绿色荧光蛋白的克隆实验汇报.
绿色荧光蛋白基因克隆及表达 结题报告
H2O 10XPCR Buffer EGFP-F EGFP-R dNTP rTap 菌 总体积
15μl 2.5μl 2μl 2μl 2μl 0.5μl 1μl 25μl
11.阳性菌株培养
等转板的菌长出以后,挑取2~3个阳性克隆 摇菌,37℃过夜。
12.重组质粒提取
(1)取已经培养好的含有pEGFP和pET-28a重组质粒1.5mL置于Eppendorf管中 ，以10000r/min离心1min，去掉上清；重复一次。然后将小管倒扣在吸水纸上 ，并用移液枪吸出多余的菌液，尽量除尽。加入150μL的GET缓冲液，充分混 匀，室温下放置10min。使用EDTA是为了除去细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易 与细胞壁接触。
重复步骤上述步骤。将吸附柱Ca2放回收集管中，12000r/min离心 2min，室温放置数分钟，彻底除去漂洗液PW。将吸附柱Ca2，置于 室温10分钟，向吸附膜的中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温 放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液。
6.连接反应
（1）将酶切后的片段用T4-DNA连接酶相 连 （2）16℃连接过夜。
试剂
溶液1－G.E.T缓冲液（pH8.0），溶液2－ 0.2mol/L NaOH, 1%SDS，溶液3－乙酸钾溶液 (3M, pH=4.8)，灭菌蒸馏水，pH7.5~8.0醋酸铵 （NH4Ac）7.5mol/L，异丙醇，70％乙醇，无水 乙醇，0.5 × TBE缓冲液，平衡液BL，溶胶液 PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，0.1 mol/L CaCl2溶液，卡那霉素100mg/ml，IPTG，2KB DNA Maker，6XLoading Buffer，酶反应终止 液(10 x Loading Buffer)，0.25%溴酚蓝， 10xPCR缓冲液，琼脂糖，NaAc，TE缓冲液， 酚氯仿，T4DNAligase及其缓冲液(10 x ligase Buffer)
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA 的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）.. 95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
克隆绿色荧光蛋白分子生物学实验报告
南方医科大学绿色荧光蛋白的克隆实验报告年级专业 2014级生物技术姓名朱旭峰学号 3147020042摘要细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
Cloning of green fluorescent proteinAbstract：Bacterial plasmid is a kind of double chain, closed-loop DNA, ranging from 1KB to 200kb. All plasmid is present in the cytoplasm, independently from the chromosome of autonomously replicating genetic component, usually under the condition of sustainable and stable in staining in the free state, but under certain conditions will irreversibly integrated into the host chromosome, with the replication of the chromosome replication and by cell split passed on to future generations.Plasmids have become the most commonly used gene cloning vector molecules, the important condition is to obtain a large number of purified plasmid DNA molecules. There are many methods can be used to extract plasmid DNA, the following are mainly introduced the method of extracting plasmid DNA by alkaline lysis method.关键词 GFP 质粒提取感受态细菌细菌转化1.前言碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达
分子生物学综合实验论文题目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam H I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。
取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。
重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。
当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。
关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam H I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言： (1)1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） (1)1.1.1 GFP研究背景 (1)1.1.2 GFP研究应用 (2)1.2基因的克隆与表达 (3)2.实验试剂及实验仪器： (5)2.1实验试剂与材料： (6)2.2实验仪器： (7)3.实验方法 (7)3.1质粒提取方法: (7)3.2琼脂糖凝胶电泳及回收: (9)3.3酶切及连接： (11)3.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入： (12)3.5酶切验证重组质粒： (13)3.6GFP基因的表达 (14)3.6.1活化菌种 (14)3.6.2扩大培养 (14)3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达 (14)4.结果与分析 (14)4.1质粒提取过程中现象与结果： (14)4.2琼脂糖凝胶电泳 (15)4.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果： (16)4.4酶切验证重组质粒 (16)4.5GFP基因的表达结果： (17)5.讨论： (18)5.1提取质粒出现图六的原因是： (18)5.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： (18)5.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因: .. 19 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因： (19)5.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： (19)6.参考文献 (20)前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）1.1.1 GFP 研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
