基因工程菌的发酵
植酸酶基因工程菌的发酵研究
关键词 ： 酸酶 ； 酵 ； 植 发 植酸 酶基 因工 程菌
植 酸 酶 （ ｈ ｔ ｅ） 一 种 新 型 食 品 与 饲 料 添 加 剂 ， 能 １ ｏ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。 ｐ Ｙ ｓ 是 ａ 它 ｍ Ｌ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ．
催 化 植酸 （ ） 盐 水解 为肌 醇 及无 机磷 酸 ， 进微 量 元素 及 蛋 促
从 ０ ０ ５ ｏ ／ 的植 酸钠 溶 液 中释 放 １ ｍ Ｌ 机 磷 所 需 的酶 ． ０ １ｍ Ｌ Ｌ ｎ ｏ 无
Ｙ Ｄ种子液 ： ％ 母提取物 ； ％蛋 白胨 ； ％葡萄糖 。 Ｐ １酵 ２ ２
增 殖 培养 基 ： 母 提 取 物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨 ２ ｇ Ｌ 酵 母 量 为 一 个 酶 活 单 位 。 酵 ０ ／， ０ ／， 氮 源 （Ｎ ） ３ ４ ｇ Ｌ 生 物 素 ０ ４ ｇ Ｌ 甘 油 ｌ Ｌ Ｌ ０ １ １４ 植酸酶基 因工程菌摇瓶发酵产酶条件 的研究 Ｙ Ｂ １． ／ ， ． ｍ ／ ， ０ ｍ ／ ， ． ．
ｍ ０ ０ ７ ｍ ｌ Ｌ Ｌ ． ０ ６ ｏ ／ 植酸 钠溶 液 ）在 分 光 光 度 计 上 测 Ｏ ４ ５ ｍ ， Ｄ １ｎ
１
材 料 与 方 法
植 酸 酶 基 因工 程 菌 Ｅ ２ ， 本 实 验 室 构 建 。 一 ２为
１ １ 供试菌株 ．
１２ 培养基及试剂配制 ．
琼 脂 。
ｍ ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ． ｏｌ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。
种子活化与种子液的制备 ： 将实验室保存的植酸酶基因工
诱导培养基 ： 酵母提取物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨２ ｇ Ｌ 酵母 程 菌Ｅ ２ 划线于Ｙ Ｄ ０ ／， ０ ／， 一２ Ｐ 培养基平板上 ，８ ℃～３ ℃温箱 中培养 ， ２ ０
核黄素基因工程菌的构建及其发酵的初步研究
文章编号 ：１０ －０ ５２ ０）２０ ５ －５ ０ ３９ １（０ ７０ －３ ６０
核 黄素基 因工程菌的构建及其发酵的初步研 究
陈 涛， 董文明， 李晓静， 武秋立， 陈 天津 ３ ０７ ） ００ ２
摘
要： 构建整合型核黄素质粒 ｐ Ｂ ３ Ｒ ６ ，该质粒含有解调的Ｂ ｕ ｔ￣ ． ｂ ｌ 核黄素操纵子 ， ｓ ｉ 将其转化）Ｂｓ ｂ ｌ Ｈ１并在染 ｋ ． ｔ￣Ｒ ３ ｕｉ
色体上进行适 当的扩增后得 到 Ｒ ３： Ｒ ６ ］ Ｈ１ ： Ｂ ３ 系列工程菌 ，其核黄素合成能力随着 ｐ Ｂ ３ 扩增程度 的增加而增强， ［ ｐ Ｒ６ 最终达到Ｉ ｌ 的６ ７ ３ ￣ 倍。随后 ￣Ｒ ３ ［ Ｂ ３ 系列 工程菌和Ｂｓｂｌ Ｂ 为亲株 进行原 生质体 融合 ，筛得 重组菌 Ｈ１：ｐ ６ ］ ：Ｒ ． ｔｉ Ｙ １ ｕ ｌ ｓ
．
ｓｒ ｎｄｂ ｒｔ ｌ ｔｕ ｉ ｆ ． ｂｉｓ ＨＩ ：ｐ Ｂ ３ ｄａ ｏ ｅ ｒ ｏ ａ ｉ ｐｏ ｕ ｉ ｔ ｉ Ｂｓｂｉｓ ｃ ｅ ｅ ｙｐｏ ｐａ ｓ ｎｏ ｓ ｔｉ Ｒ ３： Ｒ ６ １ ａ ｔ ｒ ｉ ｆ ｖｎ ｒｄ ｃ ｇｓ ａ ． ｔｉ ｅ ｏ ｓ ｆ ｏ Ｂ ｕ ｌ ［ ｎ ｎ ｈ ｂｌ ｎ ｒ ｎ ｕ ｌ
Ｂｓｂｉｓ Ｈ３ 。该菌在含 １ ％葡萄糖或蔗糖的分批 发酵中培养 ６ 可产 核黄素量４２ｇＬ ． ｔ Ｒ ３ ｕ Ｂ ０ ４ｈ ． －～。采用 以葡萄糖为碳源的流 加发酵工艺，２ 可积累核黄素 ７ ８ｇＬ ４ｈ ￣ ．一，４ ８ｈ达ｌ￣ ２ｇＬ １ －－，核黄素对葡萄糖的得率为００ ６ｇｇ １ ．５ ＇～。 关键词：枯草芽孢杆菌：核黄 素操纵子 ：基 因扩增：原生质体 融合 ；流加发酵 中图分类号：Ｔ ６ ．：Ｑ５ ３２ Ｑ４ ６２ ６ ．；Ｑ８ ３ １． ２ 文献标识码 ：Ａ
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控
实验十甘露聚糖酶基因工程菌发酵调控原理：β-甘露聚糖酶能从底物LBG（Gum，Locus Bean洋槐豆粉）中水解产生还原糖，还原糖的产生量与酶活性成正比，用DNS显色法测定还原糖的含量，从而计算出酶活力。
