Invitrogen Lipofectamine2000
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE2000转染试剂转染步骤转染是指将外源DNA或RNA导入到目标细胞中的过程，LIPOFECTAMINE2000是一种常用的转染试剂。
下面是使用LIPOFECTAMINE2000进行转染的详细步骤：步骤一：细胞处理1.1培养要转染的细胞株，并确保细胞达到70%-80%的密度。
1.2使用无菌PBS洗涤细胞，将细胞悬浮于含有10%FBS的完全培养基中。
1.3通过计数细胞数来得到适当的细胞密度，以确保每个孔或皿中有足够的细胞进行转染。
步骤二：DNA/RNA和转染试剂的配制2.1在无菌离心管中配制DNA/RNA和转染试剂的混合液。
按照试剂的说明书中的推荐比例将DNA/RNA和转染试剂混合在一起，并使用无菌PBS 或者培养基和其它试剂进行稀释。
2.2轻轻摇晃混合液，避免产生气泡。
步骤三：转染3.1将配制好的转染混合液加入到每个孔或皿中，并轻轻摇晃培养皿/板使其均匀分布。
3.2将细胞和转染试剂混合液共孵育4-6小时，在37℃的CO2培养箱中进行转染反应。
转染时间可以根据目标细胞的特性进行调整。
步骤四：更换培养基4.14-6小时后，将转染混合液完全去除，并用预温热的完全培养基洗涤细胞，以去除未吸附的DNA/RNA和转染试剂。
4.2加入足够的完全培养基来覆盖细胞，尽量减少液体涡流，以避免对转染效率的不良影响。
步骤五：细胞培养和分析5.1将培养皿/板放回37℃的CO2培养箱中，并进行适当的培养条件。
5.2根据实验需要的时间点收集转染后的细胞进行后续的实验和分析。
需要注意的是，转染步骤中的各种参数（例如细胞密度、转染试剂的浓度和比例等）可能因不同的实验目的和目标细胞而有所不同。
因此，在具体操作中请参考所使用转染试剂和目标细胞的说明书，并根据实验需要进行相应的优化。
Lipofectamine2000转染说明书
Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent TABLE OF CONTENTSPRODUCT DESCRIPTIONSHIPPING CONDITIONSSTORAGE CONDITIONSSTABILITYQC SPECIFICATIONSPROTOCOL & APPLICATION NOTESRelative Surface Areas Of Tissue Culture VesselsSurface Areas Of Tissue Culture VesselsTubes Recommended For Use With Lipofectamine™ 2000Optimizing Plasmid DNA Transfections With Lipofectamine™ 2000Transfection ProtocolsCo-Transfection Of Sirna And Plasmid DNATransfection Of Fluorescently Labeled Oligos With Lipofectamine™ 2000Transfection Of Cells In 96-Well PlatesTransient Transfection Of Suspension CellsALTERNATE PRODUCTS & COMPATIBILITYPRODUCT DOCUMENTATIONREFERENCESPRODUCT NAME & CATALOG NUMBERSASSOCIATED PRODUCTSRELATED TECHNICAL SUPPORT NOTESPRODUCT DESCRIPTION(back to Table of Content)Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent is a proprietary formulation for the transfection of nucleic acids (DNA and RNA) into eukaryotic cells and provides the following advantages:Highest transfection efficiency in many cell types and formats (e.g. 96-well). Refer to the Cell Lines Database for a list of cell types successfully transfected. Detailed in-house transfection protocols are also available at this site whereavailable.DNA-Lipofectamine™ 2000 complexes can be added directly to cells in culture medium, in the presence or absence of serum.Lipofectamine™ 2000 may be used in the following applications:Transient and stable transfection of adherent and suspension cellsHigh throughput transfectionsDelivery of Stealth RNAi and siRNA into cells For information on transfecting mammalian cells with short interfering RNAs (siRNA) for use in RNA interference (RNAi) studies, visit our RNAi Central web page at\rnai. Cell line-specific protocols are available under the Protocols tab.Lipofectamine™ 2000 gives superior transfection efficiency for the following cell lines:293F 293H BE(2)C (w/o serum)serum)(w/o(adherent) COS-1CHO-K1 CHO-SFibroblasts (w/o serum)HumanPrimaryCOS7-Lserum) HT-1080 MDCK(w/oHT-29SK-BR3serum) PC12MRC-5(w/o3T3NIHHepG2VeroLipofectamine™ 2000 CD is a 100% synthetic version of Lipofectamine™ 2000. Use it in the same way as Lipofectamine™ 2000, but be sure to use animal origin-free reagents.SHIPPING CONDITIONS(back to Table of Content)This kit is shipped on wet ice.STORAGE CONDITIONS(back to Table of Content)Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent should be stored at 40 C.STABILITY(back to Table of Content)The stability of Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent is guaranteed for 6 months when it has been stored as recommended.Lipofectamine™ 2000 Reagent should not be frozen.QC SPECIFICATIONS(back to Table of Content)Lipofectamine™ 2000 is tested for the absence of microbial contamination using blood agar plates, Sabaraud dextrose agar plates, and fluid thioglycolate medium, and functionally by transfection of CHO-K1 cells with a reporter plasmid.PROTOCOL AND APPLICATION NOTES(back to Table of Content)General protocol notesSurface Areas Of Tissue Culture VesselsTubes Recommended For Use With Lipofectamine™ 2000Optimizing Plasmid DNA Transfections With Lipofectamine™ 2000Transfection ProtocolsCo-Transfection Of Sirna And Plasmid DNATransfection