发酵——基因工程菌

•翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故 目的蛋白质N端常多一个甲硫氨酸残基， 引起免疫反应。
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真核基因在大肠杆菌中的表达方式 （1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋
白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。 优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高 效表达；但只能做抗原。 不做人体注射用药。
（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被 蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。 （3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到 原核蛋白信号肽序列的下游。
G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，最普遍选用大肠 杆菌作为宿主。
优点：
•人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得 比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操 作；
•大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细 胞浓度（50g/l）；
•大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
只能简单糖基化。 当产生的外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译 后修饰时，要用动物细胞组织培养来达到。
丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加 工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等 真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全 菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。
影响目的基因在酵母菌中表达的因素 （1）外源基因拷贝数：高度稳定、高拷贝 （2）外源基因的表达效率：启动子 （3）外源蛋白的糖基化： （4）宿主菌珠的影响：菌体生长力强；菌体
分离丢失示意图
2、质粒结构不稳定性
指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺 失所致工程菌性能的改变。如果质粒发生 突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合 成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有 抗生素的培养基中生长。而且由于不合成 外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快， 使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占 统治地位，这种培养情况就是结构不稳定 性。
第八章 一、概述
基因工程菌培养
基因工程菌生产的产品主要有二类，蛋白 质和非蛋白质。
基因操作：
•敲除或插入基因片段、增强 启动子— —代谢工程
•基因插入载体，转化工程菌
细胞因子、疫苗、酶
二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统 要求：翻译后的修饰要简单
如果用于食品要考虑宿主菌要求安全， 列入FDA表中 常用的宿主系统有：大肠杆菌
大肠杆菌作为宿主的主要问题是
•大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细 胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水 解或形成不溶的包含体。包含体蛋白是不 折叠的，必须重新溶解并使它复性。
•大量的外源蛋白会触发热冲击响应。增加 蛋白水解酶的活性。此时，蛋白水解酶使 蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。
（一）基因工程菌带有外源基因，外源基 因可能在质粒上也可能整合到染色体上， 这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌 往往比未丢失质粒的菌生长快得多，这样 就会大大降低产物的表达。为了抑制基因 丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择 压力，如抗生素。
（二）基因工程菌的培养一般分两段。前 期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱 导因子，诱发产物表达。
指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代 菌的现象。 为什么会出现质粒丢失呢？ 质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷 贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代 细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少 遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质 粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可 能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。 虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百 万细胞分裂中一个）。
3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。 这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标 蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启 动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细 胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白 的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子， 通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷 透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的 结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的 表达。
三类主要基因工程表达体系的比较
表达体系 产物 产生部位 培养方式 产物活性 浅在危险
大肠杆菌 多肽、蛋白 菌内 融合蛋白
部分可高产
对原核好 不大
酵 母 多肽、蛋白 菌内 可高产 真核接近 不大 糖基化蛋白 胞外 天然
动物细胞 完整 胞外
几乎可为 可能有
糖基化蛋白
可高产 天然产物 致癌因素
三、利用基因工程菌生产的特点
（三）基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但 是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损 害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白 的能力的细胞一般生长得快得多，从而能 替代有生产能力的菌株，这就导致基因的 不稳定性。 基因的不稳定性原因： •分离丢失 •结构不稳定性 •宿主细胞调节突变
1、分离丢失
内源蛋白酶要弱；菌株性能稳定；分泌能力强。
4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排 列，而且所有转译后处理（修饰）与在整 个动物中相同，在某种情况下可能转译后 修饰有些不同，但它可提供最接近于天然 副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞 外。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵， 蛋白表达水平较低。用于重组DNA 生产蛋 白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢 细胞）。
在大的反应器中含有非常多的细胞，总会 存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每 毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞， 那么在这个反应器中就含有109个无质粒 细胞。
质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如 溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀 释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒 附着在一起形成一个单位。
2、G+细菌
枯草杆菌是G+菌，没有外膜，能把蛋白分 泌（excretion）到胞外。不能使蛋白质糖 基化
缺陷:枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快 降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠 杆菌困难，质粒稳定性也比较差
其他: 链霉菌：不致病、使用安全，分泌能力强，
可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基 化能力，可做理想的受体菌。
3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物 现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等 优点 •生长快 最大生长速率是大肠杆菌的25% •个体大 酵母比最大的细菌大，容易从发酵 液中回收。不产内毒素 •有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。 缺点 酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难， 外源蛋白分泌到胞外也有限。