实验一特殊显微镜的工作原理和使用
实验一特殊显微镜的工作原理和使用
实验一特殊显微镜的工作原理和使用特殊显微镜是一种能够观察微观尺度物体的仪器，它通过利用光学、电子、声波等原理来放大和显示样品的细节。
特殊显微镜在科学研究、医学诊断、材料分析等领域起着重要的作用。
本文将重点介绍光学、电子和声学显微镜的工作原理和使用。
一、光学显微镜光学显微镜是一种利用可见光作为照明源的显微镜，其主要由物镜、目镜、调焦机构和光源构成。
它的工作原理是通过物镜将样品上的光聚焦到目镜上形成放大的影像。
光学显微镜的使用步骤如下：1.确保显微镜放置在平稳的台面上，并保持垂直。
2.调节光源亮度，使其能够提供足够的照明。
3.将样品放在载物台上，并使用样品夹夹紧。
4.用粗调焦机构将物镜与样品靠近，然后用细调焦机构调节焦距，直到看到清晰的影像。
5.调节目镜，使影像更为清晰。
6.根据需要，可以使用滤光片或偏振片来改变光的属性。
7.使用目镜检查样品，并调节焦距和目镜，如有需要。
光学显微镜的优点是成本较低、易于操作，并且可以观察到样品的活体细胞。
缺点是分辨率有限，仅能观察到大约200-300纳米的细节。
二、电子显微镜电子显微镜是一种利用电子束取代可见光来照射样品的显微镜，它可以提供比光学显微镜更高的分辨率和放大倍数。
电子显微镜的工作原理是通过电子束的散射、透射和反射来获得样品的影像。
具体而言，电子束通过电子枪产生，然后经过准直系统和电子透镜聚焦。
在样品中穿透或被散射后，电子束最终落在屏幕或探测器上生成影像。
电子显微镜的使用步骤如下：1.准备样品，通常需要制备薄片并清洁表面。
2.打开电子显微镜，等待其预热。
3.将样品放置在样品台上，并将其安装在显微镜中。
4.调节电子束的对焦，使其尽可能锐利。
5.对样品进行调节，以便获得所需的放大倍数和分辨率。
6.观察和记录样品的影像，可以使用照相机或电子影像探测器。
电子显微镜的优点是具有更高的分辨率和放大倍数，可以观察到更小的细节，如原子尺度。
缺点是设备复杂、操作困难，并且样品必须处于真空环境中才能进行观察。
医学细胞生物学实验指导
普通生物学实验指导供医学八年制使用华中科技大学生命与技术学院实验教学中心目录实验一显微镜的结构及使用方法 (2)实验二动物细胞形态结构的观察 (5)实验三细胞器的光镜切片观察 (7)实验四动物细胞培养 (9)实验五 ABO血型鉴定与交叉配血 (16)实验六血涂片的制作与读片 (19)实验七细胞有丝分裂标本的制备与形态观察 (23)实验八蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察 (27)实验九人外周血染色体制备 (30)实验十正常人非显带染色体的核型分析 (32)实验一显微镜的结构及使用方法一、实验目的1. 学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
2. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
3. 了解几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用光学显微镜的使用( 一) 显微镜的结构及使用方法光学显微镜，简称光镜(microscope) ，是生物医学研究及临床工作中常用的仪器，每个学生都必须熟悉它的结构和性能，掌握其使用方法。
1 ．光学显微镜的主要构造显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分( 图1-1) 。
(1) 机械部分①镜座：亦称镜脚，是显微镜的基座，用以支持整个显微镜。
②镜柱：是镜座向上直立的短柱，用以支持其他部分。
③镜臂：是镜柱向上弯曲的部分，适于手握。
有些显微镜镜柱与镜臂之间有倾斜关节。
④镜筒：连在镜臂前方的镜筒部分，一般长度为16 cm 。
有直筒和斜筒两种，前者镜筒上下可调节，后者镜筒是固定的⑤调节器：是装在镜臂上的大小两种螺旋，转动时可使镜台升降或使镜筒上下移动以调节焦距。
粗调节器( 粗螺旋) 转动时可使镜台或镜筒在垂直方向以较快速度和较大距离进行上下升降，调节物镜与标本的距离。
通常在低倍镜下，先用粗调节器找到物像。
细调节器( 细螺旋) 形状较小，通常在粗调节器的下方或外侧，转动时可使镜台或镜筒缓慢地上下移动，以精细调节焦距，得到清晰的物像。
⑥旋转器( 镜头转换器) ：装在镜筒的下端，呈盘状，下面有3 ～4个物镜孔供装置不同放⑦载物台( 镜台) ：用以放玻片样本，中间有一通光圆孔，称为镜台孔，由此孔可透入集光器传入的光线。
实验一 显微镜的使用及细菌的革兰氏染色
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色一、实验目的和内容（一）实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。
2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤（二）实验内容1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．制作细菌染色装片。
3．进行革兰氏染色法操作。
4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。
二、实验原理（一）油镜的基本原理普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。
油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。
油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。
在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。
图1-1 显微镜物镜参数图显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。
影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。
当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。
