鸡新城疫灭活疫苗的制备
鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(N7a株+SZ株)说明书
鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（N7a株+SZ株）说明书【兽药名称】通用名鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（N7a株+SZ株）商品名无英文名Newcastle Disease and Avian Influenza（Subtype H9）Vaccine, Inactivated（Strain N7a+Strain SZ）汉语拼音Ji Xinchengyi Qinliugan（H9 Yaxing）Erlian Miehuoyimiao（N7a Zhu+SZ Zhu）【主要成分与含量】疫苗中含有灭活的鸡新城疫病毒N7a株，灭活前病毒含量≥108.6 EID50/0.1ml；含有灭活的禽流感（H9亚型）病毒SZ株，灭活前病毒含量≥108.5 EID50/0.1ml。
【性状】乳白色均匀乳剂。
【作用与用途】用于预防鸡新城疫和H9亚型禽流感。
免后21日可产生免疫力，免疫期为6个月。
【用法与用量】皮下或肌肉注射。
7～28日龄鸡，每只0.15ml；28日龄以上鸡，每只0.3ml。
【注意事项】（1）仅用于接种健康鸡。
（2）使用前应使疫苗恢复至室温。
（3）使用前和使用中应充分摇匀。
（4）疫苗开启后，限当日用完。
（5）本品严禁冻结，破乳后切勿使用。
（6）屠宰前28日内禁止使用。
（7）接种工作完毕，双手应立即洗净并消毒，用过的疫苗瓶、器具和未用完的疫苗等应进行无害化处理。
【规格】（1）100ml/瓶（2）250ml/瓶（3）300ml/瓶（4）500ml/瓶【包装】【贮藏与有效期】2～8℃保存，有效期为18个月。
【批准文号】【生产企业】仅在兽医指导下使用。
鸡新城疫灭活疫苗乳化操作规程
鸡新城疫灭活疫苗乳化操作规程1、水相配制鸡新城疫Lasota株病毒液 90000ml（高效价）鸡新城疫158株病毒液 35000ml吐温-80 5500ml 121℃高压蒸汽灭菌后备用将吐温-80缓慢加入胚液中，边加边搅拌，用约20分钟将吐温-80加完，加完后再搅拌20分钟。
2、油相配制白油 25万ml司本 2.1万ml(8%)白油加热到116℃-118℃，保持20分钟后，缓慢加入司本，边加边搅拌，加完后继续搅拌20分钟，然后通冷水降温。
3、乳化打开阀门将水相缓慢加入到油相中，开启批次乳化机边加边搅拌，用时约20分钟加完。
加完后继续初步乳化20分钟。
初步乳化完成后，打开阀门并开启连续乳化机进行自循环乳化30分钟，然后通过连续乳化机，从A罐导入B罐，由B罐导入A，再由罐A罐导入B罐，乳化结束准备分装。
鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗乳化配苗生产规程一、配苗4、水相配制鸡新城疫Lasota株病毒液 9万ml（高效价）禽流感WD株病毒液 7万ml吐温-80 6400ml 121℃高压蒸汽灭菌后备用将吐温-80缓慢加入胚液中，边加边搅拌，用约20分钟将吐温-80加完，加完后再搅拌20分钟。
5、油相配制白油 24万ml司本 1.9万ml(8%)白油加热到116℃-118℃，保持20分钟后，缓慢加入司本，边加边搅拌，加完后继续搅拌20分钟，然后通冷水降温。
6、乳化打开阀门将水相缓慢加入到油相中，开启批次乳化机边加边搅拌，用时约20分钟加完。
加完后继续初步乳化20分钟。
初步乳化完成后，打开阀门并开启连续乳化机进行自循环乳化30分钟，然后通过连续乳化机，从A罐导入B罐，由B罐导入A，再由罐A罐导入B罐，乳化结束准备分装。
实验二鸡新城疫弱毒疫苗的制备
实验二鸡新城疫弱毒疫苗的制备新城疫又称亚洲鸡瘟，是由新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触性传染病，其主要特征为呼吸困难、腹泻、神经紊乱及黏膜和浆膜出血，一年四季均可发生，为我国养鸡业的头号疾病。
预防和治疗所用的新城疫疫苗种类很多，大致包括灭活疫苗和弱毒疫苗两类。
下面以新城疫弱毒疫苗为例讲述其制备过程。
一、目的与要求1．掌握鸡新城疫弱毒疫苗的制备方法。
2．熟悉鸡新城疫弱毒疫苗制备的操作过程。
二、材料与试剂材料：种蛋、鸡胚孵化箱、冰箱、无菌操作台、手术镊子、注射器、蜡烛、酒精灯、酒精棉和碘酊等。
试剂：灭菌PBS液/生理盐水；青、链霉素溶液。
三、制备前准备1、种毒的选择：种毒属于弱毒力毒株，包括HB1株、F株、LaSota 株、LaSota-Clone30和N79株。
必须符合：①种毒对鸡胚的毒力。