酶活力单位（U）的定义：在40℃.pH5.0的酶活力测定条件下，1min催化5mg/mlLBG底物溶液生成1ug 还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），其中样品的酶活力以U/g（固体酶）或U/ml（液体酶）表示。
一、菌株及培养基1、菌株毕赤酵母基因工程菌株man。
2一级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
3、二级种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%蛋白胨，pH自然。
4、发酵罐培养基：2%葡萄糖，2.7%玉米浆干粉。
5、补料培养基：50%葡萄糖。
培养基灭菌：葡萄糖与其它培养基分开灭菌，玉米浆干粉121℃灭菌20min，葡萄糖121℃灭菌15min。
发酵过程调节pH：浓氨水二、仪器设备及试剂1、仪器设备电子天枰，高压灭菌锅，5L发酵罐，100L发酵罐，移液枪及枪头（100µL量程和1mL量程），1.5mLEP 管，小型离心机，水浴锅，电热炉，10mL比色管，立式摇床。
2、所需试剂及配制① 1/15 mol/L pH5.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液称取二水磷酸氢二钠11.876g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
称取磷酸二氢钾9.078g，加入蒸馏水溶解，定容至1000mL，混匀。
用以上两种溶液按适当比例混匀得pH5.0的PBS缓冲液。
②氢氧化钠溶液（200g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。
③ DNS试剂称取3.15 g 3,5- 二硝基水杨酸加到500mL单蒸水中，在40℃下水浴。
然后称20g氢氧化钠，溶于100mL 单蒸水中，缓慢将氢氧化钠溶液加到DNS溶液中，一边加入，一边搅拌，直至3,5- 二硝基水杨酸全部溶解。
植酸酶基因工程菌的发酵研究
步的酶学性质研究 ， 其最适温度 、Ｈ、 热性等都能 ｐ 耐 很好的满足生产需要 ， 有很高的应用潜在价值 。在实 验室条件下对植酸酶基 因工程菌 （ 一 ） Ｅ２ 进行发酵研 ２ 究， 为发酵生产作探索性研究。
微量元素及蛋 白质等营养成分 的吸收。植 酸酶广泛 存在于动物 、 植物和微生 物中， 目前实际应用 的植酸
６ ０；ｍｅｈ ｎ ｌ ｐ ｅ ｄ ｄ ａ ｕ ｔ ． ， ｔ ａ ｏ ｐ ｎ ｅ ｍｏ ｎ ：１ ５％ ；ａ ｄ ｆ ｌ ｇ ｌ ｕ ｄ ｖ ｌ ｍｅ ０ ． Ｅ ｔ ｅ ｌ ｌｒ ｐ ｙ ａ ｅ ａ ｃ ｓ １ ６ ７ Ｕ ｍＬ ｗａ ｂ ａ ｎ ｉ ｉ ｉ ｉ ｏｕ ：１ ％ ｌｎ ｑ ｘｒ ｅｌ ａ ｈ ｔｓ ｓ ｍｕ ｈ ａ ６ ４１ ． ／ ｓ ｏ － ａ ｕ ４
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔ ｅ ｆ ｒ ｎ ｉｇ ｐ ｏ ｅ ｓ ｓ ｏ ｈ ｅ ｉ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｓ ａ ｎ Ｅ一 ２ ｆｒｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｐ ｙａ ｅ ｗ ｒ ｔ ｄ ｅ ．Ｔ ｅ ｏ ｔ ｍ ｏ ｄ ｔ ｎ ｒ ｓ ｒ ｃ ： ｈ ｅｍｅ ｔ ｒｃ ｓ ｅ ｆ ｅ ｇ ｎ ｃ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｔ ｉ ２ ｏ ｒｄ ｃ ｎ ｈ ｔｓ ｅ ｅ ｓｕ ｉ ｄ ｎ ｔ ｎ ｒ ｈ ｐｉ ｍｕ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｆ ｉ ｏ ｌ ｕ ｄ ｆｒ ｅ ｔｔ ｎ ｗ ｒ ：ｉｏ ｕ ａｉ ｎ ａ ｅ ｂ ｕ ６ ｈ ｎ ｃ ｌ ｔ ｎ ａ ｕ ｔ １ ％ ；ｍｕ ｔ ｌ ａ ｉｎ ｔ ｉ ｉ ｅ ｑ ｍ ｎ ａｉ ｅ ｅ ｎ ｃ ｌ ｔ ｇ ：ａ ｏ ｔ ３ ；ｉ ｏ ｕ ａｉ ｍｏ ｎ ： ｏ ｏ ｏ ０ ｌｐｉ ｔ ｉ ｉ ｃ ｏ ｍｅ：７ ；ｆ ｒ ｅ ｔ ｔ ｎ ｌ ｕ ｄ ｐ ： ２ｈ ｅ ｍ ｎ ａｉ ｉ ｉ Ｈ ｏ ｑ
工程菌的知识
工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。
