克隆绿色荧光蛋白分子生物学实验报告
分子生物学实验设计报告
分⼦⽣物学实验设计报告分⼦⽣物学实验设计报告——得到表达绿⾊荧光蛋⽩基因的⼤肠杆菌郭晓涵艾珉吉实验最终⽬标：得到表达绿⾊荧光蛋⽩基因的⼤肠杆菌实验所需质粒：PET28a质粒、pEGFP-N3质粒（⽼师提供）（pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体）实验所需细胞：DH-5α和BL-21感受态细胞（⽼师提供）实验主要部分：将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转⼊感受态细胞并扩⼤培养；提取上述两种质粒并酶切检测；扩增EGPF基因⽚段和pET-28a酶切质粒并构建重组质粒；重组质粒转⼊DH-5α扩增及菌落PCR检测与细胞发光检测。
图⽰如下：两种质粒扩⼤培养及酶切检测载体质粒PET-28a ⽬的基因质粒(绿⾊荧光蛋⽩)质粒重组具体步骤：分离质粒DNA的⽅法⼀般包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增收集和裂解细菌分离和纯化质粒DNA重组质粒PET-28a-GFP的构建：E.coli DH-5α（pEGFP-N3） E.coli DH-5α（pET-28a）质粒pEGFP-N3 质粒pET-28a插⼊⽚段连接插⼊⽚段重组质粒（PET-28a-GFP）⼀、将PET28a质粒及pEGFP-N3质粒转⼊DH-5α感受态细胞并扩⼤培养1. 取200 µl制备好的感受态细胞，冰上解冻，均匀悬浮。
2. 分别加⼊2 µl⽬的质粒，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
3. 42 ℃⽔浴2min后，冰上放置2 min。
4. 加⼊400µl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
5. 取200 µl悬浮细胞均匀涂布在LB固体培养基（含卡那霉素）上，培养⽫正放静置1-2 h后，封⼝膜封好，37 ℃倒置培养12-18 h，留做备⽤。
注：LB培养液的制备⽅法——胰蛋⽩胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，⽤1N NaOH调pH 7.5。
生化绿色荧光蛋白的基因克隆及表达开题报告
学号：班级：姓名：《生物化学与生物分子学实验》——分子生物学设计性实验开题报告实验课题:绿色荧光蛋白的基因克隆及表达指导老师:作者姓名:所在院系：小组编号：小组成员:完成时间：成都医学院Cheng Du Medical College题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达立题依据：随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合,将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1].1.选材：大肠杆菌大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点.而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 ％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
2.基因标记技术基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白,分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白［2］.3。
绿色荧光蛋白从水母（Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成,第65～67位氨基酸(Ser-Tyr—Gly）形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定,且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光.绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因.【实验目的】研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达.【研究意义】研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达.通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
绿色荧光蛋白的克隆实验汇报.
6、重组DNA的鉴定
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验原理：
在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌 染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的 性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢 复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
实验原理：
转化技术的关键在于制备感受态细胞， 本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低 渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失 去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细 胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合 物进入细胞。
4、重组DNA的转化
热
实验步骤：
激
感受态细菌 100 l
＋
连接产物 混匀 10 l 冰浴中30分钟
它的这一些性质为生物学研究提供了 很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视 场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且 还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的 观察成为可能。
绿色荧光蛋白简介
下村修
马丁·沙尔菲
钱永健
他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的 贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖
实验目的
掌握绿色荧光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深 对基因克隆的认识，如：
2、PCR扩增目的基因
实验步骤：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时50分钟
2、PCR扩增目的基因
电泳结果：
结果分析：
3、构建重组DNA
绿色荧光蛋白基因克隆及表达 结题报告
H2O 10XPCR Buffer EGFP-F EGFP-R dNTP rTap 菌 总体积
15μl 2.5μl 2μl 2μl 2μl 0.5μl 1μl 25μl
11.阳性菌株培养
等转板的菌长出以后,挑取2~3个阳性克隆 摇菌,37℃过夜。
12.重组质粒提取
(1)取已经培养好的含有pEGFP和pET-28a重组质粒1.5mL置于Eppendorf管中 ，以10000r/min离心1min，去掉上清；重复一次。然后将小管倒扣在吸水纸上 ，并用移液枪吸出多余的菌液，尽量除尽。加入150μL的GET缓冲液，充分混 匀，室温下放置10min。使用EDTA是为了除去细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易 与细胞壁接触。
重复步骤上述步骤。将吸附柱Ca2放回收集管中，12000r/min离心 2min，室温放置数分钟，彻底除去漂洗液PW。将吸附柱Ca2，置于 室温10分钟，向吸附膜的中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温 放置2min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液。
6.连接反应
（1）将酶切后的片段用T4-DNA连接酶相 连 （2）16℃连接过夜。
试剂
溶液1－G.E.T缓冲液（pH8.0），溶液2－ 0.2mol/L NaOH, 1%SDS，溶液3－乙酸钾溶液 (3M, pH=4.8)，灭菌蒸馏水，pH7.5~8.0醋酸铵 （NH4Ac）7.5mol/L，异丙醇，70％乙醇，无水 乙醇，0.5 × TBE缓冲液，平衡液BL，溶胶液 PN，漂洗液PW，洗脱缓冲液EB，0.1 mol/L CaCl2溶液，卡那霉素100mg/ml，IPTG，2KB DNA Maker，6XLoading Buffer，酶反应终止 液(10 x Loading Buffer)，0.25%溴酚蓝， 10xPCR缓冲液，琼脂糖，NaAc，TE缓冲液， 酚氯仿，T4DNAligase及其缓冲液(10 x ligase Buffer)
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
绿色荧光蛋白基因重组与鉴定
分子生物学综合性实验结题报告绿色荧光蛋白基因左xx1学 10110902014 10110904007 班 10G20专生物制药学生物医药摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。