（二）革兰氏染色革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导实验目录:实验一：特殊显微镜的原理及其使用实验二：电子显微镜的原理及使用实验三：细胞膜的渗透性实验四：细胞的凝集反应实验五：诱导细胞融合—聚乙二醇法实验六：线粒体和液泡系的超活染色与观察实验七：叶绿体的荧光原位观察实验八：细胞骨架的观察实验九：细胞中DNA、RNA的显示实验一特殊显微镜的原理及其使用I.暗视野显微镜的原理和使用一、实验目的1.了解暗视野显微镜观察活细胞的基本原理；2.了解暗视野显微镜的特殊组件和位置；3.掌握调节暗视野显微镜的基本步骤。
二、原理和结构特点在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。
暗视野显微镜就是利用此原理设计的。
它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器，常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。
从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。
在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像．并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。
但被检物体为非均质时，并大于1/2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。
一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2μm)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器具有暗视野聚光器的显微镜（二）材料牙垢微生物，洋葱内表皮细胞，载玻片，盖玻片，牙签，尖头镊子，滤纸条，指甲油，擦镜纸等。
（三）试剂生理盐水四、实验步骤1.样品制备：在一张无划痕、清洁的载玻片上滴一滴生理盐水，用牙签取牙垢或用镊子撕洋葱内表皮细胞与载玻片上的生理盐水混合均匀，盖上一片无划痕、清洁的盖玻片，用滤纸条吸取盖片四周多余的水分，用指甲油封片（或不封片）。
普通和几种特殊光学显微镜的结构及使用
二、荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用?
主要用于观察具有荧光特性的细胞结构或被荧光染料着色的 细胞结构和化学成分。
结构特点：普通光学显微镜加上一些附件 荧光光源 （超高压汞灯） 激发滤片 阻断滤片
按光路分两种： 1．透射式荧光显微镜 2．落射式荧光显微镜
（二）使用方法
1．打开灯源，预热几分钟。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤
轻擦拭，切勿用手指、手帕和绸布等擦摸。机械部分可用布 擦拭。
5. 显微镜使用完毕后，转动粗调上升镜筒或下降载物台，取下
标本，转动转换器使物镜离开通光孔，下降镜筒或上升载物 台，使接近物镜，垂直反光镜，下降集光器，关闭虹彩光阑
二、暗视野显微镜 (一) 原理和结构特点
原理:利用光学上的丁达尔现象设计的。 结构特点:
荧光显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色）
五、倒置显微镜
光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，主要差别是 倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的 下方，因此可以用来观察生长在培养皿底部的细胞状态。 它与相差装置配合，可以用来观察培养的活细胞。
倒置相差显微镜观察人脐静脉内皮细胞
[作业]
（二）显微镜的使用方法 显微镜在使用前，应先检查一下它的各个部件是否
完整和正常，并进行必要的清洁工作，然后将显微镜放置 在自己左肩前方的实验台上，离桌子边缘3—6cm为宜，以 便观察。
1. 低倍镜的使用方法
1）对光 2）放置玻片标本 3）调节焦距
2.高倍镜的使用方法
1）一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，再把需要放 大的部分移至视野正中，并把物像调节到最清晰的程度。
实验一特殊显微镜的工作原理和使用
滤色系统
➢ 荧光光源的采用超高压汞灯，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有 一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片〔一般有紫外、紫色、 蓝色和绿色激发滤片〕，仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其 他光都吸收掉。
➢ 这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也 易识别，敏感性高，主要用于细胞构造和功能 以及化学成分等的研究。
荧光显微镜构造特点
➢ 荧光显微镜的根本构造是由普通光学显微镜加 上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束 别离器和阻断滤片等)的根底上组成的。
光源
➢ 现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形， 内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅 速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约 需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和复原过 程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物 质，因此，为荧光显微镜普遍采用。
环状光圈的大小由不同大小的环状 孔控制。环状光阑的直径和孔宽是 与不同的物镜相匹配的。其作用是 将直射光所形成的像从一些衍射旁 像中分出来。
