分子生物学--引物设计
microRNA引物设计原则
microRNA引物设计原则引物设计是分子生物学研究中的重要环节，尤其对于微小RNA （microRNA）的研究更是至关重要。
本文将介绍一些关于微小RNA引物设计的原则，以确保实验的准确性和稳定性。
1.引物长度和GC含量：对于微小RNA的引物设计，一般需要选择长度为18-25个核苷酸的序列。
长度过短可能导致引物的特异性不足，而长度过长则会降低引物的亲和力。
此外，引物中的GC含量应适中，通常在40-60%之间，以确保引物的稳定性和特异性。
2.引物的特异性：微小RNA的研究中，引物的特异性非常关键。
为了确保引物只能与目标微小RNA序列结合，并能排除与其他相关RNA的结合，可以利用一些在线工具或软件进行引物特异性分析。
例如，可以使用BLAST（基本局部序列比对工具）来检查引物与其他RNA序列的匹配程度，以确保引物的特异性。
3.引物的稳定性：引物的稳定性也是设计过程中需要考虑的因素。
稳定的引物能够在实验条件下保持其结构和亲和力，从而更好地进行相应的分析。
为了提高引物的稳定性，一般推荐使用纯化的合成DNA或RNA，而避免使用未纯化的引物。
4.引物的结构和碱基互补性：引物的结构和碱基互补性对于实验结果也具有重要影响。
在引物设计中，应避免引物之间的内部、3'或5'端之间的碱基互补性，以免形成二聚体或其他非特异性结合。
此外，还要避免引物中的结构性或碱基偶极性，以免影响引物与目标微小RNA的结合。
5.引物的剪切和扩增效率：在引物设计中，需要考虑引物的剪切和扩增效率。
对于剪切效率，引物的末端序列应选择具有较高的选择性和剪切效率，以确保能够准确地将目标微小RNA分离出来。
而对于扩增效率，引物的选择性和特异性对于PCR反应的稳定性和扩增效率有重要影响。
综上所述，微小RNA引物设计需要考虑引物长度、GC含量、特异性、稳定性以及结构和碱基互补性等因素。
正确的引物设计能够提高实验的准确性和稳定性，进而促进微小RNA的研究和应用。
cut run的qpcr引物设计规则
cut run的qpcr引物设计规则引物设计在分子生物学实验中起着至关重要的作用，特别是在定量PCR实验中。
cut run是一种新近发展的染色质免疫共沉淀技术，其原理是通过特异性抗体识别靶标蛋白，并利用酶切作用将其与染色质分离，然后使用qPCR来定量分析目标基因的丰度。
在cut run实验中，引物的设计是确保实验成功的关键。
在进行cut run实验前，需要确定目标基因的序列。
这可以通过数据库查询或测序技术来获取。
在得到目标基因序列后，可以使用一些在线工具或软件来设计引物。
例如，Primer3是一种常用的引物设计软件，它可以根据一系列参数，如引物长度、GC含量、Tm值等，自动生成合适的引物序列。
在cut run实验中，引物设计需要遵循一些规则和原则。
首先，引物的长度通常在18-25个碱基对之间，这样可以提高引物的特异性和扩增效率。
此外，引物的GC含量应在40-60%之间，以确保引物在反应温度下具有适当的稳定性。
同时，引物的Tm值应在50-65℃之间，以确保在PCR反应中引物的特异性和扩增效率。
在设计引物时，还需要考虑引物的特异性。
特异性引物能够准确识别目标基因，而不会与其他非靶标序列发生非特异性扩增。
为了确保引物的特异性，可以使用一些在线工具或软件来进行引物序列的BLAST比对，以确保引物只与目标基因序列匹配。
引物的设计还需要考虑引物之间的配对效率。
在cut run实验中，通常需要使用两对引物，一个用于目标基因的扩增，另一个用作内参基因。
内参基因的选择应该是稳定表达且不受实验条件影响的基因。
例如，常用的内参基因有GAPDH、β-actin等。
两对引物的设计应该遵循一致的规则，并且要确保引物的Tm值相近，以确保它们在同一温度下扩增。
在实验中，引物的质量也是非常重要的。
为了确保引物的质量，可以选择可靠的供应商，并避免使用旧的或不合适的引物。
此外，引物的储存也需要注意，应该存放在干燥、避光和低温的环境中，避免引物的降解和污染。
引物设计的详细步骤
引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。
引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。
选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。
GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。
避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。
可以使用软件工具检查引物的这种可能性。
避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。
选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。
此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。
使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。
这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。
实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。
引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。
请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。
简述引物设计流程及结果