本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification.Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；1..引言 ------------------------------5页2..应用前景 ------------------------------6页3..分子生物学实验原理 ------------------------------8页4..实验材料及试剂 ------------------------------12页5..实验流程 ------------------------------13页6..实验结果 ------------------------------19页7..分析 ------------------------------21页参考文献 -------------------------------22页致谢 ------------------------------ 23页附录 -------------------------------24页绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于水母﹑水螅何珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,这种蛋白质最早是由普林斯顿大学的科学家下村修（Osamu Shimomura）等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
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南方医科大学绿色荧光蛋白的克隆实验报告年级专业 2014级生物技术姓名朱旭峰学号 3147020042摘要细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
Cloning of green fluorescent proteinAbstract：Bacterial plasmid is a kind of double chain, closed-loop DNA, ranging from 1KB to 200kb. All plasmid is present in the cytoplasm, independently from the chromosome of autonomously replicating genetic component, usually under the condition of sustainable and stable in staining in the free state, but under certain conditions will irreversibly integrated into the host chromosome, with the replication of the chromosome replication and by cell split passed on to future generations.Plasmids have become the most commonly used gene cloning vector molecules, the important condition is to obtain a large number of purified plasmid DNA molecules. There are many methods can be used to extract plasmid DNA, the following are mainly introduced the method of extracting plasmid DNA by alkaline lysis method.关键词 GFP 质粒提取感受态细菌细菌转化1.前言碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
2.实验目的2.1.学习碱裂解法提取质粒的原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。
它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
目前，经人工改造的质粒已广泛用基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。
现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。
实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。
其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA 与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
2.2.掌握蓝白斑筛选的实验方法及原理蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。
如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
3.实验原理3.1.碱裂解法1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；2)高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；3.2.离心层析柱1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2)去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3)低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3.3.感受态细菌的制备（CaCl2法）1)挑取一DH5α单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养2)取其中500 µl菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间（旋转摇床200～300r/min，培养液调零，每隔20～30min测量）3)取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟4)加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，5)4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
6)感受态细胞分装成100 µl的小份，暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。
取其中一份进行转化。
3.4.重组DNA的鉴定（酶切）1)质粒DNA三种构型：1.共价闭环超螺旋2.线性3.开环的双链环状2)在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率：3)共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA3.5.琼脂糖凝胶电泳方法1)凝胶准备① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加0.5×TBE 200ml ；② 盖上牛皮纸，用橡皮筋捆紧③微波炉加热n次，直至融解，1min/次，中高温（一般3~5次）；2)胶床准备① 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；② 将胶床放在调整好的水平台上；3)铺胶：将冷却至60℃的凝胶加入20 µl荧光染料(有毒)倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；4.实验设备恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅5.实验材料及试剂5.1.试剂的配制LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）S1;50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA (pH8.0) 2mg/mL溶菌酶S2;0.2 mol/ L NaOH 1% SDSS3:5mol/L 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml5.2.材料的处理含pEGFP-N1质粒的大肠杆菌DH5αa琼脂糖凝胶的制备上样：每孔上一个样品，加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀(如预加有染料物质，可省此步)电泳：电压80~120v；20~30min结果观察：凝胶成像仪6.实验操作步骤6.1.小实验一:质粒提取6.2.小实验二取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：PCR反应体系H2O 6µl质粒DNA（pEGFP-N1）2µl引物GFP1 (10µM) 1µl引物GFP2 (10µM) 1µlPremix Taq 10µl总体积20µl如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上① 94℃预变性5分钟后开始以下循环② 94℃ 30 秒56℃ 30 秒 30 循环72℃ 1 分钟③ 72℃ 7 分钟④ 4 ℃保温实验过程约1小时50分钟琼脂糖凝胶电泳操作•琼脂糖凝胶的制备•上样：每孔上一个样品，加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀(如预加有染料物质，可省此步)•电泳：电压80~120v；20~30min•结果观察：凝胶成像仪6.3.小实验三感受态细菌制备和T连接连接反应体系实验组①对照组②即用型蓝白T载体 1 µl 1 µlPCR扩增产物Control Insert DNA 快速连接缓冲液(2X) 1 µl-----5 µl-----1 µl5 µl超纯水-ddH2O 2.5 µl 2.5 µl Rapid T4 DNA ligase 0.5 µl 0.5 µl 总体积10 µl 10 µl重组DNA的转化感受态细菌制备1.挑取一DH5α单菌落于2.5ml LB培养液中37℃过夜培养2.取其中500 µl菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间（旋转摇床200～300r/min，培养液调零，每隔20～30min 测量）3.取50ml菌液置于离心管内，4 ℃4500g离心5分钟4.加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟5.4℃4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。