研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。
这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。
关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。
要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。
这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。
而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。
对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。
E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。
基因工程菌的发酵控制
基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。
从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。
1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。
为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。
但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。
此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。
常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。
使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。
2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。
带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。
此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。
由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。
质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。
前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。
为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
课后习题
1、影响质粒稳定性的因素有哪些？ 2、在工业生产中如何提高质粒稳定性，提高外源基因的 表达量？ 3、基因工程菌的培养与常规菌种的培养工艺有何不同？ 4、如何对基因工程菌的生产工厂防护？
EndThanks!Fra bibliotek生物工艺学
提高质粒稳定性的措施
（1）选择合适的宿主菌和合适的载体 （2）选择适宜的培养方式 （3）控制合适的发酵培养基和适宜的培养条件 （4）固定化技术
生物工艺学 第二节 基因工程菌的培养工艺 培养基的组成与培养条件 碳源 氮源 无机盐 生长因子 营养缺陷型互补标记和抗生素选择标记的相应成分 接种量
生物工艺学
院 系： 生物医药系 教研室： 生物工程
北 京
联
合
大
学
生
物
化
学
工
程
学
院
生物工艺学
第七章 基因工程菌的发酵生产
生物工艺学
上章重点
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
发酵过程中的代谢变化与控制参数 温度对发酵的影响及控制 PH值对发酵的影响及其控制 溶解氧对发酵的影响及其控制 菌体浓度与基质对发酵的影响及其控制 CO2和呼吸商 泡沫对发酵的影响及其控制 发酵终点的判断
基因重组菌外漏的防范 （1）接种 （2）机械密封 （3）取样 （4）排气 （5）排液 基因工程产物的提取
生物工艺学
本章重点
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
8.
9. 10. 11.
12.
