实例图解简并引物设计
干货：引物设计有妙招，有图有真相
干货：引物设计有妙招，有图有真相PCR现在已经成为分子实验室的标配，无论是基因检测、基因定量、分子克隆、组装、突变、测序等等，都离不开PCR技术。
在PCR 过程中，引物设计是非常重要的一环，特别是qPCR的引物设计，决定了我们扩增效率是否达标和扩增产物是否特异。
今天小编为大家举个例子，设计一对qPCR引物。
qPCR引物设计，通常要留意以下几点：GC含量50%-60%Tm值50℃-65℃上下游引物尽量接近引物末端最好是G或C避开二级结构复杂区域引物尽量在目的基因的3’ 端引物尽量跨越内含子目的基因是否有不同的剪切变体……这么多要注意的怎么办？！Primer-blast相信很多小伙伴们都用过，只要输入序列设置条件就可以设计得到理想的引物序列了。
但是很多情况下，我们的要求往往不仅于此。
下面，我们以人的EGFP （Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！1. 查询基因结构之前小编已经为大家介绍了如何利用NCBI查询基因结构了（错过了可以戳这里），首先查询Homo EGFP的基因结构：2. 确定设计引物位置可以看到，这个基因有多种不同的转录本，而前8个外显子区域是完全一致的（绿色小竖线）。
我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，那将反向引物设在第8个外显子之前就可以实现了。
3. 找到mRNA的序列号，进入GenBank在该页面里继续往下拉，找到mRNA和蛋白质的GenBank序列号。
点击mRNA的序列号，进入GenBank。
借助Highlight Sequence Features，我们可以快速确定第8个外显子的位置。
4. 确定下游引物设计位置点击Highlight Sequence Features后，浏览器的下方就会出现选项，选择查看Exon，找到第8个外显子，这样就能快速定位了。
我们确定了第8个外显子到下游至1236bp为止。
如何根据要求自己设计PCR引物
如何根据要求自己设计PCR引物1PCR引物设计课堂笔记○PCR这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？今天我就来给大家用实例演示一下哈。
首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物设计是PCR的关键，附上PCR的基本流程图：○引物设计的原则：1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。
退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高；引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。
因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物：2用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1○简单点说，就是现在我们要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点，也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段，这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid 1中，然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的，示意图见下。
实例图解简并引物设计 共25页
碱M
基B
代 码
D N
碱基 代码 A, G Y G, T S A, C W G, C, T V A, G, T H A, G, C, T
碱基 C, T G, C A, T A, G, C A, C, T
3. 质量评估
•（1）参数评估
将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、
烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
八、详细图解
1. 序列准备： •（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； •（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； •（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
• 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输 入 CP 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8391 ） 后 回 车 。 接 着 点 击 “Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift” 不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除 冗余序列。
• PS ： 是 否 位 于 密
码子的第3 位，可
以
通
过
“ Tranlated
简并引物设计方法与技巧
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二级结构
引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多 碱基互补
发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则 将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密 码子的简并性，引物3’端最后一个碱基 最好不与密码子第三个碱基配对。
引物设计原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
引物长度
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引 物，但最多不超过50个核苷酸。
– 生物软件网下载 – 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU
改为vspace=PU便可以使用全部功能。
Oligo primer 3 The Primer Generaer 5.0
引物设计
– 一般引物设计 – 5’带酶切位点引物设计 – 巢式PCR引物设计 – 多重PCR引物设计
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性
引物设计知识点归纳图解
引物设计知识点归纳图解引物设计是分子生物学和遗传学等研究领域中的重要工具，它在PCR扩增、基因克隆、基因表达分析等方面发挥着至关重要的作用。
在引物设计过程中，需要考虑引物的长度、碱基组成、熔解温度等因素，以确保引物的特异性和稳定性。
本文将围绕引物设计的基本原理、常用工具和实践技巧展开讨论，并通过图解的方式进行归纳总结。
一、引物设计的基本原理引物设计的目标是选择具有高特异性和稳定性的引物，以确保在PCR扩增等实验中的准确和可靠性。
其基本原理包括：1. 特异性：引物应与目标DNA序列的特定区域完全匹配，以避免非特异扩增。
2. 稳定性：引物应具有适当的长度和碱基组成，以确保引物在反应条件下的稳定性。
3. 熔解温度：引物的熔解温度应接近PCR扩增的反应温度，以保证引物的特异性。