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6、重组DNA的鉴定
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验原理：
在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌 染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的 性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢 复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
实验原理：
转化技术的关键在于制备感受态细胞， 本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低 渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失 去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细 胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合 物进入细胞。
4、重组DNA的转化
热
实验步骤：
激
感受态细菌 100 l
＋
连接产物 混匀 10 l 冰浴中30分钟
它的这一些性质为生物学研究提供了 很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视 场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且 还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的 观察成为可能。
绿色荧光蛋白简介
下村修
马丁·沙尔菲
钱永健
他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的 贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖
实验目的
掌握绿色荧光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深 对基因克隆的认识，如：
2、PCR扩增目的基因
实验步骤：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时50分钟
2、PCR扩增目的基因
电泳结果：
结果分析：
3、构建重组DNA
实验原理： 利用pMD18-T Vector这个高效克隆PCR
6、重组DNA的鉴定
实验原理： 提取菌体内重组DNA，运用限制性内
切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ对重组DNA进行酶切， 将酶切产物进行电泳，将结果与理论值相 比较
6、重组DNA的鉴定
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
1 min
溶液S1
绿色荧光蛋白的克隆 实验汇报
组员：洪旭伟 唐开强 胡巍然 蔡毅
绿色荧光蛋白简介
绿色荧光蛋白 （GFP）是一种存 在于水母、水螅和 珊瑚等腔肠动物体 内的发光蛋白，其 基因所产生的蛋白 质，在蓝色波长范 围的光线激发下， 会发出绿色荧光。
绿色荧光蛋白简介
绿色荧光蛋白相对荧光素/荧光素酶的优点： 1、发光机理简单 2、光毒性非常弱
5、重组DNA的筛选
实验步骤：
①培养基平板的准备：分别在加有抗生素（氨 苄青霉素(Amp)）和没有加入抗生素的琼脂平板 上加40ul X-gal储存液和4ul IPTG溶液； ②设置对比组及涂布：取转化菌若干与受体菌 液若干，与预先加入的X-gal和 IPTG混合，用无 菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面， 于37°C正面朝上培养，直至菌液完全吸收；
掌握碱裂解法提取质粒的方法 掌握紫外吸收测定DNA的方法 了解质粒酶切鉴定原理 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
在提高实验技能的同时，还要注重提高自身的实 验素养以及培养严谨的科学研究态度
实验材料
大肠杆菌DH5a菌株 pMD18-T载体 易瑞质粒小量提取试剂盒
BioWest电泳琼脂糖干粉 0.5×TBE核酸电泳缓冲液 EB 核酸荧光染料 Takara 6 × 电泳上样缓冲液
250μl 裂解液S2
3. 裂解细胞 颠倒混匀4-6次
室温静置
4. 中和 350μl 中和液S3
温和地 颠倒混匀6-8次
12，000rpm 10 min
至出现白色
絮状沉淀
3~5min 5. 过柱分离 12，000rpm
取600μl上清至 30s 吸附柱管
弃滤液
6. 洗柱 12，000rpm
600μl
产物的专用载体，在连接液中短时间对目 的基因与载体进行连接
3、构建重组DNA
实验步骤：
①在微量离心管中配制下列DNA溶液：
pMDTM18-T Vector 0.5μl
Insert DNA
1μl
dH2O
3.5μl
②加入5 μl（等量）的 Solution I。
③16℃反应45分钟。
4、重组DNA的转化
Takara EcoRI 限制性内切酶 Takara Hind III 限制性内切酶 Takara 10 × M 酶切缓冲液
实验仪器
恒温摇床 台式高速离心机 PCR仪 水平电泳槽 电泳仪 水浴锅
1、含目的基因质粒的提取
2、PCR扩增目的基因
实 验
3、构建重组DNA
步
4、重组DNA原理：
PCR由变性—退火—延伸这三个基本反应 构成： ①模板DNA的变性，即加热使DNA双链解离为 单链； ②退火降温后，引物与模板DNA单链配对结合； ③DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作 用下，合成一条新的与模板DNA链互补的复制 链。经过2～3小时的扩增，目的基因就能扩增 几百万倍
42℃水浴 90秒
勿 动
涂板 培养过夜
加入800l LB培养液 37℃振荡培养45分钟
冰浴1-2分钟
5、重组DNA的筛选
实验原理：
载体DNA控制产生的产物α-肽与宿主菌 染色体上的DNA控制产生的产物ω-肽，结合 为具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。在 诱导剂IPTG的作用下，细菌可产生蓝色菌落。 当外源DNA插入到载体质粒的多克隆位点后， 无法形成具有完整β-半乳糖苷酶活性的蛋白 质，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落
1 min
溶液S1
250μl 裂解液S2
3. 裂解细胞 颠倒混匀4-6次
室温静置
4. 中和 350μl 中和液S3
温和地 颠倒混匀6-8次
12，000rpm 10 min
至出现白色
絮状沉淀
3~5min 5. 过柱分离 12，000rpm
取600μl上清至 30s 吸附柱管
弃滤液
6. 洗柱 12，000rpm
600μl
30s 弃滤液
洗涤液W
7. 洗脱
取吸附柱至 50μl 56℃预热 另一新EP管 洗脱液
600μl 洗涤液W
12，000rpm
10，000rpm
30s 弃滤液 2 min
空柱
室温静置 1min
12，000rpm
1 min 收集洗脱液备用
1、含目的基因质粒DNA的提取
电泳结果：
结果分析：
2、PCR扩增目的基因