ChIP操作步骤
CHIP实验操作
ChIP实验操作指南国家瓜果改良中心荔枝分中心采用Bowler等（2005）的方法，具体如下：1收获2.0g花生根、茎、也、种子于一个50ml离心管中。
2加40 ml超纯水于离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2次。
3去掉尽可能多的水，再加入37ml 1% 甲醛，与15-25 ℃，真空放置15 min。
4 加入2.5 ml 2 M甘氨酸是离心管中的甘氨酸的终浓度为0.125 M，再真空放置5 min。
5 加40ml超纯水与离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2-3次。
6去掉尽可能多的水，液氮速冻后-80℃保存或直接利用。
第一天1 准备核酸提取液Extraction buffer 1、2、3，并4 ℃预冷。
2 液氮淹没样品，样品尽量磨碎，注意不用潮解样品。
3 预冷的50 ml离心管中加入预冷的30 ml核酸提取液1 ，再将样品粉末加入离心管中，轻柔颠倒混匀后放在冰上5 min.4 再拿一个50 ml离心管于冰上预冷，用两层滤膜将样品过滤入该离心管，如果滤液中仍有残渣，重复步骤4。
5 4 ℃， 3000g 离心10min。
6 小心弃上清，加入1 ml 4 ℃预冷核酸提取液2重悬浮沉淀，移入进口（或严格灭菌）的1.5ml 离心管，4 ℃，12000g离心溶液10Min.7 小心弃上清，加入300μl 4 ℃预冷核酸提取液3重悬浮沉淀,可以轻柔颠倒助匀，但要避免起泡。
（核酸提取液3很粘稠，但还是要尽量重悬浮好沉淀）。
8 在一新4 ℃预冷离心管中加300μl 4 ℃预冷核酸提取液3，再将步骤7的溶液小心加入上层，4 ℃，16000g离心溶液1h（准备步骤9，制一块1%琼脂糖凝胶，用80μl CHIP 洗液洗磁珠）。
9 准备核酸裂解液 Nuclei lysis Buffer。
10 小心弃上清，加入300μl预冷核酸裂解液，于冰上用（剪过尖端）枪头吹打溶液混匀或轻柔颠倒助匀，但要注意避免起泡。
并取出1-2μl混匀也来作为对照看超声波破碎后的对照。
CHIP技术操作步骤
CHIP技术操作步骤CHIP技术（也称为微芯片或集成电路）是一种用于制造电子设备的技术，它将数十亿个晶体管和其他电子元件集成在一个小小的硅芯片上。
CHIP技术在各个领域都有广泛的应用，包括计算机、通信、医疗和汽车等。
下面是CHIP技术操作的一般步骤：1.设计：首先，需要进行芯片的设计。
这个过程通常由专门的集成电路设计工程师完成。
设计师使用计算机辅助设计软件来创建芯片的电路图和布局。
他们还需要考虑功耗、散热和信号传输等因素。
2.掩膜制备：一旦设计完成，接下来需要制备用于芯片制造的掩膜。
掩膜是一种通过光刻技术将芯片上的电路图转移到硅片上的透明薄膜。
制备掩膜需要使用电子束或激光刻蚀等先进的技术。
3.硅片制备：在制备掩膜的同时，需要准备用于芯片制造的硅片。
硅片是一种高纯度的硅晶体，上面没有电路图。
硅片的制备通常通过铸造、切割和抛光等步骤完成。
4.光刻：一旦掩膜和硅片准备好，接下来需要进行光刻。
光刻是将掩膜上的电路图转移到硅片上的过程。
在光刻中，硅片表面涂上光刻胶，然后将掩膜放在光刻机上，通过紫外线照射，将电路图转移到光刻胶上。
5.刻蚀：一旦光刻胶上有了电路图，接下来需要进行刻蚀。
刻蚀是将光刻胶上的电路图转移到硅片上的过程。
刻蚀通常使用化学物质或离子束进行，以去除光刻胶上的多余部分。
6.清洗和检验：刻蚀完成后，需要对芯片进行清洗和检验。
清洗可以去除刻蚀过程中的残留物，确保芯片表面干净。
检验可以检查芯片上是否有缺陷或损坏。
7.封装和测试：一旦芯片制造完成，接下来需要进行封装和测试。
封装是将芯片放入塑料或陶瓷封装中的过程，以保护芯片并提供连接外部设备的接口。
测试是对芯片进行功能和可靠性测试，以确保其正常工作。
8.成品芯片：经过封装和测试后，芯片将成为最终的成品。
它可以被集成到各种电子设备中，如计算机、手机和汽车等。
总结：CHIP技术操作步骤包括设计、掩膜制备、硅片制备、光刻、刻蚀、清洗和检验、封装和测试，最终得到成品芯片。
ChIP操作步骤
ChIP实验步骤第一部分、细胞的甲醛交联与超声破碎1. 交联前的准备工作（1）细胞准备：对细胞进行一定条件的处理，以确保目的基因的转录激活。
细胞密度应达到1×106细胞/10 cm培养皿。
（2）配制1％甲醛溶液：270 μl 37%甲醛加入10 ml无血清细胞培养液中即可，应使用高质量的甲醛。
2. 交联与超声破碎优化超声条件，以保证目的细胞的染色质DNA能被剪切为200 bp～1000 bp的片段，具体操作如下（以HepG2细胞为例）：（1）小心吸出细胞培养液，加入1％甲醛溶液10 ml，37℃孵育10 min，然后置冰上5 min终止固定。
（2）小心尽量吸净培养液，用预冷的PBS 3 ml洗细胞两次。