Of Fluorescently Labeled Oligos With Lipofectamine™ 2000Transfection Of Cells In 96-Well PlatesTransient Transfection Of Suspension CellsGeneral protocol notes(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)It is not necessary to remove complexes or change/add medium after transfection, but complexes may be removed after 4-6 hours.DMEM or RPMI 1940 can be used instead of Opti-MEM when making Lipofectamine™ 2000 – DNA complexes.However, the efficiency of complex formation may not be as high as with Opti-MEM. Cells in PBS can be transfectedusing Lipofectamine™ 2000.As long as the cells are healthy in the PBS, the transfection is likely to work.For a general plasmid DNA transfection protocol, please refer to the product insert:/content/sfs/manuals/Lipofectamine™2000_man.pdfA general protocol for transfecting Stealth RNAi or siRNA into mammalian cells can be found at the following site:/content/sfs/manuals/stealth_sirna_tsf_lf2k_man.pdfSurface Areas of Tissue Culture Vessels(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)48-well 24-well 12-well 6-well 35-mm 60-mm 100-mm 150-mm T25 T75 Culture Vessel 96-well0.7 2 4 10 10 20 60 140 2575 Surface Area (cm2) 0.30.237.5plate0.4 1 2 5 5 10 30 70 12.5 Ratioto24-wellTubes recommended for use with Lipofectamine™ 2000(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)It is best to use polypropylene tubes when pre-mixing Lipofectamine 2000 ™ and DNA. Polystyrene may not work as well.Optimizing plasmid DNA transfections with Lipofectamine™ 2000(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)The conditions that could be optimized include Lipofectamine™ 2000 amount, DNA concentration, and cell number. Keeping two variables constant, vary the third.For example: to optimize the amount of Lipofectamine™ 2000 for transfection in a 24-well plate, start with cells at >90% confluency and use a fixed amount of DNA (0.8-1.2 µg). With cell number and DNA concentration held constant, vary the amount of Lipofectamine™ 2000 to determine the optimal concentration (usually 1.5-3 µl). In the same way, the cell number and amount of DNA can also be optimized.It is recommended to use a range of 0.5 to 5 µl of Lipofectamine™ 2000 per µg of DNA. It is possible to minimize the effect of transfection on cell growth and viability by increasing the number of cells plated per well or by decreasing eitherLipofectamine™ 2000 amount or DNA concentration. With careful optimization, this can be achieved with little impact on the level of transgene expression.Transfection efficiency is typically measured as the percentage of cells translating and accumulating the protein of interest for detection in the total population. If the levels of translation or protein accumulation are low, a lower transfection efficiency may be obtained. A transfection control such as our BLOCK-iT Fluorescent Oligo (catalog # 2013) is a more accuratemeasure of the efficiency of DNA delivery since its detection is independent of expression in the cell.The following citation discusses the effect of variables such as cell density, liposome and DNA concentrations, liposome-DNA complexing time, and media components (serum and antibiotics) on transfection with Lipofectamine™ 2000. In addition, it also looks at high throughput transfections, siRNA transfections, and transfection of primary neurons.Advanced transfection with Lipofectamine™ 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications - Methods, Volume 33, Issue 2, June 2004, Pages 95-103 Brian Dalby, Sharon Cates, Adam Harris, Elise C. Ohki, Mary L.Tilkins, Paul J. Price and Valentina C. CiccaroneThough most cells transfect well in the presence or absence of serum, there are a few such as HeLa cells and Normal Human Fibroblasts that give better transfection efficiency in the absence of serum.Cell lines successfully transfected with Lipofectamine™ 2000:293F293H,293 BE(2)C(w/oserum)CHO-K1 CHO-S (adherent) CHO-S (suspension in CD CHO media)COS-1 (w/o serum) COS7-L(w/o serum) Primary Human FibroblastsHT-29(w/oserum) HT-1080 