简并引物列表
用CODEHOP设计简并引物克隆反刍月形单胞菌K6乙酸激酶基因片段
1 材料与方法
1. 1 菌株及培养液 反刍月形单胞菌 K6 由本课 题组从健康奶牛瘤胃中分离得到 。
培养液 :胰酶解酪蛋白 5. 0 g ,蛋白胨 5. 0 g ,酵 母提取物 10. 0 g ,牛肉浸膏 5. 0 g ,葡萄糖 5. 0 g , K2 H PO4 2. 0 g ,刃天青 1. 0 mg ,盐溶液 40 mL ,双馏 水 950 mL ,通入 N2 和 CO2 后煮沸 ,冷却后加入氯 化血红素溶液 10 mL ,维生素 K1 溶液 0. 2 mL , L2 半胱氨酸 0. 5 g ,调 p H 值至 7. 0 ,在 N2 条件下分 装 ,高压灭菌 。 1. 2 工具酶与生化试剂 Ex Taq 聚合酶 ( 5 U/ μL) ,DNA Marker ,dN TPs (2. 5 mmol/ L ) 均购自宝 生物工程 (大连) 公司 ; 总 DNA 提取试剂盒 、DNA 回收纯化试剂盒均购于杭州维特洁生物技术公司 ; 氯化血红素 、维生素 K 等购自 Sigma 公司 ,蛋白胨 、 酵母提取物购自 Oxoid 公司 。p MD182T 载体购自 宝生物工程 (大连) 有限公司 。 1. 3 主要数据库与软件 NCB I ( ht tp :/ / www . ncbi. nlm. nih. gov/ ) 、U nip rot 蛋白质序列查询数据 库 ( ht tp :/ / www . unip rot . org/ ) 、Blockemaker ( ht2 tp :/ / blocks. f hcrc. o rg/ blocks/ make_ blocks. ht2 ml ) 、Co de Hop ( ht tp :/ / blocks. f hcrc. org / blocks/ codehop . ht ml) 、M E GA 4. 0 。用 COD E HO P 检索 乙酸激酶简并引物时 ,检索主要设定参数为 “: Max2 imum core degeneracy :128 , Target clamp tempera2 t ure :60 ℃,codo n usage table :Bacillus subtilis”。 1. 4 序列比较 K6 的 16S rDNA 序列为本研究室 提交 ( GenBank 数据库上的登陆号为 DQ079866. 1) , 利用对 K6 16S rDNA 序列在 GenBank 中进行检索 同 源 rDNA 序 列 , 应 用 M E GA 软 件 中 Boot 2 st rap
引物及简并引物2013.11.13
(4)再利用Oligo6.0进行引物自身的分析:引物自身 有无发夹结构;引物之间有无引物二聚体;引物的 Tm值丌宜过高,且两条引物的Tm值丌要相差5e以 上。
(5) 2条引物间的距离以500~800bp之间为宜,有利于 提高PCR反应的特异性。
常用软件
• Primer Premier 5.0 • Oligo 6.22 • DNAClub • Dnasis • Dnastar • DNAMAN 等
密码子表
简并引物
• 简并引物是指用来编码一段短肽序列的 丌同碱基序列的混合物。 • 主要用来同源克隆未知的基因，或用来 分析某一种基因多态性的一种方法。
• 4、简并引物的筛选 (1)根据引物设计的普遍原则和 Target clamp temper-ature值,先筛选出一些分值较高的引物。
(2)看引物在氨基酸保守区内的位置,确保其简并度 低。 (3)再以其中1条鱼的mRNA序列为模板,利用 DNAMAN看引物在模板中的位置,确定它不模板 mRNA的匹配性,匹配度越高越好。
引物设计原则
• 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27bp，但丌应 大于38 • 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3‘端相似 性较高的序列，否则容易导致错配。 • 引物3’ 端避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC ，会使错误引发机率增加。
• 引物3’端的末位碱基应当避免在引物的3’端使用碱基A 。
简并核苷酸
•R=A/G，Y=C /，M=A/C， K=G/T，S=C/G，W=A/T， H=A/C/T，B=C/G/T， V=A/C/G D=A/G /T， N=A/C/G/T
设计步骤
• 1、利用NCBI搜索丌同物种中同一目的基因的蛋白 或cDNA编码的氨基酸序列。首先找到一种蛋白。 随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白) ，在整个Nr数据库中中查找不之相似的氨基酸序 列。 • 2、对所找到的序列进行多序列比对，确定合适的 保守区域。利用BlockMaker • 3、利用CODEHOP设计引物，从Block Maker Results网页直接登录CODEHOP数据库进行引物 设计。
通用引物列表
序列(5'-3') CAG GAA ACA GCT ATG ACC TGT AAA ACG ACG GCC AGT
M13F(-47) CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC M13R(-48) AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96) SP6 CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG ATT TAG GTG ACA CTA TAG
TAT GGC TGA TTA TGA TCA GT AAG AAG GGC AGC ATT CAA AG ATG GAC TAT CAT ATG CTT ACC GTA AGG CGA TTA AGT TGG GTA GAG TTA GCT CAC TCA TTA GGC GAA CGC CAG CAC ATG GAC CTC CGA GAT CTG GAC GAG C GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC GTT CTG AGG TCA TTA CTG G TGA GCG GAT AAC AAT TTC AC TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC TGA AGC GCA TGA ACT CCT TG