简述引物设计流程及结果英文回答：Primer design is a crucial step in many molecular biology experiments, including PCR, qPCR, and DNA sequencing. It involves designing short DNA sequences, known as primers, that specifically bind to the target DNA region and initiate DNA synthesis. The primer design process typically consists of several steps, including target sequence identification, primer design software selection, primer design parameters setting, primer specificity checking, and primer optimization.The first step in primer design is to identify the target DNA sequence that needs to be amplified or analyzed. This could be a specific gene or a region of interest in the genome. Once the target sequence is identified, the next step is to select a primer design software. There are several software tools available, such as Primer3, OligoAnalyzer, and NCBI Primer-BLAST, which can assist indesigning primers based on various parameters.After selecting the primer design software, the next step is to set the primer design parameters. These parameters include primer length, melting temperature (Tm), GC content, and potential secondary structures. The primer length is usually between 18-25 nucleotides, with 20 nucleotides being the most commonly used length. The Tm is the temperature at which half of the primers are bound to the target DNA sequence, and it is typically set to be around 55-65°C. The GC content is the percentage of guanine (G) and cytosine (C) bases in the primer sequence, and it is usually set to be around 40-60%. Potential secondary structures, such as hairpins or primer dimers, should also be avoided.Once the primer design parameters are set, the next step is to check the specificity of the primers. This can be done using the primer design software or by performing a BLAST search against the target DNA sequence. The primers should only bind to the intended target sequence and not to any other regions in the genome. This is important toensure accurate and specific amplification or analysis ofthe target DNA.After checking the specificity, the final step isprimer optimization. This involves adjusting the primer design parameters, such as the Tm and GC content, toimprove the efficiency and specificity of the primers. It may also involve designing multiple primer pairs andtesting them experimentally to determine the bestperforming primers.The result of the primer design process is a set of primers that are specific to the target DNA sequence and have optimal design parameters. These primers can then be used in various molecular biology experiments, such as PCR, qPCR, and DNA sequencing, to amplify or analyze the target DNA.中文回答：引物设计是许多分子生物学实验中的一个关键步骤，包括PCR、qPCR和DNA测序。
分子生物学实验技术-简并引物设计
Oligo 被认
为 是 引物 设计功能最 强大的软件， 特别是它的 Tm值预测 能力。
在线引物设计的站点
Primer3 Very popular primer design tool for designing primers for PCR, hybridization. Primerfinder Easy to use, free, online primer design program MethPrimer A free online program for designing primers for methylation specific PCR (MSP) and bisulfite sequencing PCR. Primo Primo online is a friendly PCR primer design tool. It reduces PCR noise by lowering the probability of random primering. Batch mode allows designing for multiple sequences. Users can also calculate the melting temperature using the nearest neighbor model.