MDCKMRC-5(w/oserum) PC12SK-BR3VeroCHOCHO-DG44MCF7MDA-MB-361HCT116H1299RKOHep3B,HepG2HeLa Rzneo HOSC3H/10T1/2NIH3T3JurkatK562HUVECS LoVoA549Some cell lines for which transfection protocols are available (at the cell lines database)(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)Cell type TransfectionEfficiency (%) Cells per well(24-well plate)Lipofectamine™ 2000µl per well in24-well plate293H99 2 x 105 2293F99 2 x 105 2BE(2)C77 2 x 105 2.5BHK21- 1.0 x 105 3.0CHO-K1- 1.2 x 105 2.5CHO-S(adherent) 96 1.5 x 105 2.5Cos 1- 8 x 104 3.0COS7L99 8 x 104 2.5CV-170 8 x 104 1.5HeLa94 8 x 104 1.5HT-29- 1.5 x 105 3.0HT108081 8 x 104 1.5HUVEC<2% 8.0 x 104 2.0MDCK43 6 x 104 4MRC-5Not measured 1.5 x 105 2.5Murine Embryonic Stem Cells, D3 (6-well plates)75 1X106 (6-well) 8-12(6-well)NIH3T3Not measured 1.5 x 105 2PC1285 2.5 X 105 2Primary Human Fibroblasts48 8 x 104 2Primary Human Keratinocytes- 8 x 104 2RKO (field test) (6-well plates) 40 - 60 See protocol See protocol SKBR349 1.5 x 105 2Vero86 8 x 104 2Rat Hepatocytes50 1.25 x 105 1.5Rat E18 Cortical Neurons20-25 2 x 105 4Co-transfection of siRNA and plasmid DNA(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)Plasmid and siRNA co-transfection are possible. Co-transfections have been tested with Lipofectamine™ 2000 in GripTite™ cells (293 derived cells) plated at 1.8 x 105 cells/well in a 24-well format (0.5ml medium, no antibiotics).200ng of two different reporter plasmids were co-transfected with 10pmol of siRNA following the standardLipofectamine™ 2000 protocol, with 2ul of Lipofectamine™ 2000 per well. The total volume of the transfection mixes was 100ul, and it was added to the medium already in the wells.Transfection of fluorescently labeled oligos with Lipofectamine™ 2000(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)Fluorescently labeled oligos that depend on hairpin structures for quenching (like LUX primers) may fluoresce upon mixing with Lipofectamine™ 2000. In such cases Oligofectamine is suggested. Oligofectamine is very different chemically, and therefore not expected to exhibit the same strength of interaction.Transfection of cells in 96-well plates (also see Focus 21.3 page58)(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)Use the 24-well plate protocol with the following modifications:Plate 2-6 x 104 cells per well in 100 µl of the appropriate complete growth medium without antibiotics and with serum if cells are normally cultured in the presence of serum.For each well of cells, dilute 240 to 320 ng of DNA into 25 µl medium without serum (e.g., OptiMEM® I Medium) in 96-well, sterile micro titer plates.For each well of cells, dilute 0.8-1 µl of Lipofectamine™ 2000 into 25 µl OptiMEM® Medium and incubate for 5 min at room temperature. Once the Lipofectamine™ 2000 is diluted, combine it with the DNA within 30 min. Longerincubation times may result in decreased activity. This dilution can be prepared in bulk for multiple wells.Add 25 µl of the diluted Lipofectamine™ 2000 (from step 3) to each well containing diluted DNA (from step 2), mix gently, and incubate at room temperature for 20 min to allow DNA- Lipofectamine™ 2000 complexes to form.Add the DNA- Lipofectamine™ 2000 complexes (50 µl) directly to each well of the plates containing cells and mix gently.Optimal transfection conditions for transfections in 96-well plates:Cell Line Seeding Density(Cells per well) DNA per Well Lipofectamine™ 2000(µl)CHO-S 2 x 104240 ng 1 µlCOS-7L 2.5 x 104320 ng 1 µl293H, 293F 5 x 104320 ng 1 µlAlternate rapid protocol for 96-well transfections without pre-plating cells (also see Focus 21.3, page58): This protocol is designed as a rapid alternative that does not require plating cells the day before transfection. Instead, a suspension of cells is added directly to complexes prepared in 96-well plates. This protocol has been used successfully with the cells and conditions outlined below. Use poly-lysine coated plates (D or L) for best results.Dilute ~320 ng of each DNA to be tested into 25 µl medium without serum (e.g., OptiMEM® I Medium). Prepare the dilutions directly