基因工程菌的定义 基因工程菌特点 基因工程菌质粒的不稳定 影响质粒稳定性的因素 提高质粒稳定性的措施 基因工程菌培养基的组成与培养条件 基因工程菌发酵的工艺过程 质粒稳定性的分析 实现高密度发酵的方法 基因工程菌发酵过程的检测与控制 基因重组菌外漏的防范 基因工程产物的提取
大肠杆菌基因工程菌株的构建及发酵试验
图 2 OD600 值随时间的变化趋势
图 3 pH 值随时间的变化趋势
4/8
2012 生工大实验
图 3 pO2 值随时间的变化趋势
3.4 GFP 离子交换层析分离
在洗脱过程中先用 Buffer A 洗，没有荧光洗脱。Buffer B 梯度洗脱至 17 管的开始出峰但未见荧光。至 20 管时可见荧光，第 21 管时荧光最强。
水+感受态大肠杆菌 LB 平板培养基 LB+Amp 平板培养基 LB+Amp+ara 平板培养基 5000 个 99 个 776 个
pGLO+感受态大肠杆菌 5000 个 5000 个 1616 个
注；其中 LB 平板培养基菌落过于密集无法计数按 5000 计，pGLO+感受态大肠杆菌接种于 LB+Amp 平板培养基涂布不均菌落
280/260 7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40 2 0.038 0.038 0.03 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
表 5 对照标准比值
0.15M 甲酸 0.189 0.226 0.081 0.032 0.836 0.358 0.142 840
0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠 0.134 0.164 0.059 0.016 0.817 0.360 0.098 900
0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠 0.172 0.174 0.098 0.034 0.989 0.563 0.195 720
pH 6.22 6.21 6.32 6.38 6.20 5.80 5.55
基因工程菌的发酵
基因工程菌的稳定性
影响基因工程菌稳定性的因素
载体的选择
遗传特性
宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体上
发酵工艺
培养基 生长速率 限制性基质 程菌的稳定性
提高基因工程菌稳定性的策略
改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括：
将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止 DNA 片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因 （DNA 单链结合蛋白编码基因）
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
培养基
一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培 养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质， 微生物的生长较在基本培养基中快。
培养条件对基因工程菌稳定性的影响
比生长速率
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。提高比生长速 率有助于提高质粒稳定性。
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
控制培养条件 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而采用 间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改善质粒 的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都可提高质 粒的稳定性。 例如研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长 速率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大.
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
GL-7ACA酰化酶基因工程菌(E.coliBL21(DE3)pYW—GA)发酵工艺的优化
Ｏｐ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｒ ｅ ｔ ｔｏ ｃ ｓ ｏ ｔｍ ｚ ｔｏ ｆ Ｆｅ ｍ ｎ ａ ｉ ｎ Ｐｏ ｅ ｓ ｆ ｒ ＧＬ－ ＡＣＡ ｙ ａ ｅ ７ Ａｃ ｌ ｓ
杨 志平 ， 筱 兰 ， 兵 兵 王 孙
（ 南昌大学 生命 科学学院 ， 江西 南昌 ３ ０ ３ ） ３ ０ １
摘 要 ： 索 － ￣ 成 型 重 组 大 肠 杆 菌 Ｅ ｃｌ Ｌ １ Ｄ ３ ｐ Ｗ—Ａ 高 效 表 达 Ｇ －Ａ Ａ酰 化 酶 （ Ｃ ３ １５ １ ） 探 ｒ－ ｉ ｉ ．ｏｉ ２ （ Ｅ ） Ｙ Ｇ Ｂ Ｌ７ Ｃ Ｅ ． ． ． ．１ 的发
酵工艺． 在摇瓶 培养获得 Ｇ －Ａ Ａ酰化酶工程菌 的最佳发酵条件 的基础上 ， ５ Ｌ７ Ｃ 用 Ｌ自控发 酵罐进行 分批补料 培养 ， 为减少细菌代谢过程 中有 害的物质 （ 主要是 乙酸 ） 的产生及酶的高效表达 ， 发酵过程 中采用不 同的流加方 式进行补 料， 同时对 转速和溶 氧等进行控制． 考察 了恒速流加 、Ｈ反馈流加和指数流加 几种补料模 式 ， ｐ 比较得 出菌浓最高 的 是 ｐ ８０反馈流 加这一模 式 ， Ｄ 可达 ３ ， Ｈ． ０ ５ 而酶活 最高的模式是 ｐ ７ ０反馈流加 ， Ｈ． 最高酶 活可达 ３４ ３ ８Ｕ Ｌ 大 ６ ． ／ ． 肠杆菌 Ｅ ｌ Ｌ １ Ｄ ３ ｐ Ｗ． Ａ高效 表达 Ｇ －Ａ Ａ酰化酶 的发酵工艺 的建立为工 业化生产 Ｇ －Ａ Ａ酰化酶和 ｃ ｉ ２ （ Ｅ ）Ｙ Ｇ ｏＢ Ｌ７ Ｃ Ｌ７ Ｃ 头孢类抗生素提供 了基础 ． 关键词 ：Ｌ７ Ｃ Ｇ －Ａ Ａ酰化 酶 ； 因工程菌 ； 基 补料分批发酵 ； 高效表达