T载体插入位点附近序列+测序引物
一代测序常见问题及解决策略知识分享
一代测序常见问题及解决策略知识分享测序常见问题及解决策略一、PCR常见问题1.假阴性，不出现扩增条带PCR出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因：1）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有Taq酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。
2）酶：酶失活或反应时忘了加酶。
3）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
4）反应条件：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
5）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
常见原因有：1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
T-载体连接方案
T-载体连接全过程第一步：PCR扩增目的基因及纯化1. PCR反应体系：10×扩增缓冲液 5.0ul10mMdNTP 1.0ul引物1 1.0ul引物2 1.0 ul模板DNA 1.0ulTaq DNA聚合 1.0ul加双蒸水至50ul（相同的引物体系可配置PCR MIX体系）2. PCR反应条件：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
95℃ 5min95℃ 45s40～60℃ 50s 循环 35次72℃ 55s72℃ 10min3. PCR期间配置琼脂糖凝胶：PCR结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。
4. PCR产物回收（1）单一PCR产物用氯仿法●把PCR产物转移至1.5ml的离心管，加500ul无菌水，500ul氯仿异戊醇（24:1）,混匀后10000rpm离心5-10分钟●转移上清（约400ul）至灭菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入2倍体积（780 µL体积即可）的无水乙醇与40ul3MNaAc。
置冰上或-80℃冰箱30分钟以上。
●10000 rpm离心10 min。
弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，于纸上扣干。
小心不要将沉淀洗掉。
●置于恒温器上干燥（55℃）至无色透明或无乙醇气味，大至要5~10min。
●加入40 µL 无菌水溶解沉淀备用。
（2）多条带PCR产物用切胶回收试剂盒。
●PCR产物进行琼脂糖电泳（大容量上样系统）●切胶并回收目的条带至1.5ml的离心管，称重。
●参照试剂盒说明书进行操作（附录3）。
●用50ul无菌水洗脱离心柱2次备用。
第二步：T-载体连接和转化准备工作：制备感受态细胞，方法见附录一，LB培养基，Amp母液，氯化钙的配制，方法见附录二；1.在微量离心管（PCR管）中配制以下体系：注：T-载体试剂盒开封前要向pMD18-T Vector 管中加入25 ul 无菌水，同时再管上面做标记。
pMD18-T Vector 1.0 ul外源DNA 1.5 ulSolutionI 2.5 ul2.16℃或4℃低温连接1h-2h（最好过夜）；3. 连接产物全量加入50 ul 的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后冰上放置30min；DH5α感受态细胞加5 ul 0.1M的无菌氯化钙做阴性对照；4. 热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。
pcr产物连接t载体
pcr产物连接t载体PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可在体外迅速扩增特定DNA片段。
常见的应用之一是将PCR产物连接到T载体上，以便进一步研究和分析。
本文将介绍PCR产物连接T载体的步骤和注意事项。
一、材料准备1. PCR产物：经PCR扩增得到的目标DNA片段。
2. T载体：一种载体，其末端具有“T”碱基（胸腺嘧啶）的一对互补序列，可与PCR产物进行连接。
3. T4 DNA连接酶：用于催化连接反应的酶。
二、PCR产物连接T载体步骤1. 酶切T载体：将T载体进行线性化，以便与PCR产物进行连接。
按照酶切酶厂商提供的酶切条件，在适当的缓冲液中进行酶切反应。
2. 纯化线性化的T载体：通过凝胶电泳等方法纯化线性化的T载体，以去除酶切剂和副产物。
3. PCR产物末端处理：将PCR产物进行末端处理，以便与T载体连接。
这一步骤通常使用多聚核苷酸添入酶（如T4 DNA聚合酶）对PCR产物末端进行A尾化处理。
4. T载体与PCR产物连接：将线性化的T载体与末端处理后的PCR产物进行连接，通常在适当的缓冲液中，加入T4 DNA连接酶，进行连接反应。
5. 进一步处理：将连接反应混合液经过适当的热处理或其他方法，以便降低非特异性连接和副产物的生成。
6. 转化大肠杆菌：将连接后的混合物转化到大肠杆菌中，通过培养和筛选，获得含有PCR产物的重组质粒。