以10倍稀释的种毒0.1ml尿囊腔接种10日龄鸡胚，鸡胚应于接种后24-120h内死亡70%以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上，胎儿有明显病变，血凝价在1：640以上。
②种毒对1月龄雏鸡滴鼻免疫的最小免疫量应不大于10-3/1滴。
③种毒对10日龄鸡胚半数感染量（EID50）应不大于10-7/0.1ml。
④种毒对初生雏鸡不致病。
2、种毒的稀释：用灭菌PBS液或0.85%生理盐水10-4～10-6稀释种毒，稀释时最好加入适当双抗溶液，并在4℃作用约4小时。
3、鸡胚的选择：最好选用SPF胚、其次选用非免疫胚，再次选用普通胚。
四、操作过程1、将购买的种蛋放于37℃温箱中孵育，加入适量水调节湿度。
2、孵育至9～11日龄时，将鸡胚置于黑暗的环境下，在照蛋器下，可观察到明显的胚体运动、丰富的血管和气室，用铅笔划出接种部位和气室部位。
划线时要尽量避开胚头和血管（尤其是大血管）。
3、将划好的鸡胚置于经紫外线消毒过的超净台中，先用碘酊消毒，再用酒精棉脱碘；4、用手术镊子在标记部位打孔，打孔时要在接种部位和气室各打一孔。
5、用灭菌注射器吸取0.1ml～0.2ml稀释病毒液，经接种孔注入鸡胚尿囊腔中；6、用石蜡先将接种孔封口后，在将气室孔封口；7、做好标记（时间，名称），置37℃温箱中继续孵育，增殖病毒。
鸡新城疫灭活疫苗乳化操作规程
鸡新城疫灭活疫苗乳化操作规程1、水相配制鸡新城疫Lasota株病毒液 90000ml（高效价）鸡新城疫158株病毒液 35000ml吐温-80 5500ml 121℃高压蒸汽灭菌后备用将吐温-80缓慢加入胚液中，边加边搅拌，用约20分钟将吐温-80加完，加完后再搅拌20分钟。
2、油相配制白油 25万ml司本 2.1万ml(8%)白油加热到116℃-118℃，保持20分钟后，缓慢加入司本，边加边搅拌，加完后继续搅拌20分钟，然后通冷水降温。
3、乳化打开阀门将水相缓慢加入到油相中，开启批次乳化机边加边搅拌，用时约20分钟加完。
加完后继续初步乳化20分钟。
初步乳化完成后，打开阀门并开启连续乳化机进行自循环乳化30分钟，然后通过连续乳化机，从A罐导入B罐，由B罐导入A，再由罐A罐导入B罐，乳化结束准备分装。
鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗乳化配苗生产规程一、配苗4、水相配制鸡新城疫Lasota株病毒液 9万ml（高效价）禽流感WD株病毒液 7万ml吐温-80 6400ml 121℃高压蒸汽灭菌后备用将吐温-80缓慢加入胚液中，边加边搅拌，用约20分钟将吐温-80加完，加完后再搅拌20分钟。
5、油相配制白油 24万ml司本 1.9万ml(8%)白油加热到116℃-118℃，保持20分钟后，缓慢加入司本，边加边搅拌，加完后继续搅拌20分钟，然后通冷水降温。
6、乳化打开阀门将水相缓慢加入到油相中，开启批次乳化机边加边搅拌，用时约20分钟加完。
加完后继续初步乳化20分钟。
初步乳化完成后，打开阀门并开启连续乳化机进行自循环乳化30分钟，然后通过连续乳化机，从A罐导入B罐，由B罐导入A，再由罐A罐导入B罐，乳化结束准备分装。
生物制品学实验指导
生物制品技术实验指导生物工程系目录实验规则⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 2 实验一、猪瘟、口蹄疫抗体间接血凝实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ 3 实验二、鸡新城疫灭活疫苗的制备—照蛋及接毒⋯⋯⋯⋯ 4实验三、鸡新城疫灭活疫苗的制备—鸡胚收毒及测效价⋯⋯ 5 实验四、鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备⋯⋯⋯⋯ 6实验五、氢氧化铝和蜂胶的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7 实验六、法氏囊炎病高免卵黄抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8 实验七、法氏囊炎病高免卵黄抗体效价的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯9 实验八、兔瘟灭活苗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10 实验九、大肠杆菌自家灭活疫苗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11 实验十、动物实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12 实验十一、鸡白痢平板抗原的制备及使用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15 实验十二、免疫血清的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16 实验十二、细菌冷冻真空干燥实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18实验规则实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。
