2007面包酵母基因工程菌

酵母菌生长曲线的测定及其转葡萄芪合酶基因重组菌遗传稳定性的检测

郭春叶1,龚月生1*,刘林丽2,曹雨莉1

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;2.西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100)

摘要采用分光光度计比浊法测定酿酒酵母INVSc1的生长曲线,确定菌体生长规律;并以此为依据,制备酿酒酵母感受态细胞,进行葡

萄芪合酶基因酿酒酵母重组质粒的转化;采用菌落PCR法快速鉴定阳性重组子,并进一步检测重组质粒在重组菌中的稳定性。结果表

明,于酵母菌对数生长中期(OD600为0.8时)进行重组质粒的转化,可以得到较高的转化效率;在0～72h发酵培养过程中重组质粒在宿

主菌中的稳定性达到100%。这为后续工作开展葡萄芪合酶基因在酿酒酵母中的诱导表达研究奠定了技术基础。

关键词酿酒酵母;生长曲线;稳定性;芪合酶

中图分类号 Q933 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)07-01909-02

MeasurementofYeastGrowthCurveandGeneticStabilityExaminationofRecombinantYeastTransferredGrapeStilbeneSynthase(STS)

GUOChun-yeetal (CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100)

Abstract YeastgrowingrulewasconfirmedbymeasuringthegrowthcurveofINVSc1byspectro-photometerturbidity.Accordingtothisgrowingcurve,

yeastcompetentcellsweremadeupandweretransformedbytheyeastrecombinantplasmidcontainingstilbenesynthasegenederivedfromgrape.Theposi-

国内生物分子学技术应用于酿酒酵母的研究进展

杨国华;马光喜

【摘要】Saccharomy ces cerevisiae is widely used in human society, such

as the production of bread, steamed bun, and alcohol beverages.

Saccharomyces cerevisiae also plays an important role in the production of

fuel ethanol as a renewable resource. Developing rapidly in recent years,

molecular biology and genetic engineering technologies have been widely

applied to the research on microorganisms. PCR techniques, genetic

recombination, protoplast technology, etc. have contributed to the

progress in the screening and identification of microbes, the adjustment of

metabolite production, and the construction of genetically engineered

bacteria. In this paper, we elaborated domestic research progress in recent

years in the application of molecular biology technology to the

improvement of Saccharomyces cerevisiae.%酿酒酵母的运用已广泛存在于人类社会的方方面面。相比于将其作为面包、馒头、酒类产品的发酵菌株，现今的酿酒酵母更是人类用以开发可再生资源而得到燃料乙醇的重要手段。分子生物学与遗传工程技术作为近代迅速发展起来的新兴学科，已大量应用于微生物的研究，如PCR技术、基因重组、原生质体技术等等，在微生物的鉴定筛选、调节产物的生产、基因工程菌的构建等方面发挥了推动作用。以酿酒酵母为参考对象，阐述了国内近年来运用分子生物学技术改造酿酒酵母的研究报道。

耐高糖面包酵母单倍体的分离筛选

封冰;张翠英;肖冬光

【摘要】Spore-producing culture of baker's yeast BY-6 with high sugar

tolerance was carried out to obtain its haploids. 6 strains of type alpha

haploid and 5 strains of type a haploid were separated and identified by

matching and PCR authentication. Compared with the parental strain, a-70

strain andα-24 strain were obtained based on their excellent performance

in biomass, growth curve, fermentation ability in high-sugar dough, and

gas production in the simulation of high-sugar dough. This study laid a

good foundation for genetic breeding of baker's yeast with high sugar

toler-ance in the future.%以耐高糖面包酵母BY-6为出发菌株进行生孢培养制备单倍体，通过单倍体的分离、配型验证和PCR验证，获得6株α型单倍体，5株a型单倍体。通过比较单倍体菌株的生长和发酵性能，筛选出生长性能较好，在高糖模拟面团中产气量较大，并且在高糖面团中发酵力较高的优良单倍体菌株70a和24α，这为后续通过基因工程改造提高面包酵母的高糖耐性奠定了良好的基础。

【期刊名称】《酿酒科技》

工程菌的知识

基因工程大肠杆菌发酵的研究

摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。

关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗

作者：巫爱珍. 孙玉昆.