二、引物设计的常用工具引物设计可以借助多种在线工具和软件来完成，常用工具包括：1. Primer3：一种广泛应用的引物设计工具，可以根据给定的参数自动设计引物，并进行热力学分析。
2. NCBI Primer-BLAST：结合NCBI数据库和BLAST算法的引物设计工具，用于检验引物的特异性。
3. OligoAnalyzer：根据序列特性进行引物设计和分析的在线工具，可以计算引物的熔解温度和配对特性。
三、引物设计的实践技巧在实践过程中，为了提高引物设计的准确性和效率，可以考虑以下技巧：1. 引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对，较短的引物具有更高的特异性。
2. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，高GC含量可以增强引物的熔解温度和特异性。
3. 引物间配对：引物之间或引物与模板之间的配对应避免，以防止引物间的二聚体形成或引物与模板的非特异结合。
4. 引物位置：引物应位于目标序列的特异区域，避免引物与非目标序列的交叉反应。
5. 引物设计的复杂性：复杂的引物设计场景，如多组引物设计、引物与探针联合设计等，可以借助专业软件进行。
简并引物设计过程及原则
简并引物设计过程及原则简并引物常用于从已知蛋白到相关核酸分子的研究及用于一组引物扩增一类分子。
简并引物设计过程（1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。
首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。
随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。
（2）对所有的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W/X, 也可在线分析。
所有序列的共有部分将会显示出来。
“*”表示保守，“：”表示次保守。
（3）确定合适的保守区域设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜，使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。
最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
（4）利用软件设计引物当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中Primer 5.0 支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/C/T, B=C/G/T,V=A/C/G, D=A/G/T, N=A/C/G/T, 该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt 区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。
primer5.0已知基因序列,设计引物
Primer5.0 目的基因序列引物设计
GA TTtCTTGGCTTtATA TA TCTTGT GGAaAGGaCGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCAC ATATACTAGTCGACGGGTCTAGACAA TGA TGCTGGGTAA TGACACCAAGCTGGGACTG GTACAGAAAGTCAGAGAACACTTACAGAACGGCA TCTAGACAATGA TGCTGGGTAATA CACTTACAGAACGGCA TCTAGA TGCCGTTCTGTAAGTGTTTGTTGAATGAATGAGTGTT GAACAAACTGCTAAGGTATCTTT ACAAGGTAG
从中扩增出目的基因片段（绿色的部分）：
首先：将绿色部分复制到primer5.0引物设计软件中，ctrl+v用鼠标右键不管用
.选择As is后，惦记OK出现：
然后惦记，出现
图中右上角标记，其中惦记S合成的是上游引物，A是下游引物，点击S后出现，然后点击出现
这些就是上游引物，选中后ctrl+c复制到引物合成单中，发给公司，下游引物：回到
点击A出现
用前后调节框，如下，将序列向右移动移到最后，得到下图
注意显示的是3—5，ctrl+c—ctrl+v后悔发现序列变成5---3了，这是软件的好处，因为公司引物合成就是从5—3的
其实上下游引物只是相对的，将得到的引物序列填表后发给公司就好了。
引物设计实例分析(多图)
引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm值（melting temperature）G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对。
3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。
如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。
Tm=2（A+T）+4（C+G）4. 引物的GC含量有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第一步：扩增GFP基本序列第二步：GC比值；Tm值第三步：酶切位点第四步：阅读框第五步保护序列Primer1: 5' GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5' GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCA TGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。
愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。
后来PCR成为实验最基本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方。
PCR的第一步就是引物设计了。
引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。
这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。
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3. 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集
区容易导致错误引发反应。
3
五、特别注意
5′端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大； 引物的延伸是从3′端开始的，所以 3′端引物是影响特异性扩增的 最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要 综合考虑以下几个内容：
二、相关工具
1. MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑；
2. DNAMAN8-检测两引物的互补性；
3. Oligo Calc-评估引物的属性；
2
4. Web Logo 3-直观显示简并碱基。
三、基本原则
设计一对好的引物，归结起来就是 5′端引物、3′端引物之间 以及两者与模板的关系处理得恰到好处：
参数设置： “Output format”（输出格
式）推荐用“PDF”，“Color scheme”
（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，