（3）加入预冷的内含PMSF（10ul）的PBS 1 ml。
刮取细胞并移至离心管中，于4℃以1200 rpm（约3000 g）离心5 min，小心移走上清液，得到细胞沉淀（细胞沉淀可于-80℃保存数月）（4）以200μl SDS裂解缓冲液重悬细胞（含PMSF：2ul），冰上放置10 min（5）冰上超声剪切染色质DNA，使其成为200 bp～1000 bp的片段（10个脉冲，每个20 s，脉冲间隔20 s）（6）加入5M Nacl 8 μl，65℃，4h至过夜，以解交联（7）琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果（所获超声剪切物可于-80℃保存数月）。
第二部分、免疫共沉淀如果超声条件优化已经优化好，在步骤“（一）.2(5)”后，进行下列步骤。
对于阴性对照，采用下述步骤“5”所述。
接上述2(6)1. 4 ℃，13,000rpm离心10min，转移上清至2ml离心管中。
2.以含蛋白酶抑制剂的CHiP稀释缓冲液1800μl，稀释200μl的上清至2ml。
3.为了去除与蛋白A-琼脂糖非特异结合的分子，加入75 μl蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4℃旋转孵育30 min。
4.4℃,以1000 rpm离心1 min以沉淀琼脂，将上清转移至新的离心管中。
chip基本实验步骤
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将proteinA/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。
用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。
我们以常用的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。
a. 缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。
b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。
然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl 的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。
chip操作步骤
磁珠吸附法chip操作步骤及试剂配方1、每盘细胞（8ml培液），加入11×Fixation solution 800ul使得甲醛的终浓度为1%，fixation solution为现配，室温摇床10min。
(甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。
甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析; 交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。
交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。
甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。
)2、终止交联：加1M甘氨酸1.26ml，使其终浓度为0.125。
室温摇床5min。
3、用冰冷的PBS 冲洗两次后，加适量pbs+pmsf，用细胞刷刮下细胞，4℃ 1000RPM离心5min。
4、倒去上清，加入1ml Scell Lysis Buffer，冰上放置10min，匀浆器匀浆后转入2ml Ep管中，4℃ 5000RPM离心5min.5、弃上清，300ul nuclei Lysis buffer，吹散沉淀。
6、socinate破碎：1min on off 30 10次左右，4℃ 13000RPM离心20min，琼脂糖胶电泳，亮带集中在1000bp左右的方可。
(以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。
)7、分别收集20ul样品做input -20℃保存。
(Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
)8、用 Chip Diluiton Buffer 稀释样品10倍9、准备beads，用Pre-Blocking buffer for dynabeads 洗beads3次.(Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合)，最好实验前一天准备beads。
ChIP原理及实验方法