刊名：生物工程学报

讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。

对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。

E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。

植酸酶基因工程菌的发酵研究

第３５卷第３期　２００６年７月　发酵科技通讯　

植酸酶基因工程菌的发酵研究　

何锡杲李健彭远义　（西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室重庆４００７１６）　

摘要：本文对植酸酶基因工程菌（Ｅ一２２）发酵产植酸酶条件作了初步研究，对接种量、接种龄、甲醇　添加量、诱导发酵ｐＨ、表面活性剂、抗生素等进行了研究与分析。　关键词：植酸酶发酵植酸酶基因工程菌　

植酸酶（Ｐｈｙｔａｓｅ）是一种新型食品与饲料添加　剂，它能催化植酸（盐）水解为肌醇及无机磷酸，促　进微量元素及蛋白质等营养成分的吸收。植酸酶　广泛存在于动物、植物和微生物中，目前实际应　用的植酸酶主要来源于微生物。植酸酶在天然菌　株中的产量很低，目前用于植酸酶生产的菌株均　为单位表达量已较天然菌株大幅度提高的基因　工程菌。本实验室通过基因工程技术获得一株以　毕赤酵母为载体的植酸酶基因工程菌Ｅ一２２ｔ”。本　工程菌与报道的植酸酶工程菌相比产酶量高，在　摇床上诱导发酵，可达十四万多单位酶活且菌株　有很好的遗传稳定性。经初步的酶学性质研究，　其温度、ｐＨ、耐热性等都能很好的满足生产需要，　很有应用潜在价值。本文在实验室条件下对植酸　酶基因工程菌（Ｅ一２２）进行发酵研究，为发酵生产　作探索性研究。　１材料与方法　１．１供试菌株植酸酶基因工程菌Ｅ一２２，为本实　验室构建　１．２培养基及试剂配制　ＹＰＤ培养基：１％酵母提取物；２％蛋白胨；２％　葡萄糖；１．５％琼脂　ＹＰＤ种子液：１％酵母提取物；２％蛋白胨；２％　葡萄糖　增殖培养基：酵母提取物１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ，　Ｌ，酵母氮源（ＹＮＢ）１３．４ｇ／Ｌ，生物素４ｘ１０－４ｇ／Ｌ，甘油　１０ｍＬ／Ｌ，０．１Ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ６．０　诱导培养基：酵母提取物１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／　Ｌ，酵母氮源（ＹＮＢ）１３．４ｇ／Ｌ，生物素４ｘｌ０－４ｇ／Ｌ，甲　醇１０ｍＬ／Ｌ，０．１Ｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｐＨ６．０　１ＭｐＨ６．０磷酸钾缓冲液１Ｌ：１３２ｍＬ　１Ｍ　Ｋ２ＨＰ０　与８６８ｍＬ　１Ｍ　ＫＨ２Ｐ０４混合（上述培养基　中除酵母氮源（ＹＮＢ）、甲醇、生物素需过滤除菌，　葡萄糖需在１０８ｏＣ灭菌３０ｍｉｎ外，其余均在１２１ｏＣ　灭菌２０ｍｉｎ）　１．３分析方法　１．３．１　ｐＨ检测：ｐＨ检测仪　１．３．２细胞光密度（ＯＤ）分析：发酵液稀释后于波长　６００ｎｍ处以蒸馏水为对照比色测定。　ＯＤａｘｒ：ＯＤ读数×稀释倍数。　１．３．３植酸酶酶活检测　参照张若寒［２１（１９９７）的钒钼酸铵法略加改动　进行测定：向每支干净的１０ｍｌ离心管中加ｌｍＬ　经适当稀释的发酵液，然后再加２ｍ１０．００７６ｍｏｌ／Ｌ　植酸钠溶液（对照加入２ｍｌ颜色／终点混合液），将　离心管放人３７℃的恒温水浴中，反应６０ｍｉｎ，向每　支离心管中加入２ｍｌ颜色／终点混合液（对照加入　２ｍ１０．００７６ｍｏｌ／Ｌ植酸钠溶液），（在分光光度计上　测ＯＤ　。　值。与标准磷曲线比较，可知释放出的　无机磷量（ｕｍｏｌ／ｍＬ），从而算出其酶活。　酶活力单位（Ｕ）定义：在３７℃、最适ｐＨ条件　下，１ｍｉｎ从０．００５ｌｍｏｌ／Ｌ的植酸钠溶液中释放　１ｎｍｏｌ无机磷所需的酶量为一个酶活单位。　１．４植酸酶基因工程菌摇瓶发酵产酶条件的研究　种子活化与种子液的制备：将实验室保存的　植酸酶基因工程菌Ｅ一２２划线于ＹＰＤ培养基平　板上，２８￣３０￣Ｃ温箱中培养，直至长出单菌落。将　ＹＰＤ平板上Ｅ一２２单菌落无菌操作接种于灭菌好　的ＹＰＤ种子培养液中，２８￣３０￣Ｃ，２００ｒ／ｍｉｍ摇床　