三、注意事项1. 杂交温度：连接反应中的杂交温度需根据T载体末端的“T”碱基特性来确定。
一般而言，约为55-65°C。
2. 酶切反应时间：酶切T载体的时间需根据酶切剂的推荐时间来确定，过长或过短的酶切时间都会影响连接效率。
3. 转化菌株的选择：应选择适合的大肠杆菌菌株进行转化，以获得较高的转化效率和选择性。
4. 正负对照：在进行PCR产物连接T载体时，可以设置正负对照实验，以确保连接结果的准确性。
总结：PCR产物连接T载体是一种常用的分子生物学技术，它为后续的DNA克隆和遗传工程研究提供了重要的工具和平台。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计［整理］:最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG,这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3, bamhl, ecorl等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
pGEM-T中文说明书
20 个反应
包括：
1.2µg
pGEM®-T Easy 载体(50ng/µl)
12µl
插入 DNA 对照（4ng/µl）
100 U 200µl
II. 载体图谱……………………………………………………………………………….. 3 III. 产品组分…………………………………………………………………………….. 6 IV. 采用 pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体和 2×快速连接缓冲液进行连接………. 7
A. 操作步骤………………………………………………………………………… 7 V. 采用 pGEM®-T 和 pGEM®-T Easy 载体的连接反应产物的转化………………... 7 VI. 注意事项…………………………….………………………………………………. 8
产品
包装
pGEM®-T 载体系统Ⅰ
20 个反应
包括：
1.2µg
pGEM®-T 载体(50ng/µl)
12µl
插入 DNA 对照（4ng/µl）
100 U 200µl
1
T4 DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶的 2×快速连接缓冲液 操作手册
目录号 A3600
产品
包装
pGEM®-T 载体系统Ⅱ
20 个反应
注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册 TM042。如遇到问题请与 Promega 公司北京
办事处联系，TEL: 010-68498287；E-mail: techserv@
技术手册号码：CTM042
第 5 页 共 23页
III．产品组成
1 10－128 139－158
141 176－197
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助!
总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！Q:测序结果中为什么找不到引物序列?A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到；找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物的序列无法找到；测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相反的，这时就要反向互补查找引物；测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所以就找不到引物了；存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。
Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了?A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。
Q:哪些引物不适合作为测序引物?A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果；②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合；③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。
另外，较长的引物纯度也将难以保证。
通常用于测序的引物纯度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果；④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。
我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。
M5HiPerpTOPO-TACloningKit使用说明书
