁氧甲酰基氨基酸
CF3COOH/CH2Cl2
注意：二硫键！
蛋白质的一级结构
• 许多蛋白质一级结构已经确定 • 蛋白质一级结构查询网站： • 美国生物技术信息中心及国家医学图书馆NCBI /（拓宽）
蛋白质一级结构的局部断裂与蛋白质的激活
• 在动物体内的某些生物化学过程中，蛋白质的部分肽链 必须先按特定的方式断裂后才呈现生物活性 • 如： • 血液凝固时血纤维蛋白原和凝血酶原的变化 • 消化液中一系列蛋白水解酶原的激活 • 许多肽或蛋白质激素前体转变为活性的激素形式等
• 蛋白质的这一特性具有重要生物学意义
1）血液凝固的生物化学机理
凝血酶作用点
纤维蛋白原分子由两对α链、β－链及γ－链组成，每3条肽链 (α、β、γ)绞合成索状，形成两条索状肽链，在N末端有二硫键 使整个分子得到稳定。
的羧基形成的肽键 等疏水性aa羧 基形成的肽键 两侧残基均疏水
7、确定肽段在多肽链中的次序
• 所得资料： • N－末端残基 H • C－末端残基 S • 第一套肽段 OUS PS EOVE RLA HOWT HO • 第二套肽段 SEO WTOU VERL APS
• 借助重叠肽确定肽段次序：胰岛素B链的测序 HOWT OUS EOVERLAPS
5、缩合剂DCC
——多肽的固相合成中最为常用
直接将氨基被保护的羧基与另一个羧基被保护的氨基反应 N,N’-
N
C
N R1 H C NH
O C O DCC
N C NH
+
R1 H C NH PG
O C OH
H+
+
H3COOC
PG NH2 C H R2
二 环 己 基 碳 二 亚 胺 （ ）
DCC
O R1 H C NH PG C NH CH R2 二肽 COOCH3
C
R
C
N H
COO-
反应条件温和，不易引起消旋化
→小肽段进一步缩合成大肽时常用
3、 酸酐法
R1 H C NH PG O C NH H C R2 O C O PG H2N H C R2 O C OH O
+
Cl
C
OEt Et3N
R1
H C NH PG
O C O
O C OEt
×
O C O
+
R1
H C NH PG
• 表示方法：每摩尔蛋白 质中含氨基酸残基的摩 尔数，或100克蛋白质中 含氨基酸的克数。
柱后茚三酮显色
出峰时间（min）
4、分析多肽链的N末端和C末端残基 • （1）N－端分析
a. Sanger法（DNFB法）
B
水解
DNP－氨基酸（黄色）
b. Dansyl chloride(DNS)法
（荧光）
共价主链 R
?
二肽——肽键数？ 氨基酸残基？ aa residue 丢失的水分子数与 氨基酸残基数?
肽链的极性与 肽的读法
肽基的C、O和N原子间的共振相互作用
sp2 sp2 sp2
sp2
共振杂化体
共振产生的重要结果：限制绕肽键的自由旋转
形成酰胺平面 产生键的平均化
肽键呈反式构型
• 肽键具有部分双键特性，不能自由旋转，呈现相对的 刚性和平面化。 • 除脯氨酸外多以反式结构存在。 • 寡肽：12-20个氨基酸残基。 • 多肽：多于20个（10个）氨基酸残基的肽链。
• 加DNFB或DNS 以及层析技术进行鉴定
• b.羧肽酶法
• 专一从肽链的C端开始逐个降解，释放出游离氨基酸 • 羧肽酶A：能水解除Pro,Arg和Lys以外所有C-末端氨基酸； 羧肽酶B：只能水解 Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 • c.还原法： • 单肽链＋硼氢化锂C－末端氨基酸被还原成相应的α－氨基 醇 水解，层析
• 经分离提纯的多肽链一部分样品进行完全水解→测定其氨 基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比
4、分析多肽链的N末端和C末端残基
• 经分离提纯的多肽链另一部分样品进行N末端和C末端残基 的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸顺序参考点
5、多肽链断裂成肽段
• 用两种或几种不同的断裂方法（断裂点不一）将多肽链样 品降解成两套或几套肽段，并将这些肽段分离开
氨基保护基（酰化试剂）
羧基保护基（盐或酯化）
叔丁氧甲酰基 苄酯 除去条件：H2/Pd法或 金属钠-液氨法除去
苄氧甲酰基
对甲苯磺酰基 除去条件：HBr/CH3COOH 叔丁酯 除去条件： 温和条件下用酸除去
肽键形成方法
• （一）羧基活化法 1. 酰氯法
O R H C NH PG C O
-
O R H C NH PG PG－保护基 C Cl
6、测定各个肽段的氨基酸顺序
• 目前常用的有Edman降解法，此外尚有酶解法、气相色谱 －质谱联用法（GC-MS）等
7、确定肽段在多肽链中的次序
• 利用两套或几套肽段的氨基酸顺序彼此间有交错重叠→ 拼 凑出整条多肽链的氨基酸顺序