ChIP原理及实验方法ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要用于探究转录因子与染色质的相互作用、蛋白质修饰与基因表达调控之间的关系等。
下面将详细介绍ChIP的原理和实验步骤。
ChIP的原理：ChIP的基本原理是通过特异性抗体结合到目标蛋白质上，然后通过交联、裂解、免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段。
通过对这些DNA片段的分析，可以了解目标蛋白质在染色质上的分布情况，从而揭示蛋白质与DNA相互作用的生物学功能。
ChIP的实验步骤：1.交联：将细胞或组织与甲醛交联，使蛋白质与DNA形成稳定的结合。
2.裂解：将交联的样品进行裂解，使细胞核和染色质释放出来。
3.免疫沉淀：将特异性抗体加入裂解的样品中，使其与目标蛋白质结合。
通过免疫沉淀，可以分离出与抗体结合的蛋白质-DNA复合物。
4.洗涤：通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质和DNA。
5.解交联：通过高温或酶解去除交联，使DNA恢复原始状态。
6.DNA提取：将解交联后的样品进行DNA提取，获取与目标蛋白质结合的DNA片段。
7.PCR扩增：使用特异性引物对提取的DNA片段进行PCR扩增，以检测目标DNA片段的存在与否。
8.数据分析：通过测定PCR产物的数量，可以推断目标蛋白质在染色质上的结合情况。
ChIP的注意事项：1.选择合适的抗体：要确保选择的抗体具有高特异性和敏感性，以避免误差和背景信号。
2.优化实验条件：包括交联时间、裂解方法、洗涤条件等，以获得清晰的信号和较低的背景噪音。
3.正负对照组：需要设置正负对照组，以验证实验结果的可靠性。
4.数据分析：可以使用定量PCR、测序等方法对ChIP的结果进行定量和定性分析。
总结：ChIP是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的重要实验方法。
通过ChIP，可以了解转录因子在染色质上的定位、蛋白质修饰与基因表达调控之间的关系等。
chip具体步骤
一、ChIP实验步骤第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入S DS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80％。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。
共14次。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。
去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转混匀1h。
10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。
各留取20ul做为input。
一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。
CHIP实验步骤
CHIP实验步骤CHIP（Chemiluminescence Immunoassay Platform）是一种化学发光免疫分析平台，用于检测生物样本中的目标分子。
以下是进行CHIP实验的一般步骤，包括准备试剂和设备、样本处理、操作步骤、结果分析等。
1.准备试剂和设备a.试剂：准备所需的试剂，包括化学发光底物、缓冲液、酶标抗体、标准物质等。
b.CHIP分析仪：确保设备完好，对仪器进行校准和灵敏度测试。
2.样本处理a.生物样本采集：根据研究目的选择适当的生物样本，如血清、尿液或细胞培养上清等。
b.样本预处理：根据实验要求，进行样本的预处理，如离心、冻存等。
c.样本稀释：对样本进行适当的稀释，以保证在检测范围内。
3.实验操作a.准备酶标板：将酶标板板孔均匀涂覆酶标抗体，或者根据实验需要的反应物质进行固定。
b.加入标准曲线：将标准物质以不同浓度加入酶标板孔中，用于绘制标准曲线。
c.加入样本：将处理好的样本加入空白酶标板孔中，并与标准曲线孔一同进行测定。
d.加入辅助试剂：加入辅助试剂，如酶标抗体、荧光素底物等，使其与样本中的目标分子反应。
e.反应：将酶标板放入恒温水浴或实验室平台，使其反应一定时间。
f.清洗：将酶标板反复洗涤，去除未与目标分子结合的物质。
g.加入底物：加入化学发光底物，使其与酶标板上的酶反应发光。
h.测量发光：将酶标板装入CHIP分析仪中，测量发光强度。
4.数据分析a.标准曲线测定：根据标准曲线上各点的发光强度，绘制标准曲线，用于计算未知样本中目标分子的浓度。
b.样本浓度计算：根据未知样本的发光强度，通过标准曲线插值法计算目标分子的浓度。
c.质控分析：检查质控样本的测定结果是否在预设范围内，以确保实验的准确性和可靠性。
d.统计分析：对实验结果进行统计分析，如平均值、标准差等。