in 96-well cell culture plates.For each well, dilute 0.4-0.8 µl of Lipofectamine™ 2000 into 25 µl OptiMEM® I Medium and incubate for 5 min at room temperature. Prepare this dilution in bulk for multiple wells. Once the Lipofectamine™ 2000 is diluted, combine it with the DNA within 30 min. Longer incubation times may result in decreased activity.Add 25 µl of the diluted Lipofectamine™ 2000 (from step 2) to each well containing diluted DNA (from step 1), mix gently, and incubate at room temperature for 20 min to allow DNA-Lipofectamine™ 2000 complexes to form.Prepare a cell suspension so that the appropriate number of cells per well is contained in 100 µl of growth medium. Use approximately twice the cell density, depending on cell type, than with the standard protocol.Add 100 µl of the cell suspension (from step 4) to each of the wells containing the DNA-Lipofectamine™ 2000 complexes (from step 3) and mix gently.Incubate at 37o C in a CO2 incubator until ready to assay (24-48 h post transfection). It is not necessary to remove the complexes or change the medium. Cells will adhere as usual in the presence of the complexes.Transfection conditions for rapid 96-well protocol:Cell Line Cells per well DNA per well(100 µl suspension) Lipofectamine™ 2000 per wellCHO-S 5 x 104320 ng 0.8 µlCOS-7L 6 x 104320 ng 0.6-0.8 µl293H, 293F 1.2 x 105320 ng 0.4 µlTransient transfection of suspension cells(back to Table of Content)(back to Protocol and Application Notes)The following protocol was optimized with Jurkat and K562 cells, but can be used as a guideline for other types of suspension lines.For each transfection, add a cell suspension containing 4-8 x 105 cells in 500 µl of growth medium with serum but without antibiotics, to a well of a 24 well plate. For transfection of larger number of cells, scale up all the reagents (cells, media, DNA, Lipofectamine™ 2000 and plate size) proportionately to the number of cells transfected.For each well, dilute 0.8 - 1.2 µg of DNA into 50 µl of medium without serum (e.g., Opti-MEM). This can be prepared in bulk for multiple wells.For each well, dilute ~2 µl of Lipofectamine™ 2000 into 50 µl OptiMEM® I Medium and incubate for 5 min at room temperature. Once the Lipofectamine™ 2000 is diluted, combine it with the DNA within 30 min. Longer incubationtimes may result in decreased activity. This dilution can be prepared in bulk for multiple wells.Combine the diluted DNA from step 2 with the diluted Lipofectamine™ 2000 from step 3. Incubate at room temperature for 20 min to allow DNA-Lipofectamine™2000 complexes to form.Add the DNA-Lipofectamine™ 2000 complexes from step 4 (100 µl) directly to each well containing cells (from step 1) and mix gently by rocking the plate back and forth.Incubate for 4 h at 37o C in a CO2 incubator.In Jurkat cells, addition of PHA-L (Phytohemagglutinin L) and PMA (phorbol myristate acetate) at final concentrations of1 µg/ml and 50 ng/ml, respectively, enhances CMV promoter activity and gene expression. In K562 cells, PMA alone issufficient to enhance promoter activity. PMA and PHA are added after the 4-h incubation.Assay the cells at 24-48 h post-transfection for the appropriate activity. It is not necessary to remove the complexes or change the medium.Note: Jurkat cells are difficult to transfect and have low expression following transfection.The use of PHA-L and PMA did not affect the expression level of a beta-gal reporter (by ONPG assay) in either Jurkat cells orK562 cells in our hands. They are widely used in transfecting these cell types, and their use is most likely historical. Their ffectiveness in transfections with currently available lipid reagents has probably not been tested before.ePRODUCT DOCUMENTATION(back to Table of Content)Brochures Cell Lines CitationsCOA FAQ LicensingManuals MSDSREFERENCES(back to Table of Content)Krista Evans, et al..PGreen Lantern-1, A Superior Green Fluorescent Protein Mammalian Cell Transfection Reporter, Focus 18(2): 40.Valentina Ciccarone, et al. Lipofectamine™ 2000 Reagent for Rapid, Efficient Transfection of