工程菌的遗传改造技术

近年来，随着科技的不断发展，生物领域也迎来了新的变革。遗传改造技术成为了获得各类生物信息的关键途径之一。而工程菌的遗传改造技术更是被广泛应用于各种领域，包括医疗、农业和生物制药等。本文将从工程菌的基本原理、遗传改造方法和应用前景等方面深入探讨。

一、工程菌的基本原理

工程菌是一种被改造的微生物菌株，是利用转化或转染等技术将外源基因引入到菌体内，并并使其表达出目标蛋白质的特定菌株。工程菌的修改来源于菌体的自然突变，通过改变其基因，使其具有更强的产物表达能力。不同于常见的脊椎动物细胞的DNA重组技术，工程菌的领域涉及到简单、稳定而且精准的基因操作。

目前，许多工程菌都是由大肠杆菌（Escherichia coli）和酵母菌集团（Saccharomyces cerevisiae）构成的。这些菌株具有良好的代谢倍增速度和易于生长和扩增的特点。它们的遗传信息被广泛研究，且其草图图谱已经非常完整。

二、工程菌的遗传改造方法

工程菌的遗传改造技术主要可分为两类，基于重组DNA的方法和基于自然突变的方法。前者主要包括设备基因克隆、植入基因工具和酶催化等，而后者主要通过自然变异、重复剪接和基因底物特异性等因素来进行改造。

1. 基于重组DNA的方法

设备基因克隆是工程菌遗传改造的核心技术之一，它包括扩增、切割和拼接DNA序列，从而构建目标基因的操作。可以通过PCR技术从生物体中摘取特定的DNA序列，然后通过DNA酶将其切割成数个片段。然后，它们将通过序列配对进行大规模拼接，再放入工程菌中，以供表达目标生物产物。

2. 基于自然突变的方法

自然突变是一种无需任何人为干预的生物学现象。基于自然突变的遗传改造技术常常被用于产生新的突变株，以探索生物体的潜在适应能力。重复剪接和基因底物特异性是两类主要的自然突变机制之一。前者是指同一基因产生的不同表达形式，在真核生物的剪接中至关重要。后者是指基因在参与特定生化反应中发生自主控制的过程，从而达到具有特定形态和功能的产品。

利用重组酵母菌生产人胰岛素

摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。

关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定

Using recombinant yeast to produce human insulin

HuSheng 1142043040

Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as

follow:get purpose gene→construct the recombinant plasmid→construct the genetic

engineering bacteria→fermentation of engineering bacterium→separation and

purification of the product→identification of the product. The front three processes is

building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized

基因工程在农产品加工中的应用

行业综述朦　

基因工程在农产品加工中的应用　

◎杨淑芳　（天津市农业信息中心，天津３００２０１）　摘　要：该文阐述了基因工程的技术溯源，论述了基因工程在农产品加工方面的应用，提　出了与生产实践相结合的实例；展望了基因工程技术在农产品加工领域中的美好发展前景。　关键词：基因工程；农产品加工；转基因食品　