相差环
➢ 相差物镜是在物镜的后焦点处加一环状相板。 ➢ 相板由光学玻璃制成，安装在物镜的后焦面处，相板装有
吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜，具有改变相位的 作用。 ➢ 它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使 亮度发生变化的作用。放大倍数不同的物镜，其相板也不 同。
➢ 每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。 荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面 需加阻断(或压制)滤光片。用强光灯照明。光线暗那么物像不清晰。
相差显微镜PhaseContrastMicroscope
Phase contrast light pathways
用途：观察未经染色的玻片标本
（三）荧光显微镜 Fluorescence Microscope
原理：利用一定波长的光（通常是波 长短的紫外光和蓝紫光）照射被检样 品，激发荧光，现场中所见到的像， 主要是样品的荧光映射。有两个特殊 的滤光片；照明方式通常为落射式。
显微镜的能力
1. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。其公 式如下：
R:分辨率；λ：入射光线波长；N．A．（数值孔径）
＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物 镜镜口的张角）。
2. 显微镜的几个光学特点：
–制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65～1.78，所用 介质的折射率越接近玻璃的越好。
（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser Confocal Scanning Microscope
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 • 能显示细胞样品的立体结构。 • 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 • 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形
成立体图像。
laser confocal scanning microscope, LCSM
2、暗视场显微镜
应用丁达尔现象，装配了一类特殊聚光器——暗视 场聚光器，使用入时光束，从聚光器斜向照明被检 验样品。
实验原理
3、相差显微镜
由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差 的差别太小，只有在变相差为振幅差（明暗之差） 之后，才能被分辨。
4、荧光显微镜
荧光显微术是利用一定波长的光（通常是波长短的 紫外光和蓝紫光）照射被检样品，激发荧光物质发 出可见的荧光，现场中所见到的像，主要是样品的 荧光映像。
• 1952年，Nomarski发明， 利用两组平面偏振光的干 涉，加强影像的明暗效果， 能显示结构的三维立体投 影。标本可略厚一点，折 射率差别更大，故影像的 立体感更强。
倒置显微镜的使用
7. 调焦
1）将样品放置载物台中。 2）转动同轴粗微调旋钮，将标本对好焦。
8. 聚光器中心调节
1）确信10X 物镜在光路中。 2）将“视场光阑调节杆”降低直到能从目镜看到视场光 阑像。 3）转动“聚光器调焦钮”升降聚光器，使视场光阑像清 晰地成象在标本面上。 4）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在 视场中心。 5）更换40X 物镜。 6）调节“视场光阑调节杆”，使视场光阑的象与视场大 致相同。 7）转动两个“聚光器中心调节螺钉”，使视场光阑像在 视场正中。
C： 聚光器再聚焦制动器 E： 聚光器固定螺钉
B： 滤色片滑片
D： 聚光器调焦旋钮 F： 聚光器安装定位孔
G： 聚光器安装定位槽
I： 聚光器调中螺钉 M： 灯室盖指紧螺钉 O： 聚光器支架指紧螺钉
H： 聚光器转动指紧螺钉
J： 聚光器安装(可转动)支架 L： 灯室固定螺钉 N： 聚光器支架(可移动) P： 灯室线
9. 进行观察
1）选择要使用的物镜 2）移动系统聚光器上的“孔径光阑调节杆”， 使孔径为物镜数值孔径的70－80%。（“把目 镜筒转盘”设到＜B＞位置，转动勃氏镜调焦 螺钉使其聚焦，当观察到物镜的出瞳和孔径光 栏的象时，调节其大小。） 3）调节“视场光阑调节杆”使视场光阑像与视 场相大致相同。 4）把透射照明器里的“ND 减光片”进入或退出 光路以调节视场亮度。
1. 操作之前要求：
（1）检查荧光装置的工作时间，如荧光灯 的工作时间超过使用寿命，应予以更换。 （2）使用物荧光载波片 （3）每次使用之间必须间隔20分钟。
2. 用明场找到视野。 3. 关闭明场光源，打开荧光电源预热5分 钟。 4. 开启荧光盘，并根据要求选择荧光通道。 5. 激发荧光发生器，打开光闸，即可进行 观察。
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人口腔上皮细胞在不同显微镜下的图像
普通显微镜
暗视场显微镜
相差显微镜
（二）相差颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达 到的位置)的不同。当光波遇到物体时，其波长(颜色)和振幅(亮度)发生变化， 于是就能看到物体，
➢ 当光波通过透明的物体时，虽然物体的内部不同结构会有厚度和折光率不同 的差异，而波长和振幅则仍然是不会发生改变的。因此，就不易看清这些不 同的结构。
➢ 在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普 通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。
(1)．将显微镜聚光器调到最高位置，用低 倍镜对好焦距。
(2)．取下目镜，从镜筒中观察并调节光阑 的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。