T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG T7 terminator TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG T3 pGEX-4T5' pGEX-4T3' GLp1 GLp2 RVp3 RVp4 pcDNA3.1 R PinPoint primer pCMV-F ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG TGT ATC TTA TGG TAC TGT AAC TG CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC GAC GAT AGT CAT GCC CCG CG TAG AAG GCA CAG TCG AGG CGT GAC GCG GTG CAG GGC G TCT AAA AGC TGC GGA ATT GT
优化简并引物 PCR 克隆 Candida glycerinogenes 磷酸甘 …
第27卷第4期2008年7月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology Vol.27 No.4J ul. 2008 文章编号:167321689(2008)0420091206 收稿日期:2007210225. 基金项目:国家自然科学基金项目(30570142).作者简介:陈献忠(19802),男,安徽界首人,工业微生物博士研究生.3通讯作者:诸葛健(19392),男,浙江金华人,教授,博士生导师,主要从事发酵工程和工业微生物学方面的研究.Email :jianzhuge @优化简并引物PCR 克隆Can di da gl yceri nogenes32磷酸甘油脱氢酶基因片段陈献忠, 饶志明, 沈微, 诸葛斌, 方慧英, 王正祥, 诸葛健3(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122)摘 要:为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Can di da gl yceri nogenes )克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD +232磷酸甘油脱氢酶基因(ct GPD ),对不同酵母和其他真核生物的NAD +232磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.gl yceri nogenes 的NAD +232磷酸甘油脱氢酶(GPD )基因片段,经过优化PCR 反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出Cg GPD 基因中约600bp 的保守核心片段。
DNA 序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD +232磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPD 基因相似性较高。
关键词:PCR ;NAD +依赖32磷酸甘油脱氢酶;产甘油假丝酵母;克隆;简并引物中图分类号:Q 785文献标识码:ACloning of NAD +2Dependent G lycerol 32Phosphate DehydrogenaseG ene Fragment from Ca ndida gl yceri nogenes withDegenerate Oligonucleoide PrimersC H EN Xian 2Zhong , RAO Zhi 2Ming , SH EN Wei , ZHU GE Bin ,FAN G Hui 2Y ing , WAN G Zheng 2Xiang , ZHU GE Jian 3(Key Lab of Industrial Biotechnology ,Ministry of Education ,Jiangnan University ,Wuxi 214122,China )Abstract :In S accharom yces cerevisi ae ,glycerol is synt hesized in cytosol by reduction of t he glycolytic intermediate dihydroxyacetone p ho sp hate (D HA P )to glycerol 32p hosp hate (G3P )followed by dep hosp horylation of G3P to glycerol.Furt her st udies had revealed t hat cytol NAD +2dependent glycerol 32p ho sp hate dehydrogenase (ct GPD )is t he rate 2limiting enzymes for glycerol synt hesis.However ,it is unclear whet herGPD has similar role in Candi dagl yceri nogenes WL200225,a novel o smotolerant yeast species used in glycerol p roduction.So ,itis essential to clone GPD gene from C.gl yceri nogenes ,for investigation of glycerol bio synt hesis in molecular level.After comparison of t he amino acid sequence of t he GPD H p roteins in several species ,degenerate oligonucleoide p rimers were designed for PCR based on conservative regions in t he amino acid sequence.PCR was performed on t he genomic DNA of C.gl yceri nogenes andparameters involved in amplification efficiency were optimized.U sing one moderate degeneracy pair of p rimers,a degenerate PCR p roduct of ca.0.6kb was amplified and sequenced.Which homologous to GPD1of S accharom yces cerevisi ae.This provides a t hreshold of st udying glycerol p roduction pat hway and osmotic st ress response mechanism at genetic and molecular level in t his yeast.K ey w ords:PCR;NAD+2dependent glycerol32p ho sp hate dehydrogeanse;Candi da gl yceri nogenes;clone;degenerate oligonucleoide primers 当细胞处于高渗透压环境中时,为了保持胞内的水分和小分子物质向环境中外泄,就需要通过自身合成一些生物相容性物质来提高胞内的渗透压来平衡胞内和胞外的压力差,从而起到保护和防御的作用。