分子生物学实验技术
化文平
一、引物设计的原则
1.引物长度(15-30bp) 典型的引物18bp到24bp。引物需要足够长，保证序列独 特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是 长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的 序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比 短序列杂交慢，从而降低了产量。 2.引物GC含量 选择GC含量为40％到60％,可使Tm值最好接近72℃。 3.引物5‘端 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定 性和引物同目的序列杂交的稳定性。
chip引物设计原则
chip引物设计原则引物设计原则是为了确保引物的准确性、可靠性和有效性而制定的一系列原则和方法。
引物设计在分子生物学和遗传学研究中起着至关重要的作用，特别是在PCR反应中，它们用于扩增目标DNA片段。
下面将详细介绍引物设计的原则。
1.特异性：引物应具有高度特异性，即只与目标序列结合，而不与其他无关序列结合。
这可以通过确保引物与其他基因组中的序列相互不匹配来实现。
在设计引物时，可以使用生物信息学工具进行比对，以确保引物只与目标序列匹配。
2.合适的长度：引物的长度应适中，通常在18到25个核苷酸之间。
太短的引物可能导致非特异性扩增，而太长的引物可能导致反应效率降低。
3.合适的GC含量：引物的GC含量应在40%到60%之间。
较高的GC含量可以提高引物的熔解温度，增加特异性，避免非特异性扩增。
4.避免反向互补和自身二聚体：引物中不应包含反向互补的序列，这样可以防止引物之间的结合而形成二聚体。
此外，引物序列中避免出现连续相同的核苷酸可以减少引物之间的相互结合。
5.避免非特异性扩增：通过在设计引物时进行生物信息学比对，可以避免引物与非目标序列相互匹配。
此外，可以选择在目标序列中设计多个引物，以增加特异性。
6.避免SNP影响：如果目标序列具有已知的SNP（单核苷酸多态性），在设计引物时应该避免SNP位点，以确保引物能准确地与目标序列结合。
7.引物熔解温度匹配：如果需要同时使用多对引物进行PCR反应，应确保各对引物的熔解温度相似，以确保反应的效率和特异性。
8.引物位置和方向：在设计引物时，应注意引物的位置和方向。
引物应选择在目标序列的保守区域，同时确保引物之间的距离适中，以获得最佳扩增效果。
9.引物纯度和以毛端作为一体：引物可通过合成或PCR方法制备，应使用经过高纯化的引物，以避免污染和其他非特异性扩增。
10. 引物浓度和使用量：引物的浓度和使用量应根据具体实验要求进行优化。
通常，使用2到10 pmol的引物浓度，使用比例相同的引物扩增目标序列。
PCR引物设计的原则及原因
PCR引物设计的原则及原因PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学实验的技术，常用于扩增特定DNA片段。
而PCR引物的设计是PCR反应的重要一步，它直接影响着PCR反应的成功与否。
因此，在PCR实验中，设计合适的引物是至关重要的。
引物的选择PCR反应的引物包括前向引物（forward primer）和反向引物（reverse primer）。
它们有以下几个选择的原则：1. 序列特异性引物的序列应与目标DNA片段的序列特异性高，以确保引物只能与目标片段配对。
这能避免非特异性扩增，减少假阳性结果的产生。
2. 引物长度引物长度通常在18到25个碱基对之间。
引物过短可能导致特异性下降，引物过长可能影响扩增效率，因此需要在合适的长度范围内选择引物。
3. 基序偏好在引物设计中，需要避免不稳定的结构，如大量的连续的GC或AT碱基对以及含有重复序列，以减少引物自身的结构问题。
4. 引物间的互补性前向引物和反向引物在设计时应避免互补性，以防止它们之间的结合而影响特异性扩增。
引物设计工具随着科技的进步，引物设计的许多在线工具和软件也被开发出来，以帮助研究人员更轻松地设计出合适的引物。
一些常用的引物设计工具包括Primer3、OligoAnalyzer、Primer-BLAST等。
引物设计策略在设计引物时，有一些常用的策略可以提高引物的成功率：1. 序列合成为了确保引物的纯度和质量，可以选择将引物进行合成，而不是使用商业引物。
这可以提高引物的特异性和稳定性。
2. 引物浓度在PCR反应中，引物浓度是一个关键因素。
合适的引物浓度可以保证PCR反应的准确性和灵敏度。
浓度过高或过低都可能影响PCR的结果。
3. 引物的优化如果PCR反应不成功，可以尝试优化引物的设计。
比如调整引物的碱基序列，修改引物的长度或浓度等。
通过不断的优化，可以提高PCR反应的成功率。
结论PCR引物的设计是PCR反应成功的关键之一。
通过选择合适的引物、遵循引物设计的原则以及利用设计工具和策略，可以提高PCR反应的特异性、灵敏度和准确性。
质粒测序引物设计
质粒测序引物设计
质粒测序是一种常用的分子生物学技术，用于分析质粒的基因组成和结构。
在质粒测序过程中，引物是至关重要的组成部分，其质量和设计直接影响到测序数据的准确性和可靠性。
因此，正确设计合适的引物至关重要。
设计引物的首要步骤是选择目标序列。
质粒测序通常需要分析全长或部分序列，因此需要确定目标序列的起止位置。
在选择目标序列时，还需要考虑序列的特点，如长度、GC含量和反向互补性等。
这些因素将影响引物的长度和特异性。
设计引物时，需要遵循一些基本原则。
首先，引物的长度应该在18-25个碱基对之间，以保证特异性和特异性。
其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物与目标序列的结合。
此外，还需要确保引物的特异性，以避免与其他序列的杂交信号。
引物设计时还需要考虑引物间的距离和方向。
引物之间的距离应该足够远，以避免重叠或杂交。
另外，正向和反向引物之间的距离应该相等，以确保扩增产物的长度均匀。
总之，正确设计引物对质粒测序的结果至关重要。
根据目标序列的特点，采用合适的引物设计策略和软件，可以设计出高质量的引物，从而获得更加准确和可靠的测序数据。
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PCR引物设计与分析摘要：本文简单的介绍了PCR技术以及PCR引物设计原则和技巧，并以一段序列为例，介绍两种引物设计软件的使用方法。
一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计；软件；1PCR聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。
聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。
PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