１基因工程的技术溯源　＋　０　０　’　基因工程就是采用类似工程技术的方法，将不　『刮生物或人工合成的ＤＮＡ，按照设计方案重新组　合，并在特定的受体细胞中与载体一起得到复制与　表达。基因工程主要包括两个步骤：首先是从某些　生物细胞中取得所需要的ＤＮＡ片段，或在人工控制　下合成这种ＤＮＡ片段，即获得目的基因，再取得基　因的载体，使二者进行体外重组；然后将重组的　ＤＮＡ转ｆｉｂｒｉｌ受体的活细胞中去，改变受体细胞的遗　传特性。基因工程包括ＤＮＡ重组、表达和克隆，是　生物工程核心内容。　－　－　；≯≯０　０　２０世纪５０年代初，由于分子生物学和生物化学　的发展，对生物细胞核中存　在的脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）结　构和功能有了比较清晰的阐　述。７０年代初实现了ＤＮＡ重　组技术或称为克隆技术，逐　步形成了以基因工程为核心　内容，包括细胞工程、酶工　程、发酵工程的生物技术。　这一技术发展到今天，正形　成产业化并列为世界领先专　前景。ｌ９７３年美国斯坦福大学和旧金山大学医学院　Ｃｏ—ｋｅｎ和Ｂｏｙｅｒ两位科学家成功地实现了ＤＮＡ分子　重组试验，揭开了基因工程发展序幕。１９８２年转基　因“超级鼠”的构建成功，１９８５年转基因鱼的问世，　标志基因工程在农产品加工应用的开端，基因工程　食品由此走上了历史舞台。　２基因工程在农产品加工中的应用　硅剐利万西的应用　酶的传统来源是动物脏器和植物种子，后来随　着发酵工程的发展，逐渐出现了以微生物为主要酶　源的格局。近年来，由于基因工程技术的发展，更　使我们可以按照需要来定向改造酶，甚至创造出自　然界从未发现的新酶种。现在，蛋白酶、淀粉酶、　脂肪酶、糖化酶和植物酶等均可利用基因工程技术　进行生产（如表ｌ所示）。　表１　应用于食品工业的酶制剂　酶　用途　蛋白酶　乳酪生产，啤酒去浊，浓缩鱼胨，制酱油，制蛋白胨　脂肪酶　鱼片脱脂，毛皮脱脂等　淀粉酶　麦芽糖生产，醇生产等　纤维素酶和半纤维素酶　用于乙醇生产，植物抽提物的澄清和将纤维素转化为糖　糖化酶　酶法制糖　果胶酶　用于葡萄酒和果汁的澄清及减少其黏度　植酸酶　可将饲料中的植酸盐降解成无机磷类物质　葡萄糖异构酶　制造高果糖浆　业技术领域之一，广泛应用于食品、医药、化工、　农业、环保、能源和国防等许多部门，并日益显示　出其巨大的潜力，将为世界面临的蛋白质缺乏、能　源、环保和癌症治疗等问题的解决提供广阔的应用　：０　０　；　２．２．１转基因植物源食品　转基因植物可被改革而具有抗病虫害的能力，　

简述基因工程菌的培养方式

基因工程菌是指通过基因工程技术将目标基因导入到细菌中，使其表达目标蛋白或产生目标物质的菌株。基因工程菌的培养是进行基因工程研究和应用的重要环节之一。下面将从菌株的选择、培养基的配制、培养条件的控制等方面简述基因工程菌的培养方式。

一、菌株的选择

菌株的选择是基因工程菌培养的第一步。常用的基因工程菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等。选择菌株时需要考虑其生长速度、基因导入效率、表达目标蛋白的能力等因素。一般情况下，大肠杆菌是最常用的基因工程菌株，因为其生长速度快、易于培养和转化。