必须遵守以下各项。
1、实验前必须预习实验指导书。
若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。
、进实验室不得将书包、衣物等放在实验1台上，不必需的物品勿携入室内。
2、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签，、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。
5、保持实验室安静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。
实验进行时不准随意进出。
实验室中物品未经许可不准带出室外。
6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。
7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。
不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。
实验一 鸡新城疫疫苗(一)
尿囊膜贴在卵壳内壁上，用镊子夹住将其撕脱下来即
可。
胚胎：消毒、打开气室卵壳后，用镊子撕破卵壳膜和
绒毛尿囊膜，夹起胚胎，用剪刀剪断卵黄带，将胎儿
放灭菌容器内即可。
8.鸡胚接种注意事项
（1）接种材料一般都应按每毫升1000ＩＵ或μg加入 青、链霉素。
（2）接种位点应避开鸡胚、血管和胚头，以免针头 刺伤鸡胚而造成接种后的损伤性死亡。
实验一 鸡新城疫油乳剂灭活苗的制备技术（一）
新城疫病毒可以在鸡胚中大量增殖，收获的鸡胚
尿囊液中即含有新城疫活病毒，将收获的尿囊液经过
灭活，并加入佐剂，便制成了新城疫灭活疫苗。
目的和要求：
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接 种方法； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程， 掌握接毒和收毒的方法。
头约1cm左右。
4.病料接种：
若用鸡胚分离、培养病毒，则应选9～12日龄之
间的发育鸡胚。许多病毒，特别是大多数禽病毒都能
在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检 查鸡胚是否健康、活泼，并划出气室和接种部位。然 后严格消毒接种部位和气室（先用碘酊消毒，再用 70%酒精消毒），用打孔器打孔后，每胚接种处理好
水瓶中，使两种抗生素在生理盐水中的含量均
达到1000-2000 IU(μg)/ml。将注射用生理盐
水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗中，稀释。
3.照蛋定位 ： 接种前应在照蛋器下检查鸡胚，挑出死胚 和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室 位臵，再于胚胎侧画出接种位点（进针点）， 接种点应避开大血管，靠近气室边缘处，离胚
此法适用于马立克氏病毒、披膜病毒、衣
原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法：
气室端蛋壳消毒后，在气室中央打一小孔，用
不同佐剂制备鸡新城疫、禽流感二联灭活苗免疫效果评价试验
摘要 基于对市场现 有佐 剂产 品的了解取不同佐剂产品作比较 ，以禽 类疫 苗为例。选取鸡新城疫、禽 流感（Ｈ９亚型） 二 联 灭 活 （Ｌａｓｏｔａ株 ＋ＷＤ株 ）灭 活后 抗 原 液 ， 按 不 同佐 剖 的配 苗 比 例 分 别配 制 灭 活 苗 ，验 证 其 免疫 效 果 。 将 添 加 不 同 佐 剂配制的灭 活苗分别 免疫７日龄 商品肉鸡，分６组 ，每 ．￣ｇ３０Ｚ ，其 中１～５组 分别免疫５种不 同佐 剂配 制的禽流 感灭活疫苗， ６组为空 白对照，各 免疫０．３ｍｌ／只。分别于 免疫 后１４、２１、２８、３５ｄ采血 。离心后取血 清，利 用血凝抑 制方法分 别检测 鸡 新城疫和Ｈ９亚 型禽 流感血清抗体 。计算抗 体平均滴度 。试验结 果显示，ＭＦ５９、ＧＥＬ０２和ＩＳＡ７０ＶＧ等新型佐 刺较 传统佐 剂均能产生较 高的抗 体水平且 能使机体在短期 内快速产生 免疫应答反应并能很好的维持其抗体水平。