M5 HiPer pTOPO-TACloning Kit使用说明书产品名称单位货号M5 Hiper pTOPO-TA Cloning Kit 20T MF019-01M5 Hiper pTOPO-TA Cloning Kit 4×20T MF019-04【储存条件】长期保存，请置于-20˚C，有效期12个月。
使用后请及时放入-20˚C保存以保证酶的活性。
【产品简介】本制品和传统的T4连接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬间（几秒钟-几分钟）、高效（接近100%）连接DNA片段的原理采用本公司独创的工艺制成。
【产品特点】1. 可以在瞬间（几秒钟-几分钟）完成连接。
2. 无需冰浴和热休克，室温5分钟内完成转化；无需1小时复苏，只需37˚C 10分钟复苏便可以涂板。
从连接到涂板只需15-20分钟。
3. 无自连、零背景，无需繁琐蓝白斑筛选，见到长出的克隆便是有插入的（接近100%）。
4. 可以连接长达10kb片段。
5. 测序可以采用M13F/M13R通用引物测序（见后面图谱）【产品组份】20T 4×20TM5 HiPer pTOPO-TA Vector(30ng/µl) 20µl 80µl1000bp Control（30ng/µl）5µl 5µl10x Enhancer 20µl 80µl【操作步骤】1. 连接反应的准备：<注意：PCR引物不能磷酸化>。
使用能在PCR产物末端加一个突出的3’-A的酶系列扩增（如Taq、T aqHiFi、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA Polymerase）。
PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行连接反应，无需纯化；如果有非特异扩增，建议胶回收纯化（货号：MF029)。
如果是以质粒为模板的PCR产物，也必须进行切胶纯化，因为模板质粒也可能长出菌落（但不是想构建的目的载体）。
引物找周边序列及引物扩增目的序列
一、一个引物找周边序列1.进NCBI BLAST模式2.粘贴相关序列blast后（例如水稻内源基因引物GGAAAGCCGATGGCATCAG）3.出现相关序列4.找到下方alignment，也就是5.选择合适的物种，点击graphics，得到下面图形最下方的序列为我们输进去的序列，上面两条黑色的链条是与其匹配的DNA双链，点击并按住鼠标可左右移动该双链，点击右键可以下载（FASTA格式为单纯序列格式），下载的序列片段长度为网页所显示的长度，如果想扩大范围，可以点击移动双链序列上方的（-+）按钮。
二、一对引物找扩增序列（电子PCR）以水稻内源基因引物为例:上游外引物F3-2: GGAAAGCCGATGGCATCAG下游外引物B3-2: TCTCCATTGTCCTCCTCTGC（反向互补GCAGAGGAGGACAATGGAGA）进NCBI BLAST页面，找到下面的特殊blast中的primer-blast点开primer-blast页面，A.输入自己的引物B.选择数据库database（如Mrna,或genomes）C.输入物种(范围可大可小，如plant植物)D.点，就可以出结果。
E.点击合适物种链接如，得全基因图；F. 也可以继续点击graphics，得下图（点击-+按键调节显示序列，点击并按住可以拖动双链至合适位置（D上显示1750-1928为目的序列）：G.在双链上点击右键，选save，选fasta，然后保存到电脑，此.fa文件可以用IE打开，得到下列目的序列>gi|115468835|ref|NM_001064552.1|:1741-1966 Oryza sativa Japonica Group Os06g0604400 (Os06g0604400) mRNA, complete cdsCATTTGCAT GGAAAGCCGATGGCATCAG ACCAGAAGACATTGAGGCGTTGCATCTGATTCCCAGAGAGA TTTCTCTGAAGATTGTGAACAAGATTGAAGCTGGTGAGCGTTTTGCAGTCTATGTTGTGCTGCCAATGT GGCCTGAAGGACCTCCTGCTAGTGGATCAGTGCAGGCAATACTGGATTG GCAGAGGAGGACAATGGAGA TGATGTACTATGATATTGC3.水稻内源基因LAMP扩增片段及引物水稻内源基因引物2:上游外引物F3-2: GGAAAGCCGATGGCATCAG下游外引物B3-2: TCTCCATTGTCCTCCTCTGC上游内引物FIP-2：GCAAAACGCTCACCAGCTTCAA（反向互补TTGAAGCTGGTGAGCGTTTTGC） -GACATTGAGGCGTTGCATCT下游内引物BIP-2：ATGTTGTGCTGCCAATGTGGC-CCAGTATTGCCTGCACTGAT（反向互补ATCAGTGCAGGCAATACTGG）内源基因内源基因扩增序列如下：CATTTGCAT GGAAAGCCGATGGCATCAG ACCAGAA GACATTGAGGCGTTGCATCT GATTCCCAGAGAGA TTTCTCTGAAGATTGTGAACAAGA TTGAAGCTGGTGAGCGTTTTGC AGTCT ATGTTGTGCTGCCAATGT GGC CTGAAGGACCTCCTGCTAGTGG ATCAGTGCAGGCAATACTGG ATTG GCAGAGGAGGACAATGGAGA TGATGTACTATGATATTGC。