Eukaryotic Cells - Focus 21(2):54.Jean-Pierre Pichet and Valentina Ciccarone. Transfection of Mammalian Cells in 96-Well Plates with Lipofectamine™ 2000 Reagent. Focus 21(3):58.Cationic Lipid Reagent Selection. Focus 21(3):61.Linda Roy, et al. High Transfection Efficiency of Cloned Cell Lines. Focus 21(3):62.Achieve the highest transfection efficiencies and higher expression levels (with Lipofectamine™ 2000). Expressions 8(3):18.PRODUCT NAME AND CATALOG NUMBERS(back to Table of Content)Name Size Part Number Catalog Nnumber Lipofectamine™ 2000 Reagent 0.75 ml 52758 11668-027(11668027) Lipofectamine™ 2000 Reagent 1.5 ml 52887 11668-019(11668019) Lipofectamine™ 2000 CD Reagent 1.0 ml 52888 12566-014(12566014) ASSOCIATED PRODUCTS(back to Table of Content)OPTI-MEM I Reduced Serum Medium (catalog # 31985-062)AntibioticsGIBCO® Cell Culture ProductsNeed more help? Please email us by clicking here.。
各种转染试剂的中文转染方法
各种转染试剂的中文转染方法FuGENE6（Roche）转染步骤：转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。
将细胞以1-3×105/2 ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。
将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。
使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。
1. 在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100 ul。
2. 将3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。
3. 加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），轻弹管壁混合。
4. 室温孵育20分钟。
5. 将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1 ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2 ml不含血清和双抗的营养液。
6. 将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。
7. 3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。
细胞铺板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2. 对于每孔细胞，使用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0 ugDNA，轻轻混匀。
3. 使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250 ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10 ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。
Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。
NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。
4. 混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。
室温放置20分钟。
5. （optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。
Invitrogen Lipofectamine2000
Lipofectamine™ 2000前言Lipofectamine™ 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth™ RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。
该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNAj 进入哺乳动物细胞的步骤。
提供推荐的起始使用试剂剂量。
为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。
影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括：·转染效率·目的基因转录效率·蛋白质稳定性·所选择特异StealthTMRNA或者siRNA序列的效率·所选择哺乳动物细胞系的生长特征当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。
如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。
随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。
转染的一般性指导使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth™ RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。
如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™ 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth™ RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。
高浓度的Stealth™ RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。
注：我们推荐开始时使用40nM Stealth™ RNA或者siRNA。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
lipofectamine2000原理
lipofectamine2000原理Lipofectamine2000是一种常用于转染细胞的试剂，它的原理是通过脂质体介导的转染技术，将外源DNA或RNA导入到细胞内。
这种转染方法被广泛应用于基因功能研究、蛋白表达和基因治疗等领域。
脂质体是由脂质分子组成的小囊泡，可以与细胞膜融合并释放其内部所带的DNA或RNA分子。
Lipofectamine2000是由一种阳离子脂质和一种阴离子脂质组成的复合物，这种复合物能够与DNA 或RNA形成稳定的复合体。
当Lipofectamine2000和DNA或RNA共同存在于培养基中时，它们会自发地结合在一起，形成脂质体-核酸复合物。
脂质体-核酸复合物具有良好的转染效果，主要有以下几个原因。
首先，脂质体可以提供稳定的保护作用，保护DNA或RNA免受外界环境的影响。
其次，脂质体能够与细胞膜融合并被细胞摄取，将DNA或RNA导入到细胞内。
此外，Lipofectamine2000还可以增加细胞膜的通透性，使DNA或RNA更容易进入细胞。
Lipofectamine2000的使用方法相对简单。
首先，将所需的DNA 或RNA与Lipofectamine2000按照一定比例混合，形成脂质体-核酸复合物。
然后将复合物加入到细胞培养基中，与细胞共同孵育一段时间。
在此过程中，脂质体-核酸复合物与细胞相互作用，将DNA或RNA导入到细胞内。
最后，可以利用适当的实验方法检测转染效果，如荧光显微镜观察、PCR检测等。
尽管Lipofectamine2000在转染实验中具有诸多优势，但也存在一些局限性。
首先，该方法对细胞类型有一定的选择性，不同细胞株对Lipofectamine2000的响应程度不同。
其次，脂质体-核酸复合物的稳定性较差，容易受到环境因素的影响。
此外，Lipofectamine2000的转染效率可能受到多种因素的影响，如DNA或RNA浓度、孵育时间等。