规 方 法 养 铕 。
１．１．２ 试 验 灭活抗原 鸡新城疫病毒（Ｌａｓｏｔａ株）、Ｈ９亚型 禽流感病 毒（ｗｏ株）二联灭活抗 原液 ：青 岛蔚蓝生物 制品
有 限 公 司 ， 产 。
１．１．３ 检测 试剂 鸡新城疫 ＨＩ实验标 准抗原 和阳性 血清
均购 自中国 兽医药品监察所 ？Ｈ９亚 型禽流感ＨＩ标准抗 原
关键 词 灭 活 苗 佐 剂 免疫 效 果
中图分类号 ：￥８５１．３ 文献标识码 ：Ａ 文章编 号 ：１００７—１７３３（２０１９）０１—０００８—０３
鸡新城疫 Ｄ）是 由新城疫病毒 ＤＶ）引起 的一种急性 高 度接 触性传 染病 ，其 发病 率和 死ｒ＿率 极高 Ｄｌ。禽 流感
表 １ 实 验 分组情 况
新城疫油苗和冻干苗疫苗的 生产工艺流程
加塞 压盖 物理性状 安全检验 无菌检验 外源病毒检验 效力检验 *后孵化及照蛋
*冷ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ蛋
铝盖 分装瓶
纯化水粗洗 注射水洗 照蛋时间 培养温湿度 冷蛋时间 冷蛋温度
*隧道烘箱灭菌
清洗 *灭菌
新城疫灭活疫苗生产工艺流程 1 生产用毒种制备 1.1 毒种繁殖 将毒种用灭活生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），尿 囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时之间死 亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容 器内。将检验无菌，且对1%鸡红细胞凝集价在1：640（微量法1： 512）以上的鸡胚液混合，定量分装于安瓿瓶中，冷冻保存。注明收获 日期、毒种代次等。 1.2 毒种鉴定 1.2.1 病毒含量 按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取 10-7、10-8、10-9 3个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚 0.1ml，置36~37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在 48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度 的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出 所有活胚,逐个收获 鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:160 (微量法1:128)者判为感 染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108EID50。 1.3 毒种保存 在-15℃以下保存，应不超过6个月。 1.4 毒种继代 应不超过3代。 2 制苗材料选择 选择发育良好9～10日龄的易感鸡胚作为制苗材料。
新城疫冻干疫苗生产工艺流程 1 生产用毒种制备 1.1 毒种繁殖 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5),尿囊腔 内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。选接种后72~120小时死亡、且病痕 明显的鸡胚,分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水),装于灭菌容器内。将检验无 菌、且对1%鸡红细胞凝集价≥1:640(微量法1:512)的鸡胚液混合,定量分 装于安瓿中,冷冻保存。注明收获日期,毒种代数等。 1.2 毒种鉴定 1.2.1 病毒含量 按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取 10-7、10-8、10-9 3个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚 0.1ml，置36~37℃继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在 48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度 的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出 所有活胚,逐个收获 鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价≥1:160 (微量法1:128)者判为感 染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108EID50。 