(3)．用厚黑纸剪制中央挡光板。外圈直径 与滤光片框架相同，中央部分的大小与调节 好的光阑孔径一样(可用半透明的小纸片， 放在通光孔处聚光镜镜面上，纸上显示的光 斑即为光阑的孔径，再用圆规量取大小)。
➢ (5)高倍观察：在标本盖玻片上再加香柏油一滴，降下镜筒，使油镜
浸在香柏油内，再用粗、细螺旋调节物镜的焦距，有时还需稍微升降 暗视野集光器以调节斜射光焦点，使其正好落在标本上，并且调节油 镜头的光圈，相互配合，直到物像清楚为止，即可开始检查。 也可用低倍或高倍物镜进行镜检，这就不必在盖玻片上加香柏油。
明场普通显微镜成像光路图
暗场照明光路图
成像特点及优缺点
➢ 在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像,并非物
体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物
体的细微结构，只能呈现出物体的轮廓而且比实物要大。
➢ 但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光 线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。
➢ 用普通光学显微镜观察一些活的微生物或其他细胞等透明物体时，也就不易 分清其内部的细微结构。
➢ 但是，光线通过厚度不同的透明物体时，其相位却会发生改变，形成 相差。不过，相差不表现为明暗和颜色的差异，这种微小的变化，人 眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。
➢ 我们可以利用光学的相干干涉原理，可以把相差改变为振幅差，这样 就能使透明的、厚度和性质不均匀的结构表现明暗的不同，能够较清 楚地予以区别。
放大倍数和数值孔径 10/0.25 ， 40/0.65 ，100/1.3
标准机械筒长和盖玻片厚度 160/0.17 160/0或160/ 160/∞/0或∞/-
油浸物镜：oil、oel、Hi等 水浸物镜：W或Water 甘油浸物镜：Glyz和Glye 复消色差物镜：APO 半复消色差物镜：FL 平场物镜：PL
环状光圈的大小由不同大小的环状 孔控制。环状光阑的直径和孔宽是 与不同的物镜相匹配的。其作用是 将直射光所形成的像从一些衍射旁 像中分出来。
➢ 暗视场显微镜就是利用此原理设计 的。
丁达尔现象
➢ 暗视场显微镜是在普通光学显微镜中去除明视场聚光器， 换上一个暗视场聚光器而成。
➢ 它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视场聚光器， 常用的是抛物面聚光器，使光源的中央光束被阻挡,不 能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径， 倾斜地照射在观察的标本上。
➢ 如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟 滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失， 或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波 长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强
-明相差
+暗相差
➢ 相差显微镜，能够通过 其复杂的结构，改变直 射光或衍射光的相位， 并且利用光的衍射和干 涉现象，把相差变成振 幅差，即明暗差，可以 被我们的感觉器官所感 知。
➢ 特殊显微镜是与明视场普通显微镜相对而 言，在成像原理、结构和用途上存在差异 的显微镜。
➢ 这里介绍： 1、暗视场显微镜 2、相差显微镜 3、荧光显微镜
一、 暗视场显微镜
应用：微小粒子、细菌 形态、细菌记数，透 明标本观察等。
(一) 原理和结构特点
➢ 在日常生活中，室内飞扬的微粒灰 尘是不易被看见的，但在暗的房间 中若有一束光线从门缝斜射进来， 灰尘便粒粒可见了，这是光学上的 丁达尔现象。
➢ 同时它还吸收部分直射 光线，以增大其明暗的 反差。因此可用以观察 活细胞或未染色标本。
相差显微镜的构造特点
➢ 相差显微镜的构造以普通显微镜为基础，与普通显 微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜， 并带有一个调节合轴用的望远镜。
相差环则是由大小不同的环状孔形 成的光阑，放置在光源通路上，使 光线只能由环状部分通过，环状光 圈的大小可由集光镜的数值口径 (N.A)来调节。
(4)．将中央挡光板放在滤光片框架上，开 大光阑进行样品观察。
如需使用高倍镜作暗视野观察，应按高倍镜对焦后的视野大小 重新制作中央挡光板。
要求与注意事项
➢ (1)制作标本时所用的载玻片和盖玻片均应清洁干净，必须使用薄玻 片(载玻片厚度约1.O～1.1mm，盖玻片厚度约0.1mm)，否则会影响 暗视野集光器斜射光焦点的调节，如载玻片太厚，焦点只能落在载玻 片内，就不能看到物像。标本也不能过厚。
➢ (2)采用的光源宜强，一般均用强光灯照明。光线暗则物像不清晰。
➢ (3)调节光源：使光线集中在暗视野集光器上。先用低倍镜观察，移 动暗视野集光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央。如暗视 野集光器已准确固定好，则可免去这一步骤。
➢ (4)先在暗视野的集光器上加香柏油一滴，然后将标本放在载物台上， 把暗视野集光器向上移，使其上的柏木油与标本片的底面接触，中间 不能有气泡存在。
➢ 一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨 0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最 大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细 胞的结构和细胞内微粒的运动等。
(二) 制作中央遮光板
➢ 普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野 聚光器，即可改装成暗视野显微镜。