通过实验步骤的规范操作，可以使用CHIP分析平台进行免疫分析，检测生物样本中的目标分子。
这种分析方法具有灵敏度高、快速、准确性以及对多个样本的同时处理能力等优点，被广泛应用于临床诊断、药物研发、食品安全等领域。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ChIP实验步骤
第一部分、细胞的甲醛交联与超声破碎
1. 交联前的准备工作
（1）细胞准备：对细胞进行一定条件的处理，以确保目的基因的转录激活。
细胞密度应达到1×106细胞/10 cm培养皿。
（2）配制1％甲醛溶液：270 μl 37%甲醛加入10 ml无血清细胞培养液中即可，应使用高质量的甲醛。
2. 交联与超声破碎
优化超声条件，以保证目的细胞的染色质DNA能被剪切为200 bp～1000 bp的片段，具体操作如下（以HepG2细胞为例）：
（1）小心吸出细胞培养液，加入1％甲醛溶液10 ml，37℃孵育10 min，然后置冰上5 min终止固定。
（2）小心尽量吸净培养液，用预冷的PBS 3 ml洗细胞两次。
（3）加入预冷的内含PMSF（10ul）的PBS 1 ml。
刮取细胞并移至离心管中，于4℃以1200 rpm（约3000 g）离心5 min，小心移走上清液，得到细胞沉淀（细胞沉淀可于-80℃保存数月）
（4）以200μl SDS裂解缓冲液重悬细胞（含PMSF：2ul），冰上放置10 min
（5）冰上超声剪切染色质DNA，使其成为200 bp～1000 bp的片段（10个脉冲，每个20 s，脉冲间隔20 s）
（6）加入5M Nacl 8 μl，65℃，4h至过夜，以解交联
（7）琼脂糖凝胶电泳观察剪切效果（所获超声剪切物可于-80℃保存数月）。
第二部分、免疫共沉淀
如果超声条件优化已经优化好，在步骤“（一）.2(5)”后，进行下列步骤。
对于阴性对照，采用下述步骤“5”所述。
接上述2(6)
1. 4 ℃，13,000rpm离心10min，转移上清至2ml离心管中。
2.以含蛋白酶抑制剂的CHiP稀释缓冲液1800μl，稀释200μl的上清至2ml。
3.为了去除与蛋白A-琼脂糖非特异结合的分子，加入75 μl蛋白A/鲑鱼精DNA
琼脂, 4℃旋转孵育30 min。
4.4℃,以1000 rpm离心1 min以沉淀琼脂，将上清转移至新的离心管中。
并从
这2ml中取出20μl作为“input DNA”对照。
5.将上清分为两份，一份加入针对DNA结合蛋白的特异性抗体2μg，另一份加
强如抗体阴性对照（IgG）2μg，4℃旋转孵育过夜（孵育时间可视情况而调整）。
6.加入60μl蛋白A/鲑鱼精DNA琼脂, 4℃旋转孵育60 min以收集抗体/转录因子
复合体。
7.4℃,以1000 rpm离心1 min，小心移除上清（内含未结合及非特异DNA）。
8.按以下顺序洗涤蛋白A/抗体/转录因子/DNA复合物，每种缓冲液加0.5ml，旋
转孵育3min，然后4℃, 1000 rpm离心1 min，弃上清液。
（1）低盐洗涤缓冲液，1次；
（2）高盐洗涤缓冲液，1次；
（3）LiCL洗涤缓冲液，1次；
（4）TE缓冲液，2次
第三部分、洗脱与转录因子结合的DNA
1. 配制新鲜的洗脱缓冲液（1%SDS, 0.1M NaHCO3, 按照1：9体积比配制）。
2. （接（二）.8）向蛋白A-琼脂糖/抗体/抗原/DNA复合物中，加入200 μl洗脱缓冲液，轻弹管壁混匀，室温放置5min. 1200 rpm离心1 min，收集上清液。
3. 向洗脱上清及放置在一边的“input DNA”管中，分别加入5 mol/L NaCl 20 μl，65℃水浴4 h,以解交联。
短暂离心收集管壁液体（该样品可-20℃保存）。
4. 加入0.5 mol/L EDTA 10 μl，1 mol/L Tris-HCl（pH6.5）20 μl，10 mg/ml的蛋白酶K 2 μl，45℃孵育10min。
5. cycle-pure法回收DNA，-20℃保存样品
①加入400μl PC缓冲液，混匀后12000 rpm离心1 min过柱
②以500μl wash buffer 12000 rpm离心1 min洗柱，弃滤液；
③12000 rpm离心空柱1min，然后将柱置入一新的EP管中，加入30μl ddH2O，12000 rpm离心收集DNA
第四部分、DNA样品PCR分析
以上述溶解于ddH2O中的DNA作模板，利用特异性引物进行PCR。
应使PCR终止于线性反应时段（具体PCR参数和循环次数应进行优化）。
最后通过对扩增产物进行电泳（乃至于测序）来分析蛋白质所结合的DNA情况。
1. PCR体系
2. PCR条件
95℃4min
95℃30 sec.
55℃30 sec. 25 Cycles
72℃30 sec
3. 1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。