设 置 完 毕 ， 点 击 右 下 角 “ Create
Logo“即可得下图的Seq
Logo
格式文件。 12
到
3'
端
序
列Hale Waihona Puke 为CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG ， 查 询 简
•（2）自身互补性（Check Self-Complementarity）
点击“Check Self-Complementarity”，检测引物自身 互补性，主要查看“Potential hairpin formation”、 “ 3’ Complementarity ” 、 “ All potential selfannealing sites are marked in red (allowing 1 mismatch)”下方显示内容，如果三项均为“none”，则说 明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引
马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、
烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广 泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特 异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。 但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生， 单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求， 需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。
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• PS ： 是 否 位 于 密
码子的第3 位，可
以
通
过
“
Tranlated
Protein
Sequences ” -
“
DNA
sequences”切换
查看，如右图，
CP 基 因 的 末 端 3
个碱基是终止密码
子所在的位置，A
是第三位密码子。
11
（2）生成 Seq Logo
选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序 列，保留CP 基因3‘端序列，同样导出为 Fasta文件，将序列粘贴入Web Logo3的 文本框内或直接上传序列文件，设置相关 参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格 式的文件CP-3.fas。
1. 不要终止于密码子的第 3 位；
2. 末位碱基避免使用碱基 A；
3. 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG；
4. ΔG 的绝对值不可超过 9；
5. 与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8 个互补碱基 源；
6. 不能进行任何修饰。
4
六、设计流程
5
七、示例背景
1
实例图解简并引物设计
一、序言
设计一对合适的引物是PCR 扩 增目的基因成功的关键 ，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成， 却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个 关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的 引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病 毒CP 基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引 玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指 正。
• 裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment” 导出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。
9
2. 引物设计
推 荐 先 设 计 3′ 端 引 物 ， 至于原因，上面的【特 别注意】中已提到，这 里不再赘述。
（1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则 及特别注意，在CP 基因 3' 端 位 置 选 取 一 段 合 适 的 序 列 （ 784-803bp ） ， 804bp 位置为A 且是第 三个密码子位置，所以 弃去末位的 A 碱基。
6
八、详细图解
1. 序列准备： •（1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； •（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重序列比对； •（3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：
7
• 先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输 入 CP 基 因 上 游 分 界 点 位 置 （ 8391 ） 后 回 车 。 接 着 点 击 “Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift” 不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删8 除 冗余序列。
并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，
简 并 度 =3 ×2 =6 ， 整 理 后 3′ 端 序 列 为
CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要合成的3′
端引物序列： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与
原序列是反向互补关系）。
简 并 碱
代码 R K
碱基 A, G G, T
1. 两引物的序列要与模板的序列紧密互补；
2. 两引物不能在模板的非目的位点发生错配；
3. 两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。
四、延伸原则
1. 引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否 则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应；
2. GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的 GC 含量相差不能过于悬殊；
代码 Y S
碱基 C, T G, C
基M
A, C W
A, T
代B
G, C, T V
A, G, C
13
码D
A, G, T H
A, C, T
3. 质量评估
•（1）参数评估
将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内， 按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长 度、GC 含量、Tm 值等信息。