2引物设计原则及注意引物设计有3条基本原则：（1）引物与模板的序列要紧密互补；（2）引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；（3）引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。
具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度，产物长度，序列Tm值，引物与模板形成双链的内部稳定性，形成引物二聚体,及发夹结构的能值，在错配位点的引发效率，引物及产物的GC含量等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：(1) 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，会超过Taq酶的最适温度。
(2) 引物3’端的序列要比5’端重要。
引物3’端的碱基一般不用A，因为A 在错误引发位点的引发效率相对比较高。
另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
(3) 引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
(4) 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略的估计解链温度。
(5) ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。
一般情况下，引物的ΔG 值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且其绝对值不要超过9，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。
(6) 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。
(7) 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。
(8) 对引物的修饰。
引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。
利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
3引物设计现选取一段未知序列GGTTCCATCTGCCCGTCGGTACGGTAACAGGAAGCGGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACG GGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCG CATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGA TTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCA GCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT GGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCA GCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGC TAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAA AGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTG ATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG ATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCG TGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGT GCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGG TTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAA CGCGAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTTCAGAGATGAATATGTGCCTTCAGGAA CTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGGTTAAGTTCCCGC AACGAGCGCAACCCTAATCCCTAG并以此为例，简要说明引物设计的方法和思路。
3．1 使用Primer 5 软件搜索引物（1）打开primer 5 软件，操作file→new→DNA sequence 打开下列窗口，将所选基因序列复制在输入框中(选择As),在此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白（如下图）。
图1点击Primer进入引物设计窗口。
（2）在引物设计窗口可以连接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项（如图2）。
点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。
（如图3）图2图3A图3B（3）点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
现选取搜索得到的引物1，为例进行说明。
（如图 4）图 4（4）对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70 度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。
（5）在需要对引物进行修饰编辑时，如在5'端加入酶切位点，可点击Edit Primer，然后修改引物序列。
（如图5）图 5对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索功能弱于Primer5。
现阶段对于引物设计而言一般使用primer 进行引物搜索，然后用Oligo进行引物分析。
3.2 使用Oligo验证评估引物（1）在 Oligo 软件界面，File 菜单下，选择Open，定位到目的cDNA 序列（在primer 中，该序列已经被保存为Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为InternalStability（Delta G）窗口和Tm窗口。
在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。