二、培养基的配制

培养基是基因工程菌培养的基础，其组成要能满足菌株生长和表达目标蛋白的需要。一般的培养基包括基础培养基和选择性培养基。基础培养基是提供菌株生长所需的营养物质，如碳源、氮源、矿物质等。选择性培养基则是通过添加特定的抗生素或抗性基因使得只有带有目标基因的菌株能够生长和繁殖。培养基的配制需要根据具体实验的需要和菌株的特性进行调整。

三、培养条件的控制

培养条件的控制对于基因工程菌的培养至关重要。其中包括温度、pH值、气体环境、培养时间等因素的控制。一般情况下，基因工程菌株的适宜生长温度为37℃，pH值为6.5-7.5。气体环境方面，大肠杆菌一般需要在含氧的条件下培养，而酵母菌则需要在缺氧条件下培养。此外，培养时间也需要根据菌株的生长速度和目标蛋白的表达时间进行调整。

四、培养方式的选择

基因工程菌的培养方式主要包括液体培养和固体培养两种。液体培养适用于大规模培养和蛋白表达，可以通过摇瓶培养或发酵罐培养进行。固体培养适用于筛选和分离菌株，常用的固体培养基有琼脂和琼脂糖。同时，还可以根据实验需要选择特定的培养方式，如表达载体的选择、诱导剂的添加等。

五、培养监测和收获

在培养过程中，需要定期监测菌株的生长情况和目标蛋白的表达情况。常用的监测手段包括测定菌液的光密度(OD值)、蛋白含量的测定、酶活性的检测等。当菌株达到适宜的生长阶段和目标蛋白表达达到最高水平时，可以进行收获和提取目标蛋白或物质的操作。

面包酵母基因工程菌

２００７年８月　

第８期（总第１０５期）　广西轻工业　

ＧＵＡＮＧＸＩ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＬＩＧＨＴ　ＩＮＤＵＳＴＲＹ　食品与生物　

面包酵母基因工程茵　

赵慧　

（华南农业大学资源环境学院，广东广州５ｌ　０６４０）　

【摘　要】　随着重组ＤＮＡ技术的发展，酵母在其发酵的形式、原料成份及工艺流程等方面都发生了极大的变化。新的基因　

工程酵母茵具有提高ＣＯ　的产速率，增强对外界环境压力的抵抗力，并且还能够产生新的蛋白和其它代谢物来改进面包等的风　

味．延长酵母的保存期限。　

【关键词】　面包酵母；基因工程；发酵；酶工程修饰　

【中图分类号】Ｑ８１９　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００３—２６７３（２００７）０８—０００５—０２　

酵母具有发酵面团的特性，它能产生ＣＯ　使面包保持蜂窝　结构，同时还赋予面包特殊的风味，因此很早就为人们所利用。　

产气速率在酵母的发酵过程中是极为重要的，它不仅与面团的　

成份有关，还与面包酵母的内在性质密切相关。为了适应冷冻技　

术在面包发酵方面的应用，须使酵母在冷冻后仍保持较快的生　长速率和较强的发酵能力。而大量资料表明，通过基因工程技术　

构建酵母基因工程菌，不仅可以改善面包酵母内在的发酵特性，　

如产气速率、发酵速度、发酵能力等，还可以提高发酵产品质量，　扩大原料利用范围等。　

１面包酵母的工程生产　

酵母生产，一般采用糖蜜或其它碳源培养基培养细胞并能　

获得较高的菌体浓度，但如果利用基因技术，则会给酵母的工程　生产带来新的突破。　

例如乳清是奶酪业的一种无用副产品，主要成份是乳糖，其　

降解过程需要消耗大量的氧，因此对环境存在潜在污染。面包酵　母由于缺乏Ｂ一半乳糖苷酶和乳糖透性酶，不能利用乳清。但　

乳清可以被Ｋ．１ａｅｔｉｓ和Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ所利用，将Ｋ．１ａｅｔｉｓ中分别　表达Ｂ一半乳糖苷酶和乳糖透性酶的ＬＡＣ４和ＬＡＣ１２基因或　

Ｅ．ｅｏｌｉ（或Ａ．ｎｉｇｅｒ）的Ｂ一半乳糖苷酶基因构建至酿酒酵母，就　