为了提高转染效率，研究人员还不断改进Lipofectamine2000的配方和使用方法。
贴壁细胞的脂质体转染
一、实验材料1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项
Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项发布日期：2010-11-13 21:29:08 浏览次数：338Invitrogen脂质体2000的操作流程及注意事项众所周知，Invitrogen脂质体2000是广大老师所熟知的转染试剂，其特点：转染步骤快速简便（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕。
（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基。
我们介绍一下 Invitrogen脂质体2000的操作流程、注意事项等。
一、操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2、对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
3、对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
4、混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
5、直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
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Lipofectamine™ 2000
前言
Lipofectamine™ 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth™ RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。
该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNAj 进入哺乳动物细胞的步骤。
提供推荐的起始使用试剂剂量。
为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。
影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素
在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括：
·转染效率
·目的基因转录效率
·蛋白质稳定性
·所选择特异StealthTMRNA或者siRNA序列的效率
·所选择哺乳动物细胞系的生长特征
当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。
如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。
随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。
转染的一般性指导
使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导：
1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth™ RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。
如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™ 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth™ RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。
高浓度的Stealth™ RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。
注：我们推荐开始时使用40nM Stealth™ RNA或者siRNA。
2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。
通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。
低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。
根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。
3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。
4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM® I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine™ 2000和Stea lth™ RNA或者siRNA寡聚物。
5 可以使用invitrogen BLOCK-iT™荧光寡聚物(BLOCK-iT™Fluorescent Oligo)(目录号2013)帮助优化细胞系的转染条件。
一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT™荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。
如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT™荧光寡聚物说明书，说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。
需要材料
开始实验前准备下列试剂：
·目的哺乳动物细胞系（使用传代数低的细胞；转染前确信细胞健康和超过90％的存活率）
·目的Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火缓冲液中）
·Lipofectamine™ 2000试剂（使用前贮存在+4℃）
·Opti-MEM® I 低血清培养基（使用前37℃预热）
·合适的组织培养板及其它
转染步骤
使用Lipofectamine™ 2000转染Stealth™ RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，使用下述步骤。
参阅下列表格《推荐试剂的量和体积》以确定加入不同组织培养方式的试剂量以及体积。
使用推荐Lipofectamine™ 2000的量作为起始点，针对您的细胞系和Stealth™ RNA或者siRNA进行条件优化。
1 转染前一天，在不包含抗生素的适量的培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到30-50％。
2 每一个转染样品都要按照如下的方法准备寡聚物- Lipofectamine™ 2000复合物：
a. 在适量的不包含血清的Opti-MEM® I 低血清培养基稀释Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物，轻轻混匀。
b. 使用前轻轻混合Lipofec tamine™ 2000，然后稀释适量的试剂到Opti-MEM® I 低血清培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。
注：在30分钟内混合稀释的Lipofectamine™ 2000和稀释的寡聚物。
更长的孵育时间可能会降低活性。
c. 孵育5分钟后，混合稀释的寡聚物和稀释的Lipofectamine™ 2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。
溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染。
3 将寡聚物- LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。
通过轻轻地前后摇动培养板混合。
4 37℃，CO2培养箱孵育24-96小时，直到适合进行基因阻断分析。
不需要去除复合物或者改换培养基；然而，在转染后4-6小时改换培养基也不会损失转染的活性。
推荐试剂量和体积
下表列出了通过各种组织培养方式转染细胞时推荐使用试剂的量和体积。
使用推荐量的Stealth™ RNA或者siRNA（参看第4列）和Lipofectamine™ 2000（参看第6列）作为实验的起始点，针对您的细胞系和目的基因优化条件。
注：20μM Stealth™ RNA或者siRNA＝20pmo l/μl。
参考文献：
1. Gitilin, L.,Karelsky,s.,and Andino,R.(2000) Nature 418,430-434.
2. Yu,J.L.,DeRuiter,S.L.,and Turner,D.L.(2002) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99,6047-6052。