1.2.2 纯净 应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，分别按《无菌检 验或纯粹检验标准操作规程》、《支原体检验标准操作规程》、《外 源病毒检验标准操作规程》进行。 1.3 毒种保存 在-15℃以下保存,应不超过1年。 1.4 毒种继代 应不超过3代。 2 制苗材料选择 选择发育良好的9~11日龄SPF鸡胚作为制苗材料。 3 制苗用毒液的制备 3.1接种 取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5),每胚尿 囊腔内接种0.1ml，接种后密封针孔，置36~37℃继续孵育，不必翻蛋。 3.2 孵育和观察 鸡胚接种后,每日照蛋一次，将在60小时前死亡的鸡胚 弃去。60小时后,每4~8小时照蛋一次,死亡的鸡胚随时取出,直至96或120 小时,不论死亡与否,全部取出,气室向上直立,置于2~8℃冷却。
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鸡新城疫灭活疫苗的制备
制备油佐剂灭活苗
1 材料
1.1毒种：鸡新城疫病毒弱毒La sota株。
1.2实验动物：9-10日龄鸡胚若干。
1.3主要试剂：碘酊，1%硫柳汞溶液，7号白油，司盘-80，硬脂酸铝，吐温-80，甲醛等。
主要仪器：孵化箱、1ml注射器、蛋架、打孔器、蜡烛、胶体。
2.实验步骤
2.1种毒繁殖：将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释，尿囊内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mol.选种后72-120小时之间死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液，装于灭菌器内定量分装于安领瓶，冷冻保存。
2.2接种前准备；种毒稀释，照蛋，打孔。
2.3接种；取生产用毒种，用灭火理盐水适当稀释（10-4或10-5），每胚尿囊内接种0.1ml.接种。
后密封针孔，置36-37继续孵育。
2.4孵育和观察；鸡胚接种后，每日照室1次，将24小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每天照蛋2次，死亡的鸡胚随时取出，4摄氏度保存，冷却24小时。
2.5收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酐消毒气室部位，然后以无菌手
术剥除气室部卵壳，捐去卵壳膜。
剪破绒毛尿至膜及羊膜(谨防卵黄破裂)。
吸取胚液。
对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查、凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。
吸取胚液放于同一灭菌的容器内。
（凝集试验和无菌试验）
2.6 灭活：可以过滤，再加甲醛溶液，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。
然后在37℃灭活16小时，期间振摇3~4次，在4℃保存，应不超过1个月。
（无菌检验和灭活检验）
2.7 制苗
2.7.1 油相制备：将7号白油与司盘- 80 ( Span - 80)按94 ∶6比例混合再加总量2%的硬脂酸铝溶液混匀后,121 ℃高压灭菌15 min即为油相。
2.7.2 水相制备：将灭活胚液(抗原液)和吐温- 80 ( Tween - 80)以96 ∶4的比例混合，充分搅拌，使吐温-80完全溶解为止，作为水相。
2.7.2 水相制备：将灭活胚液(抗原液)和吐温- 80 ( Tween - 80)以96 ∶4的比例混合，充分搅拌，使吐温-80完全溶解为止，作为水相。
2.7.4
检验：乳化后，取3~5ml以3000r／min离心15分钟，若有分层现象，应重复搅拌。
同时徐徐加入水相l份。
以10000r／min
搅拌2~5分钟，在终止混拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。
2.7.4 检验：乳化后，取3~5ml以3000r／min离心15分钟，若有分层现象，应重复搅拌1次。
2.7.5分装：定量分装，加盖密封，成品。
3 疫苗质量的鉴定
3.1 物理性状
3.2 无菌检验、安全检验、效力检验等。