简并引物设计方法与技巧
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 碱基互补
发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密 码子的简并性，引物3’端最后一个碱基 最好不与密码子第三个碱基配对。
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generaer 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性
常用引物序列
常用引物序列引言引物序列是指在分子生物学实验中用来特异性引导DNA或RNA复制和扩增的短链核酸序列。
常用的引物序列在科研和实验室工作中起着重要作用。
本文将介绍几种常用引物序列及其在实验中的应用。
1. 通用引物序列通用引物序列是指适用于多种物种的引物序列。
常见的通用引物序列包括16S rRNA引物序列用于细菌和古细菌的分析，18S rRNA引物序列用于真核生物的分析，以及ITS引物序列用于真菌的分析。
这些通用引物序列具有高度保守性，可以用于不同物种的物种鉴定和进化分析。
2. 物种特异引物序列物种特异引物序列是指只在特定物种中存在的引物序列。
这些引物序列通常用于物种鉴定和种群遗传分析。
例如，人类特异引物序列可以用于人类DNA的特异扩增，从而进行人类个体的鉴定。
物种特异引物序列的选择和设计需要根据目标物种的基因组序列进行。
3. 定量引物序列定量引物序列是指用于定量PCR实验的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以通过PCR扩增目标基因的特定片段，并通过实时荧光定量PCR技术进行定量分析。
定量引物序列的设计需要考虑引物的特异性和扩增效率，以确保准确的定量结果。
4. 荧光标记引物序列荧光标记引物序列是指在引物序列上加入荧光标记分子，用于检测和定量特定基因的表达水平。
常用的荧光标记引物序列包括荧光探针和荧光引物。
荧光标记引物序列可以通过荧光定量PCR或原位杂交等技术进行检测。
5. 反向引物序列反向引物序列是指用于反转录PCR实验的引物序列。
反转录PCR是一种将RNA转录成cDNA的技术，常用于研究基因的表达调控和mRNA的定量分析。
反向引物序列通常与反向转录酶结合，将RNA逆转录成cDNA，并通过PCR扩增特定基因的cDNA片段。
6. 基因特异引物序列基因特异引物序列是指用于特定基因扩增的引物序列。
这些引物序列通常与目标基因的外显子区域相结合，可以选择性地扩增目标基因，从而进行基因型鉴定和基因表达分析。
常见载体引物表
无
pDSRED-PRESS-C1
pDSRED -C1-F
pDSRED-C1-R
pCR-Blunt
M13R
M13F/T7
pMT/V5-His_A (_B,_C)
MT-Profor
BGHrev
pEASY-T3
T7/M13F
SP6/M13R
PSILENCE-1.0-U6
T7
2.0REV(同P2(pCAMBIA 1301))
pMSCV
MSCV5'
MSCV-rev
pBABE
pBABE5’
pBABE3’
pFastBac HT_A (_B, _C)
pFastBac-F
pFastBac-R
pFastBac1
PH-Profor/BaculoVfor
pFastBac-R
pACYCDuet-1 (MCS I)
ACYCDuetUP 1
T7/S.tag
T7 Ter
pET-42a (-b, -c)(+)
Stag
T7 Ter
pET50(amp+)
T7/s.tag
T7TER
pET44(AMP+)
T7/s.tag
T7 Ter
pEYFP-N1
pEGFP-N-5’
pEGFP-N-3’
PETBlue
PETBlueT7UP(太靠前，在T7前)/ PETBlueUP
pLEXA-R
pCDH
pCDH-EF1
无
PVX
LBA
LBB
pAcGP67 (_A, _B, _C)
PH
pAcGP67rv
pAD-Track
实例图解简并引物设计
裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导 出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。
2. 引物设计
推荐先设计 3′端引物， 至于原因，上面的【特 别注意】中已提到，这 里不再赘述。 （1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则 及特别注意，在CP 基因 3' 端位置选取一段合适 的序列（ 784-803bp ）， 804bp 位置为A 且是第 三个密码子位置，所以 弃去末位的 A 碱基。
五、特别注意
5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大； 引物的延伸是从3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的最 关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考 虑以下几个内容： 1. 不要终止于密码子的第 3 位；
2. 末位碱基避免使用碱基 A； 3. 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；
（3）BLAST 比对回检
点击“Blast”可以对引物进行BLAST 比对检测，结果显 示，都是PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特 异性良好。
（4）两引物互补性检查
• 同 样 方 式 ， 得 到 5' 端 序 列 ： GSAAAYGAYACAATYGATGC ，根据引物设计原则， 需要检测两引物之间是否存在序列互补。 • 打 开 DNAMAN ， 依 次 在 “ Primer ” - “ Load primer ”，粘贴任意一端引物序列，如： 5' 端序列 GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。
通 过 Web Logo 生 成 的 多 重 比 对 图 片 可 以 很 直 观 得 到 3' 端 序 列 为 CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG ，查询简并碱基代码表（下图），可 知 C/T/G=B ， G/A=R ， 简 并 度 =3 ×2 =6 ， 整 理 后 3′ 端 序 列 为 CTTGGAGTBAARAACATGTG ， 故 而 需 要 合 成 的 3′ 端 引 物 序 列 ： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。